Development of PCR-based markers fo

Development of PCR-based markers for the identification
of the
S
-
RNase
alleles in wild potato species
Olga Marcellan
´
•
Alberto Acevedo
Received: 14 November 2011 / Accepted: 19 April 2012 / Published online: 10 May 2012
_
Springer Science+Business Media B.V. 2012
Abstract
Sexual self-incompatibility in wild diploid
potato species is controlled by a single multiallelic

S
-locus encoding a polymorphic stylar ribonuclease
(
S
-
RNase
)
that is responsible for the female function in
pollen–pistil recognition. In this study, an approach
using PCR-based markers were originally developed
to amplify the
S
-
RNase
alleles in
Solanum chacoense
.
Subsequently, to investigate their general applicability
in
Solanum
, this molecular approach was successfully
tested on
S.
spegazzinii
and
S.
kurtzianum
.
Application
of PCR-SSCP approach revealed potentially new
S
-
RNase
alleles in the three species, demonstrating
for the first time the existence of
S
-
RNase
genetic
variability within and between populations of wild
diploid potato species. Species-specific SSCP markers
that may be successfully used in gene flow studies was
also detected in this investigation.
Keywords
Gametophytic self-incompatibility
_
S
-
RNase
alleles
_
PCR-SSCP
_
Solanum chacoense
_
S.
spegazzinii
_
S. kurtzianum
Introduction
The introgression of wild potato germplasm into the
cultivated species (
Solanum tuberosum
L
.
ssp.
tubero-
sum
)
is one of the main objectives of potato breeding
programs because the wild species are important
reservoirs of genetic variability and sources of resis-
tance to adverse biotic and abiotic factors. Most of
these species are cross fertilizing diploids due to self-
incompatibility (SI). SI allows the pistil of a flower to
distinguish between genetically related (self) and
unrelated (non-self) pollen. This recognition results
in inhibition of growth of self-pollen tubes in the upper
part of the style. Thus, SI is a prezygotic reproductive
barrier
by
which
incompatible
pollen
tubes
are
prevented from delivering the sperm cells to the ovary
in order to achieve double fertilization (Kao and
Tsukamoto 2004).
The
Solanaceae,
Rosaceae
and
Plantaginaceae
families
exhibit
gametophytic
self-incompatibility
system controlled by a single
S
-locus with multiple
S
-haplotype. Each
S
-haplotype carries two genetically
linked
genes,
Stylar
ribonuclease
(
S
-
RNase
)
and
S
-
locus F
-
box
or
S
-
haplotype
-
specific F
-
box protein
,
O.
Marcellan(
´
&
)
Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de
Mar del Plata, C.C. 276, 7620 Balcarce,
Buenos Aires, Argentina
e-mail: [e-mail]
A.
Acevedo
Centro de Investigacion de Recursos Naturales, Instituto
´
Nacional de Tecnologıa Agropecuaria (INTA Castelar),
´
De los Reseros y Las Caban˜as s/n, 1686 Hurlingham,
Buenos Aires, Argentina
123
Euphytica (2012) 187:19–29
DOI 10.1007/s10681-012-0703-3



controlling the female and male specificities, respec-
tively (Lai et al. 2002; Takayama and Isogai 2005; Rea
and Nasrallah 2008). The
S
-
RNase
gene has five
highly conserved regions (C1–C5) and one hypervari-
able region (with two domains, HVa and HVb, in the
Solanaceae and one in the Rosaceae) located between
C2 and C3. This gene encodes an allelic series of stylar
glycoproteins (
S
-
RNases
)
with ribonuclease activity
expressed in the extracellular matrix of the pistil.
S
-
RNases
presumably exert their cytotoxic action
inside the incompatible pollen tubes by degrading
pollen tube RNA in an
S
-haplotype-specific manner.
As
S
-
RNases
have been shown to enter pollen tubes in
S
-haplotype-independent manner, the SI mechanism
must involve the ability of pollen tubes to inactivate
any non-self
S
-
RNase
, whereas self
S
-
RNases
are
somehow protected from inactivation (Liu et al. 2009).
