Quantitative Analysis of the Flavon

Quantitative Analysis of the Flavonoid Glycosides and Terpene Trilactones in the Extract of Ginkgo biloba and Evaluation of Their Inhibitory Activity towards Fibril Formation of
β-Amyloid Peptide

Haiyan Xie 1, Jing-Rong Wang 1,2, Lee-Fong Yau 1,2, Yong Liu 1, Liang Liu 1,2, Quan-Bin Han 1, Zhongzhen Zhao 1,* and Zhi-Hong Jiang 1,2,*

1 School of Chinese Medicine, Hong Kong Baptist University, Kowloon Tong, Kowloon, Hong Kong, China
2 State Key Lab of Quality Research in Chinese Medicine, Macau Institute for Applied Research in
Medicine and Health, Macau University of Science and Technology, Macau, China


* Authors to whom correspondence should be addressed; E-Mails: [e-mail] (Z.-H.J.);
[e-mail] (Z.Z.); Tel.: [phone] (Z.-H.J.); [phone] (Z.Z.); Fax: [phone] (Z.-H.J.); [phone] (Z.Z.).

Received: 13 March 2014; in revised form: 1 April 2014 / Accepted: 3 April 2014 / Published: 10 April 2014



Abstract: The standard extract of Ginkgo biloba leaves (EGb761) is used clinically in Europe for the symptomatic treatment of impaired cerebral function in primary degenerative dementia syndromes, and the results of numerous in vivo and in vitro studies have supported such clinical use. The abnormal production and aggregation of amyloid β peptide (Aβ) and the deposition of fibrils in the brain are regarded as key steps in the onset of Alzheimer’s Disease (AD), and the inhibition of Aβ aggregation and destabilization of the preformed fibrils represent viable approaches for the prevention and treatment of AD. Flavonoid glycosides and terpene trilactones (TTLs) are the two main components of EGb761 which represent 24 and 6% of the overall content, respectively. In our research, seven abundant flavonoid glycosides 1–7 were isolated from the extract of Ginkgo biloba leaves and characterized by spectroscopic analysis. Furthermore, an ultra-high performance liquid chromatography method was established for the simultaneous quantification of these seven flavonoids. The inhibitory activities of these flavonoids, as well as four TTLs, i.e., ginkgolides A, B, and C and bilobalide (compounds 8–11), were evaluated towards Aβ42 fibril formation using a thioflavin T fluorescence assay. It was found that three flavonoids
1, 3 and 4 exhibited moderate inhibitory activities, whereas the other four flavonoids 2, 5, 6


and 7, as well as the four terpene trilactones, showed poor activity. This is the first report of the inhibition of Aβ fibril formation of two characteristic acylated flavonoid glycosides
6, 7 in Ginkgo leaves, on the basis of which the structure-activity relationship of these flavonoids 1–7 was discussed.

Keywords: Ginkgo biloba; inhibitory activity; β-amyloid fibril formation; quantitative analysis; flavonoid glycoside; terpene trilactone




1. Introduction


Alzheimer’s disease (AD) is the main type of senile dementia, and is characterized by a range of pathological features, including the formation of senile plaques and neurofibrillary tangles. In recent years, there has been an increase in the number of reports identifying amyloid β peptide (Aβ) as a primary pathological factor in the occurrence of AD, with gradual changes in the balance between the state of Aβ production and clearance leading to the accumulation of aggregated Aβ. This accumulation of Aβ then triggers a series of complex reactions that ultimately lead to neuronal death and cognitive dysfunction [1].
The abnormal production and aggregation of Aβ and the deposition of fibrils in the brain are regarded as key steps in the onset of AD, and the development of therapeutic strategies aimed at preventing the aggregation of Aβ or promoting the destabilization of the preformed fibrils, therefore represent viable approaches for the prevention and treatment of AD [2].
EGb761 is the standard extract of the leaves of Ginkgo biloba which is currently being manufactured by several companies in Germany and France. On the grounds of proven clinical efficacy, EGb761 has been approved for the symptomatic treatment of impaired cerebral function in dementia syndromes by the German Federal Health Authority and for cerebral circulatory insufficiency and AD in France. The main indications for EGb761 are primary degenerative dementia, vascular dementia and mixed forms of dementia, which are characterized by several major symptoms, including memory loss, poor concentration, depression, vertigo, tinnitus, and headache. The approved daily dose of EGb761 is 120 to 240 mg in 2 or 3 doses, with doses of this type typically being recommended for at least 8 weeks. The results of a large number of in vivo and in vitro studies have provided strong evidence in support of the clinical use of EGb761 [3].
Flavonoid glycosides (FGs) and terpene trilactones (TTLs) are the two main groups of constituents in EGb761, which represent 24 and 6% of the total weight of EGb761, respectively. To identify the bioactive compounds in EGb761, we isolated the individual components of FGs from EGb and evaluated their inhibitory activities as well as single compounds of TTLs towards Aβ42 fibril formation using a thioflavin T (Th-T) fluorescence assay [4]. Using a variety of different chromatographic purification techniques, we isolated seven of the main FGs (compounds 1–7) from
EGb and elucidated their structures based on their HR-MS, 1H-NMR and 13C-NMR spectral data. We
also developed an ultra-high performance liquid chromatography (UPLC)-UV method for the quantitative analysis of these compounds, which allowed for the quantification of these seven FGs as well as the four main TTL components (compounds 8–11) in the extracts and preparations of


