electrophoresis allowing a good sep

electrophoresis allowing a good separation of the
fragments can be determined experimentally by
loading different samples on a parallel gel at constant
time intervals.
The fragments to be loaded on DGGE gels are
usually PCR products. An optimal resolution is
obtained when the molecules do not completely denature.
The addition of a 30- to 40-bp GC clamp to one of
the PCR primers insures that the fragment of DNAwill
remain partially double-stranded and that the region
screened is in the lowest melting domain (Myers et al.,
1985; Sheffield et al.,1989). Chemiclamps are psoralen-
derivatised PCR primers that can be used as alternative
to GC clamps providing the same effect (Fu¨hr,
1996). However, as the chemiclamps are covalently
linked to the DNA strands at one end, they cannot be
used when DGGE fragments are to be sequenced
because the bands cannot be reamplified directly,
unless nested primers are used. The melting behaviour
of double-stranded DNA has been described by a
computer model developed by Lerman et al. (1984).
Computer software is available, such as MacMeltk
(Bio-Rad, Hercules, USA), which can calculate DNA
melting profiles and show regions of theoretically high
and low stability domains of a known sequence.
Placement of primers and GC clamps can thus be
optimised by analysis of the placement effect on the
DNA melting profile.
Bands in DGGE fingerprints can be revealed by
ethidium bromide staining. The most sensitive procedure
is silver staining (Felske et al., 1996),
although silver-stained gels cannot be used for
hybridisation experiments and single-strand DNA
fragments are also detected. SYBER Green I is
also an alternative for visualising DGGE gels
(Muyzer et al., 1997). SYBER Green staining does
not give background staining, thus allowing the
detection of DNA fragments even at very low
concentrations.
The DGGE equipment is supplied by different
companies such as Bio-Rad, INGENY (Leiden, The
Netherlands), and CBS Scientific (Del Mar, USA).
3. What do we get from DGGE?
The PCR-DGGE technique is widely employed in
microbial ecology because is capable of providing a

Kết quả (Việt) 2:

điện cho phép một tách tốt của các
mảnh vỡ có thể được xác định bằng thực nghiệm bởi
tải mẫu khác nhau trên gel song song tại không đổi
khoảng thời gian.
Các mảnh vỡ được nạp vào gel DGGE là
thường sản phẩm PCR. Một độ phân giải tối ưu
đạt được khi các phân tử không hoàn toàn biến tính.
Việc bổ sung một 30 đến 40-bp GC kẹp với một trong
các mồi PCR đảm bảo rằng các mảnh vỡ của DNAwill
vẫn còn một phần sợi kép và rằng khu vực
chiếu là trong miền nóng chảy thấp nhất (Myers et al,.
1985;. Sheffield et al, 1989). Chemiclamps là psoralen-
mồi PCR tạo dẫn xuất có thể được sử dụng như thay thế
để kẹp GC cung cấp các hiệu ứng tương tự (FUHR,
1996). Tuy nhiên, khi được đồng hóa trị chemiclamps
liên kết với các sợi DNA ở một đầu, họ có thể không được
sử dụng khi các mảnh DGGE đang được giải mã
bởi vì ban nhạc không thể được reamplified trực tiếp,
trừ khi mồi lồng nhau được sử dụng. Các hành vi nóng chảy
của DNA sợi kép đã được mô tả bởi một
mô hình máy tính phát triển bởi Lerman et al. (1984).
Phần mềm máy tính có sẵn, chẳng hạn như MacMeltk
(Bio-Rad, Hercules, Hoa Kỳ), trong đó có thể tính toán DNA
profile nóng chảy và khu vực chương trình của lý thuyết cao
lĩnh vực ổn định và thấp của một trình tự đã biết.
Vị trí của đoạn mồi và kẹp GC thể do đó được
tối ưu hóa bằng cách phân tích các ảnh hưởng vị trí trên các
hồ sơ nóng chảy DNA.
Ban nhạc trong dấu vân tay DGGE có thể được tiết lộ bởi
thuốc nhuộm ethidium bromide. Thủ tục nhạy cảm nhất
là nhuộm bạc (Felske et al., 1996),
mặc dù gel bạc màu không thể được sử dụng cho
các thí nghiệm lai giống và DNA đơn sợi
mảnh cũng được phát hiện. SYBER xanh tôi là
cũng là một thay thế cho việc hình dung DGGE gel
(Muyzer et al., 1997). SYBER xanh nhuộm không
không cung cấp cho nền nhuộm, do đó cho phép
phát hiện các mảnh vỡ DNA ngay cả ở rất thấp
nồng độ.
Các thiết bị được cung cấp bởi DGGE khác nhau
các công ty như Bio-Rad, INGENY (Leiden,
Hà Lan), và CBS khoa học (Del Mar , USA).
3. Những gì chúng tôi nhận được từ DGGE?
Kỹ thuật PCR-DGGE được sử dụng rộng rãi trong các
hệ sinh thái vi sinh vật vì có khả năng cung cấp một