Two non-mutually exclusive approaches have been
used to estimate the diversity of the
S
-
RNase
gene in
different species. On one hand, the classical approach
has been focused on the usage of controlled crosses
and subsequent evaluation of the reaction pollen–pistil
compatibility by fluorescence microscopy (Camadro
and Peloquin 1981; Marcellan and Camadro 1996;
´
Camadro et al. 1997). On the other hand, the molecular
approach has been addressed with the application of
different methodologies that are based on: (1) detec-
tion of
S
-glycoproteins by Western blot (Hinata and
Nishio
1981
; Nou
et
al.
1991
),
two-dimensional
electrophoresis (Kirch et al. 1989; Sassa et al. 1994;
Tao et al. 1999) or isoelectric focusing (Eijlander et al.
2000
),
(2)
cDNA analysis by Southern blot using as
probe the cDNA of
S
-
RNase
already known (Nasrallah
et al. 1985; Gebhardt et al. 1991; Tao et al. 1999), (3)
RNA analysis by RT-PCR (Oldknow and Trick 1995;
Richman et al. 1996; Kurup et al. 1998; Igic et al.
2007
; Savage and Miller 2006; Miller and Kostyun
2010
)
or Northern blot (Kirch et al. 1989; Tao et al.
1999
; Xu et al. 1990), and (4) identification of
S
-
RNase
alleles by amplification of genomic DNA
with primers designed on the basis of the conserved
regions of the gene (Ishimizu et al. 1999 and others
will add later). Because the latter method is simple and
allows the assay of seedlings instead of waiting until
flowering plant developmental stage, it was used in
this study.
During the last few years, intense efforts have been
launched for the molecular cloning and characteriza-
tion of
S
-
RNase
genes in several Rosaceae fruit
species including apple (Sassa et al. 1994; Brootha-
erts et al. 1995), almond (Tao et al. 1997), sweet
cherry (Tao et al. 1999; Sonneveld et al. 2003), and
European pear (Zuccherelli et al. 2002; Sanzol et al.
2006
)
among others. Regarding the Solanaceae, the
first sequence of
S
-
RNase
was deduced from the
cloning and sequencing of the corresponding cDNA
in
Nicotiana alata
(Anderson et al. 1986). Particu-
larly in potato, four
S
-
RNase
alleles have been cloned
and
identified
in
the
tetraploid
cultivated
potato
S.
tuberosum
spp.
tuberosum
(St):
S1
,
S2
,
S3
, and
S4
.
Kaufmann et al. (1991) reported the amino acid
sequence
of
S1
,
whereas
the
partial
genomic
sequence of
S2
is available in the DDBJ/EMBL/
GenBank databases under the accession No. X62727.
Since the amino acid sequences of
S3
and
S4
reported
by Kirch et al. (1989) were very partial and repre-
sented only the conserved region 2, they were not
included in this study. As for the diploid wild potato
species,
Solanum
chacoense
Bitt.
(Sc),
seven
S
-
RNase
alleles have been cloned and identified:
S2
,
S3
,
S11
,
S12
,
S13, S14,
and
S16
(DDBJ/EMBL/GenBank
X56896,
X56897,
S69589,
AF1911732,
L36667,
AF232304, and DQ007316, respectively). All these
S
-
RNase
alleles, with the exception of
S16
, were
isolated
and characterized on the basis of RNA
isolation and subsequent RT-PCR or Northern blot
analysis. The
S16
-
RNase
allele was identified in an
Argentinean
S.
chacoense
population by our group
using primers designed on the basis of the first and
fourth conserved regions (Marcellan et al. 2006).
´
Unfortunately, PCR analysis performed using this
pair of primers was unable to amplify other
S
-
RNases
alleles in
S.
chacoense
.