Ginkgo biloba leaves. Finally, the activities of these flavonoids and terpene lactones were also investigated, on the basis of which the structure-activity relationship of these flavonoids 1–7 was discussed.

2. Results and Discussion


2.1. Isolation and Structural Elucidation of the FGs


Seven flavonoids 1–7 were isolated from the total extract of the leaves of Ginkgo biloba. The HPLC fingerprint of the total extract showed that these seven compounds accounted for 54% of the total peak area of the 34 peaks observed in the HPLC chromatogram (Figure 1).

Figure 1. HPLC fingerprint of the total extract of the leaves of Ginkgo biloba.




All seven compounds were obtained as yellow amorphous powders and their structures were determined based on a comparison of their MS and NMR spectral data with those in the literature [5–8]. Compounds 1–7 were identified as quercetin 3-O-β-D-rutinoside (1), quercetin 3-O-α-L-(β-D- glucopyranosyl)-(1,2)-rhamnopyranoside (2), kaempferol 3-O-β-D-rutinoside (3), isorhamnetin 3-O-β- D-rutinoside (4), kaempferol 3-O-α-L-(β-D-glucopyranosyl)-(1,2)-rhamnopyranoside (5), quercetin
3-O-α-(6′′′-p-coumaroyl glucopyranosyl-β-1,2-rhamnopyranoside) (6), and kaempferol 3-O-α-(6′′′-p- coumaroyl glucopyranosyl-β-1,2-rhamnopyranoside) (7), respectively (Figure 2).

2.2. Quantification of the FGs in Extracts and Preparations of Ginkgo biloba Leaves


2.2.1. Method Validation


The regression equations, linearity, intra- and inter-day precision properties, and LOD and LOQ values of the seven analytes were determined using our UPLC-UV method. As shown in Table 1, satisfactory linearity levels were observed for compounds 1–7 (R2 ≥ 0.999). The LODs (S/N = 3) and LOQs (S/N = 10) of these analytes were less than 7.40 µg/mL and 24.75 µg/mL, respectively. The results listed in Table 2 showed that the intra- and inter-day variations were less than 1.63% (n = 5) and 3.65% (n = 5) for all of the analytes, respectively, demonstrating that this method exhibited a high


level of precision for all of the analytes tested. The repeatability values (RSDs, n = 5) of compounds
1–7 were determined to be less than 1.94%, and the results of the recovery study showed that the average recovery rates of all seven compounds were in the range of 98.1%–102.8% while RSDs were all less than 2.08% (n = 7). Taken together, these results demonstrated that our UPLC-UV method was suitable for the subsequent quantitative analysis of the seven flavonoid glycosides.

Figure 2. Structures of compounds 1–7.







HO O




R1
OH



OR2

R
OH HO O
OH
O
OH O
H3C O O
OH O HO
HO
O
O
HO O OH
OH
R1 R2 R
1 OH -Glc(6-1)-Rha 6 OH
2 OH -Rha(2-1)-Glc 7 H
3 H -Glc(6-1)-Rha
4 OCH3 -Glc(6-1)-Rha
5 H -Rha(2-1)-Glc

Table 1. Linearity and sensitivity of compounds 1–7.

