CRISPR/Cas9 targeting of essential

CRISPR/Cas9 targeting of essential HCMV protein-encoding genes impairs virus replication
Since CRISPR/Cas9 proved efficient in editing and clearing latent EBV infections, we next assessed whether we could impact herpesvirus replication in human cells. For this, we turned to a lytic infection model for HCMV, the most-commonly studied member of theBetaherpesvirinae. Replication of HCMV is dependent on a large number of viral replication factors. We selected seven of these essential genes and asked whether CRISPR/Cas9 targeting of these genes impact virus infection. We designed four gRNAs per gene for the viral polymerase UL54, the polymerase accessory protein UL44, the single strand DNA binding protein UL57, the primase UL70, the DNA helicase UL105, the major capsid protein UL86, andUL84, which is involved in the initiation of viral DNA replication [40, 41]. After lentiviral delivery of the gRNAs to MRC5 cells, the cells were challenged with eGFP-encoding HCMV derived from the TB40/E strain [42]. For each of the essential HCMV genes, one or more gRNAs were capable of almost completely impairing HCMV replication which resulted in survival of the cells and absence of eGFP expression as assessed by flow cytometry (Fig 3A). Unexpectedly, none of the gRNAs targeting UL84 were effective at limiting infection (Fig 3A). In cells transduced with control vector or vectors carrying gRNAs targeting host genes, the percentage of eGFP-positive cells was similar as observed for untransduced cells (Fig 3A). The gRNAs targeting the nonessential HCMV genes US6, US7, and US11 also did not interfere with HCMV replication. We assessed the percentage of HCMV sequences that were edited at the US7 and US11 target sites via CRISPR/Cas9 engineering, and observed alteration at these sites in 76 and 95% of cases, respectively. This shows that, although these genes were mutated, this did not interfere with virus replication.

Kết quả (Việt) 1:

CRISPR/Cas9 nhắm mục tiêu cần thiết HCMV gen mã hóa protein làm suy yếu nhân rộng vi rútKể từ khi CRISPR/Cas9 đã chứng minh hiệu quả trong chỉnh sửa và giải phóng tiềm ẩn EBV nhiễm trùng, chúng tôi tiếp theo đánh giá cho dù chúng ta có thể tác động đến herpesvirus sao chép trong các tế bào của con người. Đối với điều này, chúng tôi đã chuyển sang một mô hình lytic nhiễm trùng cho HCMV, thành viên hầu hết thường được nghiên cứu của theBetaherpesvirinae. Bản sao của HCMV là phụ thuộc vào một số lượng lớn các yếu tố sao chép của virus. Chúng tôi đã chọn bảy của các gen cần thiết và yêu cầu cho dù nhắm mục tiêu của nhiễm virus tác động đến gen CRISPR/Cas9. Chúng tôi thiết kế bốn gRNAs mỗi gen cho virus polymerase UL54 polymerase phụ kiện protein UL44, sợi DNA ràng buộc protein UL57, primase UL70, DNA helicase UL105, các protein chính capsid UL86, andUL84, đó là tham gia vào việc khởi xướng của virus nhân bản DNA [40, 41]. Sau khi lentiviral giao hàng của các gRNAs để MRC5 các tế bào, các tế bào đã thách thức với mã hóa eGFP HCMV bắt nguồn từ sự căng thẳng TB40/E [42]. Đối với mỗi gen HCMV cần thiết, một hoặc nhiều gRNAs có khả năng gần như hoàn toàn qủa HCMV sao chép kết quả là sự sống còn của các tế bào và sự vắng mặt của biểu thức eGFP như đánh giá bởi dòng chảy cytometry (hình 3A). Bất ngờ, không có gRNAs nhắm mục tiêu UL84 đã có hiệu quả hạn chế lây nhiễm (hình 3A). Trong các tế bào transduced với kiểm soát véc tơ hoặc vectơ mang gRNAs nhắm mục tiêu đến máy chủ lưu trữ gen, tỷ lệ phần trăm của các tế bào eGFP tích cực là tương tự như quan sát cho các tế bào untransduced (hình 3A). GRNAs nhắm mục tiêu các gen không thiết yếu HCMV US6, US7, và US11 cũng đã không can thiệp với HCMV nhân rộng. Chúng tôi đánh giá tỷ lệ trình tự HCMV tại US7 và US11 trang web mục tiêu thông qua kỹ thuật CRISPR/Cas9, và quan sát sự thay đổi tại các trang web trong 76 và 95% các trường hợp, chỉnh sửa. Điều này cho thấy rằng, mặc dù các gen bị đột biến, điều này đã không can thiệp với nhân rộng vi rút.