human hepatocyte culture intoxicate

human hepatocyte culture
intoxicated with a-amanitin
a-Amanitin (a-AMA) is the main toxin of Amanita phalloides and its subspecies (A. virosa and A. verna). The primary mechanism of a-AMA toxicity is associated with protein synthesis blocking in hepatocytes. Additionally, a-AMA exhibits prooxidant properties that may contribute to its severe hepatotoxicity. The aim of the present study was to assess the effect of a-AMA on lipid peroxidation and the activities of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) in human hepatocyte culture. The effects of benzylpenicillin (BPCN), N-acetyl-L-cysteine (ACC), and silibinin (SIL) on SOD and CAT activities and on lipid peroxidation in human hepatocyte culture intoxicated with a-AMA were also examined. In human hepatocyte culture, 48-hour expo- sure to a-AMA at a 2-mM concentration caused an increase in SOD activity, a reduction of CAT activity, and a significant increase in lipid peroxidation. Changes in SOD and CAT activity caused by a-AMA could probably enhance lipid peroxidation by increased generation of hydrogen peroxide combined with reduced detoxifica- tion of that oxygen radical. The addition of antidotes (ACC or SIL) to the culture medium provided more effective protection against lipid peroxidation in human hepatocytes intoxicated with a-AMA than the addition of BPCN, possessing no antioxidant properties.
Death cap (Amanita phalloides) and its subspecies;
death angel (Amanita virosa) and destroying angel (Amanita verna), are responsible for 95% of all mushroom-related deaths.1 The three species contain two main groups of toxins in their tissues, namely phallotoxins and amatoxins, which are both multicyc- lic peptides.Because phallotoxins are not absorbed from the gastrointestinal tract, they do not cause sys- temic manifestations of poisoning, although they may be responsible for gastrointestinal irritation. Amatox-
ins are primary human hepatotoxins. Death cap poi- soning is characterized by liver necrosis, in many
cases with acute hepatic insufficiency with subse- quent complications including hepatic coma, coagula- tion disorders, and renal failure.1-5 One medium-size specimen of death cap contains from 10 to 12 mg of amatoxins, whereas a dose as small as 0.1 mg/kg of body weight may be lethal for an adult human.6,7 a-Amanitin (a-AMA), the main amatoxin, is readilyabsorbed from the gastrointestinal tract and carried to the liver via the portal vein. Hepatocyte uptake of a-AMA is mediated by OATP1B3, a subtype of the organic anion transporting polypeptide (OATP) located in the plasma membrane.8 In hepatocytes, a-AMA inhi- bits protein synthesis by binding to RNA-polymerase II.1,9 Hepatocytes, which are dependent on a high rate of protein synthesis, are rapidly destroyed.1 According to Zheleva et al.,10 a-AMA also exhibits both antioxi- dant and prooxidant properties. In vitro and in vivo experiments on mice revealed that a-AMA may influ- ence the activities of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), enzymes crucial for the prevention of oxidative stress-related injury.10-12 These findings sup- port the hypothesis that a-AMA generates free radicals, which may contribute to its severe hepatotoxicity.10,12 However, it is uncertain what the effect of a-AMA is on the activities of enzymes protecting human hepato- cytes against oxidative stress. It is also unexplained whether changes in the redox system may play a signif- icant role in the pathogenesis of hepatic disorders in humans intoxicated with amanitin-containing mush- rooms. Benzylpenicillin (BPCN), N-acetyl-L-cysteine (ACC), and silibinin (SIL) are used as antidotes in a-AMA intoxication, but their efficacy and influence on the redox system during a-AMA intoxication is not fully established.
The purpose of this study was to assess the effect of a-AMA on lipid peroxidation (LPO) and the activities of SOD and CAT in human hepatocyte culture. The effects of BPCN, ACC, and SIL on SOD and CAT activities and on LPO in human hepatocyte culture intoxicated with a-AMA were also examined.