Compounds Regression Equation Linear range


R2 LOD


LOQ
(µg/mL) (µg/mL) (µg/mL)
1 Y = 9.1207x − 3.07 25.0–300.0 0.9999 2.33 8.09
2 Y = 6.4290x + 6.08 24.0–144.0 0.9995 4.44 14.66
3 Y = 11.370x − 4.72 12.5–150.0 0.9999 2.74 9.10
4 Y = 7.9820x − 17.96 25.0–150.0 0.9996 4.02 13.46
5 Y = 9.1149x − 5.52 25.0–150.0 0.9997 4.30 14.33
6 Y = 6.6509x + 4.18 25.0–150.0 0.9998 7.17 23.89
7 Y = 7.5831x − 3.76 25.0–150.0 0.9999 7.40 24.75

Table 2. Precision, repeatability and recovery of compounds 1–7.

Precision (n = 5) Repeatability (n = 5) Recovery (n = 7)
Compds.

Intra-day

Inter-day

Concentration

RSD/


2.2.2. Quantitative Analysis of Compounds 1–7 in the Extracts and Tablets of Ginkgo biloba


In this study, we collected a total of 11 samples for UPLC-UV analysis, including the extractsand botanical products of Ginkgo biloba, i.e., Tanakan® and Ginaton® tablets, which were made from EGb761. The details of these samples are listed in Table 3.

Table 3. Details of the samples subjected to quantitative analysis.

Sample Description

Kết quả (Việt) 1:

Phân tích định lượng của Flavonoid glicozit và Terpene Trilactones trong chiết xuất của Ginkgo biloba và đánh giá của mình ức chế hoạt động hướng tới thành lập FibrilΒ-Amyloid PeptideHAIYAN Xie 1, Wang Jing-Rong 1,2, Lee-Fong Yau 1,2, Yong Liu 1, lương lưu 1,2, Quận-Bin Han 1, Triệu Tử Dương Zhongzhen 1, * và Zhi-Hong Jiang 1,2, *1 trường y học Trung Quốc, Hong Kong Baptist đại học, Kowloon Tong, Kowloon, Hong Kong, Trung Quốc2 phòng thí nghiệm nhà nước quan trọng của chất lượng nghiên cứu ở Trung Quốc y học, viện Ma cao cho các nghiên cứu ứng dụng trongY học và sức khỏe, Macau đại học khoa học và công nghệ, Ma cao, Trung Quốc* Tác giả mà thư cần được giải quyết; E-mail: [e-mail] (Z.-H.J.);[e-mail] (ZZ); Điện thoại: [phone] người-2777 (Z.-H.J.); + 852-3411-2424 (ZZ); Số Fax: [phone] (Z.-H.J.); + 853-3411-2461 (ZZ).Nhận được: 13 Tháng ba năm 2014; trong sửa đổi hình thức: 1 tháng 4 năm 2014 / được chấp nhận: 3 tháng 4 năm 2014 / được đăng: ngày 10 tháng 4 năm 2014Abstract: The standard extract of Ginkgo biloba leaves (EGb761) is used clinically in Europe for the symptomatic treatment of impaired cerebral function in primary degenerative dementia syndromes, and the results of numerous in vivo and in vitro studies have supported such clinical use. The abnormal production and aggregation of amyloid β peptide (Aβ) and the deposition of fibrils in the brain are regarded as key steps in the onset of Alzheimer’s Disease (AD), and the inhibition of Aβ aggregation and destabilization of the preformed fibrils represent viable approaches for the prevention and treatment of AD. Flavonoid glycosides and terpene trilactones (TTLs) are the two main components of EGb761 which represent 24 and 6% of the overall content, respectively. In our research, seven abundant flavonoid glycosides 1–7 were isolated from the extract of Ginkgo biloba leaves and characterized by spectroscopic analysis. Furthermore, an ultra-high performance liquid chromatography method was established for the simultaneous quantification of these seven flavonoids. The inhibitory activities of these flavonoids, as well as four TTLs, i.e., ginkgolides A, B, and C and bilobalide (compounds 8–11), were evaluated towards Aβ42 fibril formation using a thioflavin T fluorescence assay. It was found that three flavonoids1, 3 and 4 exhibited moderate inhibitory activities, whereas the other four flavonoids 2, 5, 6 and 7, as well as the four terpene trilactones, showed poor activity. This is the first report of the inhibition of Aβ fibril formation of two characteristic acylated flavonoid glycosides6, 7 in Ginkgo leaves, on the basis of which the structure-activity relationship of these flavonoids 1–7 was discussed.Keywords: Ginkgo biloba; inhibitory activity; β-amyloid fibril formation; quantitative analysis; flavonoid glycoside; terpene trilactone1. IntroductionAlzheimer’s disease (AD) is the main type of senile dementia, and is characterized by a range of pathological features, including the formation of senile plaques and neurofibrillary tangles. In recent years, there has been an increase in the number of reports identifying amyloid β peptide (Aβ) as a primary pathological factor in the occurrence of AD, with gradual changes in the balance between the state of Aβ production and clearance leading to the accumulation of aggregated Aβ. This accumulation of Aβ then triggers a series of complex reactions that ultimately lead to neuronal death and cognitive dysfunction [1].The abnormal production and aggregation of Aβ and the deposition of fibrils in the brain are regarded as key steps in the onset of AD, and the development of therapeutic strategies aimed at preventing the aggregation of Aβ or promoting the destabilization of the preformed fibrils, therefore represent viable approaches for the prevention and treatment of AD [2].EGb761 is the standard extract of the leaves of Ginkgo biloba which is currently being manufactured by several companies in Germany and France. On the grounds of proven clinical efficacy, EGb761 has been approved for the symptomatic treatment of impaired cerebral function in dementia syndromes by the German Federal Health Authority and for cerebral circulatory insufficiency and AD in France. The main indications for EGb761 are primary degenerative dementia, vascular dementia and mixed forms of dementia, which are characterized by several major symptoms, including memory loss, poor concentration, depression, vertigo, tinnitus, and headache. The approved daily dose of EGb761 is 120 to 240 mg in 2 or 3 doses, with doses of this type typically being recommended for at least 8 weeks. The results of a large number of in vivo and in vitro studies have provided strong evidence in support of the clinical use of EGb761 [3].
Flavonoid glycosides (FGs) and terpene trilactones (TTLs) are the two main groups of constituents in EGb761, which represent 24 and 6% of the total weight of EGb761, respectively. To identify the bioactive compounds in EGb761, we isolated the individual components of FGs from EGb and evaluated their inhibitory activities as well as single compounds of TTLs towards Aβ42 fibril formation using a thioflavin T (Th-T) fluorescence assay [4]. Using a variety of different chromatographic purification techniques, we isolated seven of the main FGs (compounds 1–7) from
EGb and elucidated their structures based on their HR-MS, 1H-NMR and 13C-NMR spectral data. We
also developed an ultra-high performance liquid chromatography (UPLC)-UV method for the quantitative analysis of these compounds, which allowed for the quantification of these seven FGs as well as the four main TTL components (compounds 8–11) in the extracts and preparations of


Ginkgo biloba leaves. Finally, the activities of these flavonoids and terpene lactones were also investigated, on the basis of which the structure-activity relationship of these flavonoids 1–7 was discussed.

2. Results and Discussion


2.1. Isolation and Structural Elucidation of the FGs


Seven flavonoids 1–7 were isolated from the total extract of the leaves of Ginkgo biloba. The HPLC fingerprint of the total extract showed that these seven compounds accounted for 54% of the total peak area of the 34 peaks observed in the HPLC chromatogram (Figure 1).

Figure 1. HPLC fingerprint of the total extract of the leaves of Ginkgo biloba.




All seven compounds were obtained as yellow amorphous powders and their structures were determined based on a comparison of their MS and NMR spectral data with those in the literature [5–8]. Compounds 1–7 were identified as quercetin 3-O-β-D-rutinoside (1), quercetin 3-O-α-L-(β-D- glucopyranosyl)-(1,2)-rhamnopyranoside (2), kaempferol 3-O-β-D-rutinoside (3), isorhamnetin 3-O-β- D-rutinoside (4), kaempferol 3-O-α-L-(β-D-glucopyranosyl)-(1,2)-rhamnopyranoside (5), quercetin
3-O-α-(6′′′-p-coumaroyl glucopyranosyl-β-1,2-rhamnopyranoside) (6), and kaempferol 3-O-α-(6′′′-p- coumaroyl glucopyranosyl-β-1,2-rhamnopyranoside) (7), respectively (Figure 2).

