Some enrichment methods boast very

Some enrichment methods boast very high selectivity
and the ability to preferentially enrich and identify
known mutations at extremely low levels. RFLP-PCR–
based approaches have proven to be simple and inex-pensive in their application as well as highly selective
for the enrichment of known mutations. The use of
thermostable restriction endonucleases either before
PCR amplification or concurrently with PCR has been
aggressively applied by performing more than 1 round
of enrichment, with the aim to increase digestion and
suppression of the wild-type allele, thus preferentially
amplifying the mutant type. Several derivatives of this
approach have been developed; however, one of the
first, the restriction site mutation assay (RSM-PCR)
(22 ), has exhibited the capability to enrich mutants
present at 1 mutant per 108
wild-type genes (1, 23 ).
The APRIL-ATM method (amplification via primer li-gation, at the mutation) (24 ) uses an inverse approach,
mutant-specific RFLP, to digest mutant PCR products
rather than wild-type products. Subsequently, oligo-nucleotides are ligated to the digested fragments at the
site of the mutation and subjected to a second PCR,
thus preferentially enriching the mutant DNA. APRIL-ATM has exhibited high selectivity, with the ability to
detect a frequency of 1.6  10 –6
mutant alleles among
wild-type DNA. Although these RFLP-PCR– based ap-proaches are often advantageous because they are sim-ple in application and low in cost, in some cases they
may yield selectivity only on the order of 10–3
to 10–4
mutants per wild-type DNA (25 ).
One method that reports very high selectivity and
enrichment is based on the combined use of
pyrophosphate-activated polymerization (PAP) and
ASA (25 ). PAP-ASA employs an allele-specific oligo-nucleotide (P*), which is activated by pyrophospho-rolysis and DNA polymerization during PCR. A 3-terminal dideoxynucleotide is removed in the presence
of pyrophosphate, and the activated P* can then be
extended by the DNA polymerase. The authors report
that this approach is capable of detecting 1 mutant al-lele in 106
to 109
wild-type alleles (25 ). A bidirectional
modification of PAP-ASA (bi-PAP-ASA) (26 ) uses 2
opposing, allele-specific 3 terminal oligonucleotides
(P*) to increase selectivity and amplify low-level so-matic mutants present among 107
to 109
wild types
(Fig. 1A). On the other hand, not all reports achieve
this high selectivity using pyrophosphorolysis. One re-cent study used a PAP-based method to detect low level
B-RAF in uveal melanomas. The authors were able to
detect low-level mutations that were not detectable by
Sanger sequencing; however, their evaluation of the
technique exhibited a detection limit of 1 mutant
among 104
wild-type alleles.

Kết quả (Việt) 1:

Một số phương pháp làm giàu rất cao chọn lọc tự hào
và khả năng hay làm phong phú thêm và xác định
được biết đến đột biến ở mức rất thấp. RFLP-PCR–
phương pháp tiếp cận dựa trên đã chứng minh được đơn giản và inex suy nghi trong ứng dụng của họ, cũng như tính chọn lọc cao
cho làm giàu của đột biến được biết đến. Việc sử dụng
các hạn chế endonucleases hoặc trước khi
Đảng Cộng sản Romania khuếch đại hoặc đồng thời với Đảng Cộng sản Romania đã
mạnh ứng dụng bằng cách thực hiện hơn 1 vòng
làm giàu, với mục đích tăng tiêu hóa và
đàn áp tự nhiên-loại allele, do đó hay
khuyếch đại loại đột biến. Một số dẫn xuất này
phương pháp đã được phát triển; Tuy nhiên, một trong các
đầu tiên, các khảo nghiệm đột biến hạn chế trang web (RSM-Đảng Cộng sản Romania)
(22), đã trưng bày khả năng để làm phong phú thêm người đột biến
mặt tại các đột biến 1 mỗi 108
hoang dã kiểu gen (1, 23).
The tháng tư-ATM phương pháp (khuếch đại via mồi li-nhiên, tại các đột biến) (24) sử dụng một cách tiếp cận nghịch đảo,
RFLP dành riêng cho người đột biến, tiêu hóa đột biến Đảng Cộng sản Romania sản phẩm
chứ không phải là tự nhiên-loại sản phẩm. Sau đó, oligo-nucleotide được ligated để các mảnh vỡ tiêu hóa tại các
Trang web của các đột biến và phải chịu một đảng Cộng sản Romania thứ hai,
do đó hay làm giàu người đột biến DNA. Tháng tư-ATM đã trưng bày chọn lọc cao, với khả năng
phát hiện một tần số của 1.6 10 –6
alen đột biến trong số
loại hoang DNA. Mặc dù các RFLP-PCR– dựa ap-proaches thường được thuận lợi bởi vì họ là sim-ple trong ứng dụng và thấp chi phí, trong một số trường hợp họ
có thể mang lại chọn lọc chỉ trên thứ tự của 10–3
để 10–4
người đột biến mỗi loại hoang DNA (25).
một phương pháp báo cáo rất cao chọn lọc và
làm giàu dựa trên việc sử dụng kết hợp các
pyrophotphat kích hoạt trùng hợp (PAP) và
ASA (25). PAP-ASA sử dụng một allele cụ thể oligo-nucleotide (P *), mà sẽ được kích hoạt bởi pyrophospho-rolysis và trùng hợp DNA trong Đảng Cộng sản Romania. Một nhà ga 3 - dideoxynucleotide được lấy ra trong sự hiện diện
của pyrophotphat, và kích hoạt P * sau đó có thể
mở rộng bởi DNA polymerase. Báo cáo tác giả
rằng cách tiếp cận này là khả năng phát hiện 1 đột biến al-Kim Long trong 106
để 109
hoang dã-loại allele (25). Một hai chiều
sửa đổi của PAP-ASA (bi-PAP-ASA) (26) sử dụng 2
phản đối, dành riêng cho allele 3 thiết bị đầu cuối oligonucleotides
(P *) để tăng chọn lọc và khuyếch đại tầm thấp người đột biến vì vậy-matic trình bày trong số 107
để 109
hoang dã loại
(Fig. 1A). Mặt khác, không phải tất cả báo cáo đạt được
này chọn lọc cao bằng cách sử dụng pyrophosphorolysis. Một tái-trăm nghiên cứu sử dụng một PAP dựa trên phương pháp để phát hiện mức thấp
B-RAF trong uveal hạc. Các tác giả đã có thể
phát hiện đột biến ở độ cao thấp mà không phát hiện bởi
Sanger xác định trình tự; Tuy nhiên, của họ đánh giá của các
kỹ thuật triển lãm giới hạn phát hiện 1 đột biến
trong số 104
hoang dã-loại allele.