Materials and methods
Chemicals and materials
Media, supplements, and reagents used for hepatocyte
culture, a-AMA, and all tested antidotes were obtained from Sigma Poland Chem (a-amanitin, cat. no A2263; Benzylpenicillin/Penicillin G potassium salt, cat. no P7794; N-acetyl-L-cysteine, cat. no A9165; Silibinin, cat. no. S0417). Fresh, single donor human hepatocytes plated in 6-well culture plates were obtained from Lonza, Belgium (batch no. HE0911101
Hepatocyte culture
All experiments were approved by the Local Ethics
Commission at Wrocław Medical University. After

2 hours of initial incubation, the shipping medium was substituted with defined culture medium consist- ing of Earle's balanced salt solution (EBSS) and Waymouth's 752/1 supplemented with 10% foetal bovine serum (FBS). Following another 12 hours of incubation, the medium was exchanged and the pri- mary hepatocyte culture were maintained for 48 hours with a-AMA and/or the tested antidotes (ACC, BPCN, SIL) in the following final concentrations: control group - hepatocytes received medium without a-AMA or antidotes; group AMA: a-amanitin (2 mM); group BPCN: benzylpenicyllin (1 mM); group ACC: N-acetyl-L-cysteine (1 mM); group SIL: silibinin
(100 mM); group AMA þ BPCN: a-amanitin (2 mM)
þ benzylpenicyllin (1 mM); group AMA þ ACC: a-amanitin (2 mM) þ N-acetyl-L-cysteine (1 mM); and group AMA þ SIL: a-amanitin (2 mM) þ silibinin
(100 mM). a-AMA was used at a concentration caus-
ing a reduction in cell viability in human hepatocyte cultures.13,14 The BPCN concentration corresponded to its plasma levels obtained after the dosage recom- mended in therapy of toadstool death cap poisoning, that is 300,000 - 1,000,000 U/kg/day intravenously (i.v.).1,15 There are no reports on a standard dosage regimen of ACC in mushroom poisoning. Therefore, we tested ACC in concentrations corresponding to its plasma levels obtained after the recommended dosage during the treatment of acetaminophen toxicity.16 SIL was used at concentrations corresponding to its
therapeutic plasma levels.17,18 In the AMA þ BPCN,
AMA þ ACC, and AMA þ SIL groups, hepatocytes
were simultaneously exposed to a-AMA and tested
antidotes.
SOD and CAT activity and the concentration of malonyldialdehyde (MDA) were determined in super- natants isolated from cultured hepatocyte homogenates after 48 hours of exposure to a-AMA and/or tested antidotes.

Analytical methods
SOD activity was determined using assay kits pro-
cured from Cayman Chemical Company (cat no. 706002). The assay was based on the generation of
O2- in a system containing xanthine oxidase. O2-
reduces tetrazolium salt to formazan dye, which is
measured colorimetrically. One unit of SOD activity is defined as the amount of enzyme needed to exhibit 50% dismutation of the superoxide radical.
CAT activity was determined using a Catalase Assay Kit (Cayman Chemical Company, cat. no
707002). This assay kit utilizes the peroxidatic function of CAT. The method is based on the reaction of the enzyme with methanol. Formaldehyde produced from methanol is measured colorimetrically with 4- amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4 triazole as a chromogen. One unit of CAT activity is defined as the amount of enzyme leading to the formation of 1.0 nmol of formaldehyde per minute.
Total amount of LPO products in the supernatants was determined as the concentration of malonyldial- dehyde (MDA) using an MDA Colorimetric Asssay Kit (Oxis International Inc., cat. no 21044). SOD and CAT activities and the concentration of MDA were determined using a plate reader (Microplate Reader, TECAN M200). CAT and SOD activities were expressed as enzyme units per mg of total protein and MDA concentration was expressed as nmol of MDA per mg of total protein. Total protein concentration in hepatocyte homogenates was determined by a Total Protein Assay Kit (Sigma Poland Chem. cat. no TP0200).


Statistical analysis
Differences between values were analyzed by
Kruskal-Wallis test using Statistica 7.1 software (Stat Soft, Poland) and p < 0.05 was considered statistically significant.