2.2. Quantification of the FGs in Extracts and Preparations of Ginkgo biloba Leaves


2.2.1. Method Validation


The regression equations, linearity, intra- and inter-day precision properties, and LOD and LOQ values of the seven analytes were determined using our UPLC-UV method. As shown in Table 1, satisfactory linearity levels were observed for compounds 1–7 (R2 ≥ 0.999). The LODs (S/N = 3) and LOQs (S/N = 10) of these analytes were less than 7.40 µg/mL and 24.75 µg/mL, respectively. The results listed in Table 2 showed that the intra- and inter-day variations were less than 1.63% (n = 5) and 3.65% (n = 5) for all of the analytes, respectively, demonstrating that this method exhibited a high


level of precision for all of the analytes tested. The repeatability values (RSDs, n = 5) of compounds
1–7 were determined to be less than 1.94%, and the results of the recovery study showed that the average recovery rates of all seven compounds were in the range of 98.1%–102.8% while RSDs were all less than 2.08% (n = 7). Taken together, these results demonstrated that our UPLC-UV method was suitable for the subsequent quantitative analysis of the seven flavonoid glycosides.

Figure 2. Structures of compounds 1–7.







HO O




R1
OH



OR2

R
OH HO O
OH
O
OH O
H3C O O
OH O HO
HO
O
O
HO O OH
OH
R1 R2 R
1 OH -Glc(6-1)-Rha 6 OH
2 OH -Rha(2-1)-Glc 7 H
3 H -Glc(6-1)-Rha
4 OCH3 -Glc(6-1)-Rha
5 H -Rha(2-1)-Glc

Table 1. Linearity and sensitivity of compounds 1–7.

Compounds Regression Equation Linear range


R2 LOD


LOQ
(µg/mL) (µg/mL) (µg/mL)
1 Y = 9.1207x − 3.07 25.0–300.0 0.9999 2.33 8.09
2 Y = 6.4290x + 6.08 24.0–144.0 0.9995 4.44 14.66
3 Y = 11.370x − 4.72 12.5–150.0 0.9999 2.74 9.10
4 Y = 7.9820x − 17.96 25.0–150.0 0.9996 4.02 13.46
5 Y = 9.1149x − 5.52 25.0–150.0 0.9997 4.30 14.33
6 Y = 6.6509x + 4.18 25.0–150.0 0.9998 7.17 23.89
7 Y = 7.5831x − 3.76 25.0–150.0 0.9999 7.40 24.75

Table 2. Precision, repeatability and recovery of compounds 1–7.

Precision (n = 5) Repeatability (n = 5) Recovery (n = 7)
Compds.

Intra-day

Inter-day

Concentration

RSD/


2.2.2. Quantitative Analysis of Compounds 1–7 in the Extracts and Tablets of Ginkgo biloba


In this study, we collected a total of 11 samples for UPLC-UV analysis, including the extractsand botanical products of Ginkgo biloba, i.e., Tanakan® and Ginaton® tablets, which were made from EGb761. The details of these samples are listed in Table 3.

Table 3. Details of the samples subjected to quantitative analysis.

Sample Description

Kết quả (Việt) 2:

Phân tích định lượng của Glycosides Flavonoid và terpene Trilactones trong Extract của Ginkgo biloba và đánh giá các hoạt động ức chế của họ đối với các sợi nhỏ hình thành
β-amyloid Peptide Haiyan Xie 1, Jing-Rong Wang 1,2, Lee-Fong Yau 1,2, Yong Liu 1, Liang Liu 1,2, Quan-Bin Han 1, Zhongzhen Zhao 1, * và Zhi-Hồng Giang 1,2, * 1 học Y khoa Trung Quốc, Đại học Baptist Hồng Kông, Kowloon Tong, Kowloon, Hong Kong, Trung Quốc 2 nhà nước chính Lab nghiên cứu chất lượng trong Y học Trung Quốc, Macau Viện Nghiên cứu Thực nghiệm Y học và Y tế, Đại học Macau Khoa học và Công nghệ, Macau, Trung Quốc * tác giả để người thư nên được giải quyết; E-Mails: [e-mail] (Z.-HJ); [e-mail] (ZZ); Tel .: + 853-8897-2777 (Z.-HJ); + 852-3411-2424 (ZZ); Fax: + 853-2882-7222 (Z.-HJ); + 853-3411-2461 (ZZ). Đã nhận: ngày 13 tháng ba năm 2014; trong hình thức sửa đổi: 01 Tháng tư 2014 / Được chấp nhận: 3 Tháng tư 2014 / đăng: 10 Tháng Tư năm 2014 Tóm tắt: Các chiết xuất tiêu chuẩn của lá Ginkgo biloba (EGb761) được sử dụng trên lâm sàng ở châu Âu để điều trị triệu chứng các chức năng não bị suy giảm trong hội chứng sa sút trí tuệ thoái hóa tiểu học, và kết quả của rất nhiều trong cơ thể và trong các nghiên cứu trong ống nghiệm đã được hỗ trợ sử dụng lâm sàng như vậy. Việc sản xuất bất thường và tập hợp của amyloid β peptide (inhibitor) và sự lắng đọng của các sợi trong não được coi là bước quan trọng trong sự khởi đầu của bệnh Alzheimer (AD), và sự ức chế của inhibitor tập hợp và bất ổn của các sợi thành trước đại diện cho cách tiếp cận khả thi để phòng ngừa và điều trị AD. Flavonoid glycoside và terpene trilactones (TTLs) là hai thành phần chính của EGb761 mà đại diện cho 24 và 6% của toàn bộ nội dung tương ứng. Trong nghiên cứu của chúng tôi, bảy glycosides flavonoid phong phú 1-7 được phân lập từ chiết xuất lá Ginkgo biloba và được đặc trưng bởi phân tích quang phổ. Hơn nữa, một hiệu suất cực cao phương pháp sắc ký lỏng được thành lập để xác định số lượng đồng thời bảy flavonoids. Các hoạt động ức chế của các chất flavonoid, cũng như bốn TTLs, tức là, ginkgolides A, B, và C và Bilobalit (hợp chất 8-11), được đánh giá theo hướng hình thành các sợi nhỏ Aβ42 sử dụng một thử nghiệm thioflavin T huỳnh quang. Nó đã được tìm thấy rằng ba flavonoids 1, 3 và 4 trưng bày hoạt tính ức chế vừa phải, trong khi bốn flavonoid khác 2, 5, 6 và 7, cũng như bốn trilactones terpene, cho thấy hoạt động kém. Đây là báo cáo đầu tiên của sự ức chế sự hình thành các sợi nhỏ inhibitor của hai acylated glycosides flavonoid đặc trưng 6, 7 trong lá bạch quả, trên cơ sở đó các mối quan hệ cấu trúc hoạt động của các flavonoid 1-7 đã được thảo luận. Từ khóa: Ginkgo biloba; hoạt động ức chế; β-amyloid hình thành các sợi nhỏ; phân tích định lượng; glycoside flavonoid; terpene trilactone 1. Giới thiệu bệnh Alzheimer (AD) là loại chính của bệnh mất trí nhớ do tuổi già, và được đặc trưng bởi một loạt các tính năng bệnh lý, bao gồm cả việc hình thành các mảng bám và đám rối neurofibrillary già. Trong những năm gần đây, đã có sự gia tăng về số lượng các báo cáo xác định amyloid β peptide (inhibitor) là một yếu tố bệnh lý chính trong sự xuất hiện của