Currently, no information concerning the allelic
diversity of the
S
-
RNase
gene is available in potato,
even though the
S2, S11, S12, and S13
alleles of
S.
chacoense
and the
S2
allele of
S.
tuberosum
have
been included in
S
-
RNase
gene diversity studies in
other Solanaceae species (Savage and Miller 2006;
Igic et al. 2007; Miller and Kostyun 2010).
In this investigation a molecular approach using
PCR-based
markers
was
originally
developed
to
identify
S
-
RNase
alleles other than
S16
in
S.
chaco-
ense
species. In addition, to check the extended
application
of
this
molecular
approach
in
other
Solanum
species, the PCR-based markers were tested
on two wild diploid potato species
S.
spegazzinii
and
S.
kurtzianum
.
20
Euphytica (2012) 187:19–29
123



Materials and methods
Plant materials
To amplify and characterize the
S
-
RNase
alleles in
S.
chacoense
(2n
=
2
9=
24), two accessions carrying
the
S11
-
RNase
allele (Matton et al. 1999; Marcellan
´
et al. 2006) and the
S16
-
RNase
allele (Marcellan et al.
´
2006
)
were used (Table 1). Pollen–pistil compatibility
relationships within and between these accessions
were analyzed by pollination test which included
controlled crosses performed according an incomplete
diallel mating design and observation of pollen tube
growth
along
style
by
fluorescence
microscopy
(Table 2; Fig. 1).
To investigate the potential use of the markers in
Solanum
, two accessions of
S. spegazzinii
and
S.
kurtzianum
were used (Table 1). These accessions
have been used in several crossability relationship
studies (Erazzu et al. 1999; Raimondi et al. 2003).
´
Except for accession QBCM, whose plants were
collected in the field at the Agricultural Experimental
Station of Balcarce, the other accessions were kindly
provided by the Potato Germplasm Bank located at the
Agricultural Experimental Station of Balcarce.
DNA isolation
To amplify the
S
-
RNase
alleles, total genomic DNA
was isolated from young leaves of each plant accord-
ing to Dellaporta et al. (1983).
Primers design
The aim of this procedure was to design primers with
high probability of amplifying every
S
-
RNase
alleles
of
Solanum.
To this end, primers were designed on the
basis of conserved regions (Fig. 2a) defined by the
alignment of
S
-
RNase
nucleotide sequences from
Solanum
[
Sc
—
S2
,
S3
,
S11
,
S12
,
S13
and
S14
(DDBJ/
EMBL/GenBank X56896, X56897, S69589, AF191
1732, L36667 and AF232304, respectively), and St—
S2
(DDBJ/EMBL/GenBank X62727)].
The couple of primers designed on the basis of
C2 and C3 alignment were not degenerate (Table 3)
because C2 and C3 showed very high amino acid
sequence
similarity
among
the
S
-
RNase
alleles.
Conversely,
since
the
alignment
of
C1
and
C4
exhibited
lower
amino
acid
sequence
similarity
among the
S
-
RNase
alleles, primers designed on the
basis of these conserved r

Kết quả (Việt) 2:

Phát triển các mốc PCR dựa trên cho các fi cation identi
của
S
-
RNase
alen ở các loài khoai tây hoang dại