Results
SOD activity in the AMA group was significantly
higher than in the control group. In groups AMA þ
BPCN, AMA þ ACC, and AMA þ SIL, SOD activity
was significantly higher than in the control, but signif-
icantly lower than in the AMA group. No differences
in SOD activity were found between groups AMA þ
BPCN, AMAþACC, and AMAþSIL (Figure 1).
CAT activity in the AMA group was significantly
lower than in the control. In groups AMA þ BPCN,
AMA þ ACC, and AMA þ SIL, CAT activity was
significantly lower than in the control, but signifi-
cantly higher than in the AMA group. No differences
in CAT activity were found between groups AMA þ
BPCN, AMA þ ACC, and AMA þ SIL (Figure 2).
A significantly higher MDA concentration was
found in the AMA group than in the control, AMA
þ ACC, and AMA þ SIL groups. MDA concentration
in the AMA þ BPCN group was not significantly dif-
ferent from its concentration in the AMA group. In
groups AMA þ ACC and AMA þ SIL, MDA concen-
tration was not significantly different from that in the
control group and was significantly lower than in the
AMA þ BPCN group (Figure 3).
In groups BPCN, ACC, and SIL, values of the eval-
uated parameters of the redox system were not signif- icantly different from those in the control group (data not shown).


Discussion
a-AMA is a bicyclic octapeptide. The bicyclic struc-
ture and the presence of a tryptathionine moiety are critical for amanitin's toxicity.19 The primary mechanism of a-AMA toxicity is associated with pro- tein synthesis blocking in hepatocytes. Additionally, a-AMA toxicity may be associated with its potential direct prooxidative effect. Experimental studies by Zhelev, et al.20 suggest that a-AMA may be trans- formed to free radical intermediates (phenoxyl and/ or sulfinyl radicals) and

Kết quả (Việt) 2:

văn hóa tế bào gan của con người
say sưa với a-amanitin
a-Amanitin (a-AMA) là các độc tố chính của Amanita phalloides và phân loài của nó (A. virosa và A. Verna). Cơ chế chính của một-AMA độc tính được liên kết với sự tổng hợp protein trong tế bào gan chặn. Ngoài ra, một-AMA hiện thuộc tính prooxidant có thể góp phần độc gan nghiêm trọng của nó. Mục đích của nghiên cứu này là để đánh giá hiệu quả của một-AMA trên peroxy lipid và các hoạt động của superoxide dismutase (SOD) và catalase (CAT) trong văn hóa tế bào gan của con người. Những ảnh hưởng của benzylpenicillin (BPCN), N-acetyl-L-cysteine ​​(ACC), và SILYBIN (SIL) về hoạt động SOD và CAT và lipid peroxy trong văn hóa tế bào gan của con người say sưa với một-AMA cũng đã được kiểm tra. Trong văn hóa tế bào gan của con người, 48 giờ Nhiễm chì chắc chắn một-AMA ở nồng độ 2 mM gây ra sự gia tăng trong hoạt động SOD, giảm hoạt động CAT, và một sự gia tăng đáng kể trong lipid peroxy. Những thay đổi trong SOD và CAT hoạt động gây ra bởi một-AMA có thể có thể tăng cường lipid peroxy bởi tăng thế hệ của hydrogen peroxide kết hợp với giảm tion detoxifica- của oxy gốc tự do. Việc bổ sung các thuốc giải độc (ACC hoặc SIL) vào môi trường văn hóa cung cấp bảo vệ hiệu quả hơn chống lipid peroxy trong tế bào gan người say sưa với một-AMA hơn việc bổ sung BPCN, sở hữu không có tính chống oxy hóa.