Kết quả (Việt) 2:

Một số phương pháp làm giàu tự hào chọn lọc rất cao
và khả năng làm giàu ưu tiên và xác định
đột biến được biết đến ở mức rất thấp. RFLP-PCR-
phương pháp tiếp cận dựa trên đã được chứng minh là đơn giản và INEX-trầm ngâm trong ứng dụng của họ cũng như tính chọn lọc cao
để làm giàu đột biến được biết đến. Việc sử dụng các
hạn chế chịu nhiệt enzyme hoặc trước khi
khuếch đại PCR hoặc đồng thời với PCR đã được
tích cực áp dụng bằng cách thực hiện nhiều hơn 1 vòng
làm giàu, với mục đích để tăng tiêu hóa và
ức chế của hoang dại alen, do đó ưu tiên
khuếch đại loại đột biến. Một số dẫn xuất của này
cách tiếp cận đã được phát triển; Tuy nhiên, một trong những
đầu tiên, thử nghiệm trang web hạn chế đột biến (RSM-PCR)
(22), đã trưng bày khả năng làm giàu đột biến
hiện nay 1 đột biến mỗi 108
gen hoang dại (1, 23).
Phương pháp THÁNG TƯ-ATM ( khuếch đại qua lớp sơn lót li-gation, tại đột biến) (24) sử dụng một cách tiếp cận ngược,
RFLP đột biến cụ thể, tiêu hóa sản phẩm PCR đột biến
chứ không phải là sản phẩm hoang dại. Sau đó, oligo-nucleotide được thắt để các mảnh vỡ tiêu hóa tại
trang web của đột biến và bị một PCR thứ hai,
do đó ưu tiên làm giàu DNA đột biến. THÁNG TƯ-ATM đã trưng bày chọn lọc cao, với khả năng
phát hiện một tần số 1,6? 10 -6
đột biến alen trong
hoang dại DNA. Mặc dù các RFLP-PCR dựa trên phương thức tiếp cận thường có lợi thế vì họ là sim dụ trong ứng dụng và ít chi phí, trong một số trường hợp, họ
có thể mang lại chỉ chọn lọc về trình tự 10-3
đến 10-4
đột biến mỗi hoang dại DNA (25).
Một phương pháp mà báo cáo chọn lọc rất cao và
làm giàu dựa trên việc sử dụng kết hợp của
pyrophosphate kích hoạt trùng hợp (PAP) và
ASA (25). PAP-ASA sử dụng một oligo nucleotide alen cụ thể (P *), được kích hoạt bởi pyrophospho-rolysis và DNA trùng hợp trong quá trình PCR. Một dideoxynucleotide 3?-Thiết bị đầu cuối được lấy ra trong sự hiện diện
của pyrophosphate, và kích hoạt P * sau đó có thể được
mở rộng bởi DNA polymerase. Các tác giả báo cáo
rằng phương pháp này là khả năng phát hiện 1 đột biến al-lele trong 106
đến 109
hoang dại alen (25). Một hai chiều
sửa đổi của PAP-ASA (bi-PAP-ASA) (26) sử dụng 2
đối lập, alen cụ thể 3? oligonucleotide thiết bị đầu cuối
(P *) để tăng tính chọn lọc và khuếch đại ở mức độ thấp đột biến như vậy-matic hiện diện giữa 107
đến 109
loại hoang dã
(Hình 1). Mặt khác, không phải tất cả các báo cáo đạt được
chọn lọc cao này sử dụng pyrophosphorolysis. Một nghiên cứu lại phần trăm sử dụng một phương pháp PAP dựa trên phát hiện mức độ thấp
B-RAF trong khối u ác tính uveal. Các tác giả đã có thể
phát hiện đột biến ở mức độ thấp mà không bị phát hiện bởi
Sanger trình tự; Tuy nhiên, đánh giá của họ về
kỹ thuật trưng bày một giới hạn phát hiện của 1 đột biến
trong số 104
hoang dại alen.