Olga Marcellan '• Alberto Acevedo đã nhận: ngày 14 tháng 11 2011 / Được chấp nhận: ngày 19 tháng 4 năm 2012 / Xuất bản trực tuyến: 10 Tháng Năm 2012 _ Springer Science + Business Media BV 2012 Tóm tắt tình dục tự không tương thích trong hoang dã lưỡng bội loài khoai tây được điều khiển bởi một multiallelic đơn S -locus mã hóa một ribonuclease vòi nhuỵ đa hình (S - RNase) đó là trách nhiệm của phụ nữ trong chức năng công nhận phấn hoa nhụy hoa. Trong nghiên cứu này, một cách tiếp cận sử dụng dấu PCR dựa trên ban đầu được phát triển để khuếch đại S - RNase alen trong Solanum chacoense. Sau đó, để điều tra áp dụng chung của họ trong Solanum, cách tiếp cận phân tử này đã thành công trong thử nghiệm trên S. spegazzinii và S. kurtzianum. ứng dụng của phương pháp PCR-SSCP tiết lộ tiềm năng mới S - RNase alen trong ba loài, thể hiện lần đầu tiên kinh sự tồn tại của S - RNase di truyền biến thiên trong và giữa các quần thể hoang dã của loài khoai tây lưỡng bội. Fi c dấu SSCP loài đặc hiệu có thể được sử dụng thành công trong gen fl ow nghiên cứu được cũng được phát hiện trong cuộc điều tra này. Từ khóa Gametophytic tự không tương thích _ S - RNase alen _ PCR-SSCP _ Solanum chacoense _ S. spegazzinii _ S. kurtzianum Giới thiệu Các introgression nguồn gen khoai tây hoang dã vào các loài trồng (Solanum tuberosum L. ssp. tubero- sum) là một trong những mục tiêu chính của giống khoai tây chương trình vì các loài hoang dã rất quan trọng chứa các biến dị di truyền và các nguồn kháng chống cự để sinh học và các yếu tố bất lợi vô sinh. Hầu hết các loài này đang chéo bón phân diploids do để tự không tương thích (SI). SI cho phép nhụy hoa của một ower fl để phân biệt giữa liên quan di truyền (self) và không liên quan (không tự) phấn hoa. Công nhận kết quả này ức chế sự tăng trưởng của ống tự phấn hoa ở phía trên là một phần của phong cách. Như vậy, SI là một sinh sản prezygotic rào cản bởi đó không tương thích phấn hoa ống được ngăn cản việc cung cấp các tế bào tinh trùng vào buồng trứng để đạt được thụ tinh kép (Kao và Tsukamoto 2004). Các Solanaceae, Rosaceae và họ mã đề gia đình hiện gametophytic tự không tương thích hệ thống kiểm soát bởi một đơn S -locus với nhiều S -haplotype. Mỗi S -haplotype mang hai gen liên kết gen, vòi nhuỵ ribonuclease (S - RNase) và S - locus F - hộp hoặc S - haplotype - Speci fi c F - protein hộp, O. Marcellan ('&) Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Mar del Plata, CC 276, 7620 Balcarce, Buenos Aires, Argentina e-mail: [e-mail] A. Acevedo Centro de Investigacion de Recursos Naturales, Instituto 'Nacional de TECNOLOGIA Agropecuaria (INTA Castelar), "De los Reseros y Las Caban~as s / n, 1686 Hurlingham, Buenos Aires, Argentina 123 Euphytica (2012) 187: 19-29 DOI 10,1007 / s10681-012-0703-3 kiểm soát phụ nữ và nam thành phố fi Speci, respec- cực (Lai . et al 2002; Takayama và Isogai 2005; Rea và Nasrallah 2008). Các S - RNase gen có fi ve vùng bảo tồn cao (C1-C5) và một hypervari- khu vực có thể (với hai lĩnh vực, HVA và HVB, trong Solanaceae và một trong Rosaceae) nằm giữa C2 và C3. Gen này mã hóa một loạt alen của vòi nhuỵ glycoprotein (S - RNases) với các hoạt động ribonuclease thể hiện trong ma trận ngoại bào của nhụy hoa. S - RNases có lẽ tác động gây độc tế bào của họ bên trong ống phấn không tương thích bằng cách làm giảm ống phấn RNA trong một S -haplotype- Speci fi c cách. Như S - RNases đã được hiển