AD, với những thay đổi dần dần trong sự cân bằng giữa các bang sản xuất và giải phóng mặt bằng inhibitor dẫn đến sự tích tụ của tổng hợp inhibitor. Tích tụ này của inhibitor sau đó gây ra một loạt các phản ứng phức tạp mà cuối cùng dẫn đến cái chết của tế bào thần kinh và rối loạn chức năng nhận thức [1]. Việc sản xuất bất thường và tập hợp của inhibitor và sự lắng đọng của các sợi trong não được coi là bước quan trọng trong sự khởi đầu của AD, và sự phát triển của chiến lược điều trị nhằm ngăn ngừa sự tập hợp của inhibitor hoặc thúc đẩy sự bất ổn của các sợi tạo sẵn, do đó đại diện cho phương pháp hữu hiệu để phòng ngừa và điều trị AD [2]. EGb761 là chiết xuất tiêu chuẩn của lá Ginkgo biloba là hiện đang được sản xuất bởi một số công ty ở Đức và Pháp. Trên cơ sở đã được chứng minh hiệu quả lâm sàng, EGb761 đã được chấp thuận để điều trị triệu chứng các chức năng não bị suy giảm trong hội chứng sa sút trí tuệ do Cục Y tế Liên bang Đức và suy tuần hoàn não và AD ở Pháp. Các chỉ định chính cho EGb761 là sa sút trí tuệ thoái hóa tiểu học, sa sút trí tuệ mạch máu và các hình thức hỗn hợp của bệnh mất trí nhớ, được đặc trưng bởi một số triệu chứng chính, bao gồm mất trí nhớ, kém tập trung, suy nhược, chóng mặt, ù tai, nhức đầu. Liều hàng ngày được phê duyệt của EGb761 là 120-240 mg trong 2 hoặc 3 liều, với liều lượng của loại này thường được đề nghị cho ít nhất 8 tuần. Các kết quả của một số lượng lớn trong cơ thể và trong các nghiên cứu trong ống nghiệm đã cung cấp bằng chứng mạnh mẽ để hỗ trợ việc sử dụng lâm sàng của EGb761 [3]. glycosides Flavonoid (FGS) và trilactones terpene (TTLs) là hai nhóm chính của các thành phần trong EGb761, mà đại diện cho 24 và 6% của tổng trọng lượng của EGb761, tương ứng. Để xác định các hợp chất hoạt tính sinh học trong EGb761, chúng tôi phân lập các thành phần riêng lẻ của FGS từ EGB và đánh giá các hoạt động ức chế của họ cũng như các hợp chất duy nhất của TTLs hướng tới hình thành các sợi nhỏ Aβ42 sử dụng một thioflavin T (Th-T) huỳnh quang nghiệm [4]. Sử dụng một loạt các kỹ thuật thanh lọc sắc ký khác nhau, chúng tôi phân lập bảy của FGS chính (hợp chất 1-7) từ EGB và làm sáng tỏ cấu trúc của họ dựa trên các dữ liệu quang phổ HR-MS, 1H-NMR và 13C-NMR của họ. Chúng tôi cũng đã phát triển một phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cực cao (UPLC) -UV phương pháp phân tích định lượng của các hợp chất, trong đó cho phép việc định lượng bảy FGS cũng như bốn thành phần chính TTL (hợp chất 8-11) trong các chất chiết xuất và các chế phẩm của Ginkgo biloba lá. Cuối cùng, các hoạt động của các chất flavonoid và lactones terpene cũng đã được điều tra, trên cơ sở đó các mối quan hệ cấu trúc hoạt động của các flavonoid 1-7 đã được thảo luận. 2. Kết quả và thảo luận 2.1. Phân lập và cấu minh bạch của FGS Bảy flavonoids 1-7 được phân lập từ tổng chiết xuất từ lá của Ginkgo biloba. Các dấu vân tay HPLC tổng chiết xuất cho thấy những bảy hợp chất chiếm 54% tổng diện tích đỉnh của 34 đỉnh núi quan sát trong sắc ký HPLC (Hình 1). Hình 1. HPLC dấu vân tay của các tổng chiết xuất lá Ginkgo biloba . Tất cả bảy hợp chất thu được ở dạng bột vô định hình màu