cap Death (Amanita phalloides) và phân loài của nó;
chết thiên thần (Amanita virosa) và phá hủy thiên thần (Amanita Verna), chịu trách nhiệm 95% của tất cả các nấm liên quan đến deaths.1 Ba loài chứa hai nhóm chính của các chất độc trong các mô của họ, cụ thể là phallotoxins và amatoxins, mà là cả hai lic multicyc- peptides.Because phallotoxins không được hấp thu qua đường tiêu hóa, chúng không gây ra các biểu hiện Temic thống của ngộ độc, mặc dù họ có thể chịu trách nhiệm cho sự kích thích tiêu hóa. Amatox-
ins là độc tố gan của con người chính. Cap chết soning poi- được đặc trưng bởi hoại tử gan, trong nhiều
trường hợp suy gan cấp tính với các biến chứng quent subse- bao gồm hôn mê gan, rối loạn tion coagula-, và thận failure.1-5 mẫu One vừa kích thước của nắp cái chết có chứa từ 10 đến 12 mg amatoxins, trong khi một liều nhỏ như 0,1 mg / kg trọng lượng cơ thể có thể gây tử vong cho một người trưởng thành human.6,7 a-Amanitin (a-AMA), các amatoxin chính, được readilyabsorbed qua đường tiêu hóa và mang đến gan qua tĩnh mạch cửa. Hấp thu tế bào gan của một-AMA được trung gian bởi OATP1B3, một subtype của các anion hữu cơ vận chuyển polypeptide (OATP) nằm trong membrane.8 plasma Trong tế bào gan, a-AMA bit inhi- tổng hợp protein bằng cách gắn vào RNA polymerase-II.1, 9 tế bào gan, mà phụ thuộc vào tỷ lệ cao trong tổng hợp protein, đang nhanh chóng destroyed.1 Theo Zheleva et al., 10 a-AMA cũng trưng bày cả dant chất chống oxy hóa và các thuộc tính prooxidant. In vitro và in vivo các thí nghiệm trên chuột cho thấy một-AMA thể influ- khoa các hoạt động của superoxide dismutase (SOD) và catalase (CAT), enzyme quan trọng trong việc ngăn ngừa oxy hóa liên quan đến stress injury.10-12 Những phát hiện sup- cổng giả thuyết rằng một-AMA tạo ra các gốc tự do, trong đó có thể góp phần vào hepatotoxicity.10,12 nghiêm trọng của nó Tuy nhiên, nó là không chắc chắn những gì hiệu quả của một-AMA là về các hoạt động của các enzym bảo vệ cytes gan con người chống lại stress oxy hóa. Nó cũng là không giải thích được liệu những thay đổi trong hệ thống oxi hóa khử có thể đóng một vai trò signif icant trong bệnh sinh của rối loạn gan ở người say sưa với phòng mush- amanitin chứa. Benzylpenicillin (BPCN), N-acetyl-L-cysteine ​​(ACC), và SILYBIN (SIL) được sử dụng như thuốc giải độc trong một-AMA nhiễm độc, nhưng hiệu quả và ảnh hưởng của họ trên hệ thống oxi hóa khử trong một-AMA nhiễm độc không được thành lập hoàn toàn.
Mục đích của nghiên cứu này là đánh giá hiệu quả của một-AMA trên lipid peroxy (LPO) và các hoạt động của SOD và CAT trong văn hóa tế bào gan của con người. Những ảnh hưởng của BPCN, ACC, và SIL về hoạt động SOD và CAT và LPO trong văn hóa tế bào gan của con người say sưa với một-AMA cũng đã được kiểm tra.