thị để nhập ống phấn trong S cách -haplotype độc lập, các cơ chế SI phải liên quan đến khả năng của ống phấn để vô hiệu bất cứ sự không tự S - RNase, trong khi tự S - RNases được bằng cách nào đó được bảo vệ . từ bất hoạt (. Liu et al 2009) Hai cách tiếp cận không loại trừ lẫn nhau đã được sử dụng để ước tính sự đa dạng của các S - RNase gen ở các loài khác nhau. Một mặt, các phương pháp tiếp cận cổ điển đã được tập trung vào cách sử dụng của cây thánh giá được kiểm soát và đánh giá tiếp theo của phấn hoa, nhụy hoa phản ứng tương thích bằng fl uorescence kính hiển vi (Camadro và Peloquin 1981; Marcellan và Camadro 1996; '. Camadro et al 1997). Mặt khác, các phân tử cách tiếp cận đã được giải quyết với việc áp dụng các phương pháp khác nhau được dựa trên: (1) detec tion của S -glycoproteins bằng Western blot (Hinata và Nishio 1981; Nou et. Al 1991), hai chiều điện (Kirch et al 1989; Sassa et al 1994;.. Tao et al 1999). đẳng điện tập trung hoặc (Eijlander et al. 2000), (2) phân tích cDNA của Southern blot sử dụng như thăm dò cDNA của S - RNase đã được biết đến (Nasrallah et al 1985;. Gebhardt et al 1991;. Tao et al 1999.), (3) phân tích RNA bằng RT-PCR (Oldknow và lưa 1995; Richman et al 1996;.. Kurup et al 1998; Igic et al. 2007; Savage và Miller 2006; Miller và Kostyun 2010) hoặc Northern blot (Kirch et al 1989; Tao et al.. 1999; Xu et al 1990), và (4) identi fi cation của. S - RNase alen của ampli fi cation của DNA của bộ gen với cặp mồi được thiết kế trên cơ sở bảo tồn các vùng của gen (Ishimizu et al. 1999 và những người khác sẽ bổ sung sau). Bởi vì các phương pháp sau này là đơn giản và cho phép khảo nghiệm giống cây trồng thay vì chờ đợi cho đến khi giai đoạn phát triển của quả fl owering, nó đã được sử dụng trong nghiên cứu này. Trong vài năm qua, những nỗ lực mãnh liệt đã được đưa ra cho các nhân bản và phân tử characteriza- tion của S - RNase gen trong một số trái cây Rosaceae loài bao gồm táo (Sassa et al 1994;. Brootha- Erts et al 1995)., hạnh nhân (Tao et al 1997)., sweet cherry (Tao et al 1999;.. Sonneveld et al 2003), và lê châu Âu (Zuccherelli et al 2002;. Sanzol et al. 2006) trong số những người khác. Về Solanaceae, các trình tự đầu tiên fi của S - RNase được suy ra từ các nhân bản và trình tự cDNA tương ứng trong Nicotiana alata (Anderson et al 1986.). Biệt biệt trong khoai tây, bốn S - RNase alen đã được nhân bản vô tính và identi fi ed trong các tứ bội trồng khoai S. tuberosum spp. Tuberosum (St): S1, S2, S3, và S4. Kaufmann et al. (1991) báo cáo các axit amin chuỗi của S1, trong khi các phần của bộ gen chuỗi các S2 có sẵn trong DDBJ / EMBL / cơ sở dữ liệu GenBank theo nhập số X62727. Kể từ khi trình tự axit amin của S3 và S4 báo cáo của Kirch et al. (1989) đã rất từng phần và diện sented chỉ các vùng được bảo vệ 2, họ đã không đưa vào nghiên cứu này. Đối với khoai tây hoang dã lưỡng bội loài, Solanum chacoense Bitt. (Sc), bảy S - RNase alen đã được nhân bản vô tính và identi fi ed: S2, S3, S11, S12, S13, S14, và S16 (DDBJ / EMBL / GenBank X56896, X56897 , S69589, AF1911732, L36667, AF232304, và DQ007316, tương ứng). Tất cả các S - RNase alen, với ngoại lệ của S16, được phân lập và đặc trưng trên cơ sở