vàng và cấu trúc của họ đã được xác định dựa trên sự so sánh của MS và các dữ liệu quang phổ NMR với những người trong văn học [5-8]. Các hợp chất 1-7 được xác định là quercetin 3-O-β-D-rutinoside (1), quercetin 3-O-α-L- (β-D- glucopyranosyl) - (1,2) -rhamnopyranoside (2), kaempferol 3-O-β-D-rutinoside (3), isorhamnetin 3-O-β- D-rutinoside (4), kaempferol 3-O-α-L- (β-D-glucopyranosyl) - (1,2) - rhamnopyranoside (5), quercetin 3-O-α- (6 '' '- p-coumaroyl glucopyranosyl-β-1,2-rhamnopyranoside) (6), và kaempferol 3-O-α- (6' '' - p - coumaroyl glucopyranosyl-β-1,2-rhamnopyranoside) (7), tương ứng (Hình 2). 2.2. Định lượng của FGS trong chiết xuất và chế phẩm của Ginkgo biloba Lá 2.2.1. Phương pháp Xác Nhận Các phương trình hồi quy, tuyến tính, tính chính xác trong nội bộ và giữa các ngày, và LOD và LOQ giá trị trong bảy phân tích được xác định bằng phương pháp UPLC-UV của chúng tôi. Như thể hiện trong Bảng 1, mức độ tuyến tính thỏa đáng đã được quan sát cho các hợp chất 1-7 (R2 ≥ 0,999). Các Lods (S / N = 3) và LOQs (S / N = 10) của các chất phân tích ít hơn 7,40 mg / ml và 24,75 mg / ml, tương ứng. Các kết quả được liệt kê trong Bảng 2 cho thấy các biến thể trong nội bộ và giữa các ngày ít hơn 1,63% (n = 5) và 3,65% (n = 5) cho tất cả các chất phân tích, tương ứng, chứng minh rằng phương pháp này trưng bày một cao cấp chính xác cho tất cả các chất phân tích thử nghiệm. Các giá trị lặp lại (RSDs, n = 5) của các hợp chất 1-7 được xác định là ít hơn 1,94%, và các kết quả nghiên cứu phục hồi cho thấy rằng tỷ lệ thu hồi trung bình của tất cả bảy hợp chất là trong khoảng 98,1% -102,8 % trong khi RSDs đều ít hơn 2,08% (n = 7). Tóm lại, những kết quả đã chứng minh rằng phương pháp UPLC-UV của chúng tôi là phù hợp cho việc phân tích định lượng tiếp theo của bảy glycosides flavonoid. Hình 2. Cấu trúc của các hợp chất 1-7. HO O R1 OH OR2 R OH HO O OH O OH O H3C OO OH O HO HO O O HO O OH OH R1 R2 R 1 OH -Glc (6-1) -Rha 6 OH 2 OH -Rha (2-1) -Glc 7 H 3 H -Glc (6-1) -Rha 4 OCH3 -Glc (6-1) -Rha 5 H -Rha (2-1) -Glc Bảng 1. Độ tuyến tính và sự nhạy cảm của các hợp chất 1-7. Các hợp chất Regression phương trình tuyến tính khoảng R2 LOD LOQ (mg / mL) (mg / mL) (mg / mL) 1 Y = 9.1207x - 3.07 25,0-300,0 0,9999 2,33 8,09 2 Y = 6.4290x + 6,08 24,0-144,0 0,9995 4,44 14,66 3 Y = 11.370x - 4,72 12,5-150,0 0,9999 2,74 9,10 4 Y = 7,9820 x - 17,96 25,0-150,0 0,9996 4,02 13,46 5 Y = 9.1149x - 5,52 25,0-150,0 0,9997 4,30 14,33 6 Y = 6.6509x + 4,18 25,0-150,0 0,9998 7,17 23,89 7 Y = 7.5831x - 3,76 25,0-150,0 0,9999 7,40 24,75 Bảng 2 . Chính xác, độ lặp lại và thu hồi các hợp chất 1-7. Precision (n = 5) Độ lặp lại (n = 5) Recovery (n = 7) Compds. Intra-day của Inter ngày Nồng RSD / 2.2.2. Phân tích định lượng của các hợp chất 1-7 trong chiết xuất và máy tính bảng của Ginkgo biloba Trong nghiên cứu này, chúng tôi thu thập được tổng cộng 11 mẫu phân tích UPLC-UV, bao gồm cả các sản phẩm thực vật extractsand của Ginkgo biloba, tức là, Tanakan® và máy tính bảng Ginaton®, mà đã được thực hiện từ EGb761. Các chi tiết của các mẫu được liệt kê trong Bảng 3. Bảng 3. Chi tiết về các mẫu bị phân tích định lượng. Sample Description