của RNA cô lập và tiếp theo RT-PCR hoặc Northern blot phân tích. Các S16 - RNase alen là identi fi ed trong một Argentina S. chacoense dân số theo nhóm của chúng tôi sử dụng mồi được thiết kế trên cơ sở của các tiên fi và. Khu vực thứ tư bảo tồn (. Marcellan et al 2006) "Thật không may, phân tích PCR được thực hiện bằng cách sử dụng này cặp mồi là không thể để khuếch đại khác S - RNases alen trong S. chacoense. Hiện nay, không có thông tin liên quan đến các alen đa dạng của S - RNase gen có sẵn trong khoai tây, mặc dù S2, S11, S12, S13 và alen của S. chacoense và S2 alen của S. tuberosum đã được bao gồm trong S - RNase nghiên cứu sự đa dạng gen ở loài Solanaceae khác (Savage và Miller 2006;.. Igic et al 2007; Miller và Kostyun 2010) Trong cuộc điều tra này một cách tiếp cận phân tử sử dụng PCR dựa trên đánh dấu là ban đầu được phát triển để xác định S - RNase alen khác hơn S16 trong S. chaco- ense loài. Ngoài ra, để kiểm tra mở rộng ứng dụng của này phân tử cách tiếp cận trong khác Solanum loài, các dấu PCR dựa trên đã được thử nghiệm trên hai hoang dã loài khoai tây lưỡng bội S. spegazzinii và S. kurtzianum. 20 Euphytica (2012) 187: 19-29 123 Vật liệu và các phương pháp vật liệu thực vật để khuếch đại và đặc trưng của S - RNase alen trong S. chacoense (2n = 2 9 = 24), hai đan có thực sự S11 - RNase alen (Matton et al 1999;. Marcellan '. et al 2006) và S16 - RNase (. Marcellan et al alen 'năm 2006) đã được sử dụng (Bảng 1). Khả năng tương thích phấn hoa nhụy hoa các mối quan hệ bên trong và giữa các đan có được phân tích bằng cách thử nghiệm thụ phấn trong đó bao gồm thập kiểm soát được thực hiện theo một không đầy đủ thiết kế diallel giao phối và quan sát của ống phấn phát triển dọc theo phong cách của fl uorescence kính hiển vi (Bảng 2;. Hình 1). Để nghiên cứu tiềm năng sử dụng các đánh dấu trong Solanum, hai đan có của S. spegazzinii và S. kurtzianum đã được sử dụng (Bảng 1). Những đan có đã được sử dụng trong mối quan hệ nhiều crossability nghiên cứu (Erazzu et al 1999;.. Raimondi et al 2003). "Ngoại trừ nhập QBCM, mà nhà máy đã được thu thập trong thực địa tại các nông Experimental Trạm Balcarce, các đan có khác là lòng được cung cấp bởi các mầm khoai tây Bank đặt tại Trạm thực nghiệm nông nghiệp của Balcarce. DNA ly Để khuếch đại S - RNase alen, tổng DNA của bộ gen đã được phân lập từ lá non của mỗi nhà máy accord- ing để Dellaporta et al. . (1983) Sơn lót thiết kế Mục đích của thủ tục này là để thiết kế mồi với xác suất cao của khuếch đại mỗi S - RNase alen của. Solanum Để kết thúc này, các mồi được thiết kế trên cơ sở các vùng bảo tồn (Hình 2a). De fi được xác định bởi các liên kết của S - RNase nucleotide trình tự từ Solanum [Sc - S2, S3, S11, S12, S13 và S14 (DDBJ / EMBL / GenBank X56896, X56897, S69589, AF191 1732, L36667 và AF232304, tương ứng), và St- S2 (DDBJ / EMBL / GenBank X62727)]. Các cặp vợ chồng của cặp mồi được thiết kế trên cơ sở của C2 và C3 chỉnh được không thoái hóa (Bảng 3) vì C2 và C3 cho thấy amin rất cao các S - RNase alen, sơn lót được thiết kế trên cơ sở của những r bảo tồn '2006) đã được sử dụng (Bảng 1). Khả năng tương thích phấn hoa nhụy hoa các mối quan hệ bên trong và giữa các đan có được phân tích bằng cách thử nghiệm thụ phấn trong đó bao gồm thập kiểm soát được thực hiện theo một không đầy đủ thiết kế diallel giao phối và quan sát của ống phấn phát triển dọc theo phong cách của fl uorescence kính hiển vi (Bảng 2;. Hình 1). Để nghiên cứu tiềm năng sử dụng các đánh dấu trong Solanum, hai đan có của S. spegazzinii và S. kurtzianum đã được sử dụng (Bảng 1). Những đan có đã được sử dụng trong mối quan hệ nhiều crossability nghiên cứu (Erazzu et al 1999;.. Raimondi et al 2003). "Ngoại trừ nhập QBCM, mà nhà máy đã được thu thập trong thực địa tại các nông Experimental Trạm Balcarce, các đan có khác là lòng được cung cấp bởi các mầm khoai tây Bank đặt tại Trạm thực nghiệm nông nghiệp của Balcarce. DNA ly Để khuếch đại S - RNase alen, tổng DNA của bộ gen đã được phân lập từ lá non của mỗi nhà máy accord- ing để Dellaporta et al. . (1983) Sơn lót thiết kế Mục đích của thủ tục này là để thiết kế mồi với xác suất cao của khuếch đại mỗi S - RNase alen của. Solanum Để kết thúc này, các mồi được thiết kế trên cơ sở các vùng bảo tồn (Hình 2a). De fi được xác định bởi các liên kết của S - RNase nucleotide trình tự từ Solanum [Sc - S2, S3, S11, S12, S13 và S14 (DDBJ / EMBL / GenBank X56896, X56897, S69589, AF191 1732, L36667 và AF232304, tương ứng), và St- S2 (DDBJ / EMBL / GenBank X62727)]. Các cặp vợ chồng của cặp mồi được thiết kế trên cơ sở của C2 và C3 chỉnh được không thoái hóa (Bảng 3) vì C2 và C3 cho thấy amin rất cao các S - RNase alen, sơn lót được thiết kế trên cơ sở của những r bảo tồn '2006) đã được sử dụng (Bảng 1). Khả năng tương thích phấn hoa nhụy hoa các mối quan hệ bên trong và giữa các đan có được phân tích bằng cách thử nghiệm thụ phấn trong đó bao gồm thập kiểm soát được thực hiện theo một không đầy đủ thiết kế diallel giao phối và quan sát của ống phấn phát triển dọc theo phong cách của fl uorescence kính hiển vi (Bảng 2;. Hình 1). Để nghiên cứu tiềm năng sử dụng các đánh dấu trong Solanum, hai đan có của S. spegazzinii và S. kurtzianum đã được sử dụng (Bảng 1). Những đan có đã được sử dụng trong mối quan hệ nhiều crossability nghiên cứu (Erazzu et al 1999;.. Raimondi et al 2003). "Ngoại trừ nhập QBCM, mà nhà máy đã được thu thập trong thực địa tại các nông Experimental Trạm Balcarce, các đan có khác là lòng được cung cấp bởi các mầm khoai tây Bank đặt tại Trạm thực nghiệm nông nghiệp của Balcarce. DNA ly Để khuếch đại S - RNase alen, tổng DNA của bộ gen đã được phân lập từ lá non của mỗi nhà máy accord- ing để Dellaporta et al. . (1983) Sơn lót thiết kế Mục đích của thủ tục này là để thiết kế mồi với xác suất cao của khuếch đại mỗi S - RNase alen của. Solanum Để kết thúc này, các mồi được thiết kế trên cơ sở các vùng bảo tồn (Hình 2a). De fi được xác định bởi các liên kết của S - RNase nucleotide trình tự từ Solanum [Sc - S2, S3, S11, S12, S13 và S14 (DDBJ / EMBL / GenBank X56896, X56897, S69589, AF191 1732, L36667 và AF232304, tương ứng), và St- S2 (DDBJ / EMBL / GenBank X62727)]. Các cặp vợ chồng của cặp mồi được thiết kế trên cơ sở của C2 và C3 chỉnh được không thoái hóa (Bảng 3) vì C2 và C3 cho thấy amin rất cao các S - RNase alen, sơn lót được thiết kế trên cơ sở của những r bảo tồn