Vật liệu và phương pháp
Hóa chất và vật liệu
Media, bổ sung, và các thuốc thử sử dụng cho các tế bào gan
văn hóa, một-AMA , và tất cả các thuốc giải độc thử nghiệm đã thu được từ Sigma Ba Lan Chem (a-amanitin, mèo không A2263;. benzylpenicillin / Penicillin G muối kali, mèo không P7794;.. N-acetyl-L-cysteine, mèo không A9165; SILYBIN, mèo. không có. S0417). Fresh, đơn bào gan người hiến mạ tấm văn hóa-6 cũng đã thu được từ Lonza, Bỉ (batch không. HE0911101
văn hóa tế bào gan
Tất cả các thí nghiệm đã được sự chấp thuận của Đạo đức địa phương
Ủy ban tại Đại học Y khoa Wrocław. Sau 2 giờ ủ ban đầu, các phương tiện vận chuyển được thay thế bằng văn hóa được xác định vừa ing consist- dung dịch muối cân bằng Earle (EBSS) và Waymouth của 752/1 bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò (FBS). Sau vòng 12 giờ ủ, các phương tiện đã được trao đổi và các tế bào gan mary tiên văn hóa được duy trì trong 48 giờ với một-AMA và / hoặc các thuốc giải độc được thử nghiệm (ACC, BPCN, SIL) ở nồng độ thức sau: nhóm chứng - các tế bào gan đã nhận được trung bình mà không có một-AMA hoặc các thuốc giải độc; nhóm AMA: a-amanitin (2 mM); nhóm BPCN: benzylpenicyllin (1 mM); nhóm ACC: N-acetyl-L-cysteine ​​(1 mM); nhóm SIL: SILYBIN (100 mM); nhóm AMA þ BPCN: a-amanitin (2 mM) þ benzylpenicyllin (1 mM); nhóm AMA þ ACC: a-amanitin (2 mM) þ N-acetyl-L-cysteine ​​(1 mM); và nhóm AMA þ SIL: a-amanitin (2 mM) þ SILYBIN (100 mM). a-AMA đã được sử dụng ở nồng độ caus- ing giảm khả năng di động trong tế bào gan người cultures.13,14 Nồng BPCN tương ứng với nồng độ của nó đạt được sau khi các nghị liều vá trong điều trị ngộ độc thứ nấm mũ tử vong, đó là 300.000 - 1.000.000 U / kg / ngày tiêm tĩnh mạch (iv) .1,15 Không có báo cáo về một liều lượng tiêu chuẩn của ACC trong ngộ độc nấm. Do đó, chúng tôi thử nghiệm ACC ở nồng độ tương ứng với nồng độ của nó đạt được sau khi đề nghị liều dùng trong điều trị các acetaminophen toxicity.16 SIL đã được sử dụng ở nồng độ tương ứng với nó levels.17,18 plasma điều trị Trong þ AMA BPCN, AMA þ ACC, và nhóm SIL AMA þ, tế bào gan đã đồng thời tiếp xúc với một-AMA và thử nghiệm thuốc giải độc. SOD và hoạt động CAT và nồng độ của malonyldialdehyde (MDA) đã được xác định trong natants siêu phân lập từ tế bào gan homogenates nuôi sau 48 giờ tiếp xúc với một-AMA và / hoặc các thuốc giải độc được thử nghiệm. phương pháp phân tích hoạt động SOD được xác định bằng cách sử dụng bộ dụng cụ xét nghiệm trình chữa khỏi từ Công ty Hoá chất Cayman (mèo không có. 706.002). Xét nghiệm này được dựa trên các thế hệ của O2- trong một hệ thống có chứa xanthine oxidase. O2- giảm tetrazolium muối để formazan thuốc nhuộm, mà được đo colorimetrically. Một đơn vị hoạt động SOD được định nghĩa là lượng enzyme cần thiết để triển lãm 50% dismutation của superoxide triệt để. Hoạt động CAT đã được xác định bằng cách sử dụng một Kit catalase Assay (Công ty Hoá chất Cayman, mèo. Không 707.002). Kit xét nghiệm này sử dụng các chức năng peroxidatic của CAT. Phương pháp này dựa trên phản ứng của enzyme với methanol. Formaldehyde được sản xuất từ methanol được đo colorimetrically 4- amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4 triazole như một thể nhiễm sắc. Một đơn vị hoạt động CAT được định nghĩa là lượng enzyme dẫn đến sự hình thành của 1,0 nmol của formaldehyde mỗi phút. Tổng số tiền của sản phẩm LPO trong nước nổi đã được xác định là nồng độ của dehyde malonyldial- (MDA) sử dụng một Kit MDA đo màu Asssay (Oxis International Inc., mèo. Không 21.044). SOD và hoạt động CAT và nồng độ của MDA đã được xác định bằng cách sử dụng một đầu đọc đĩa (Microplate Reader, TECAN M200). Hoạt động CAT và SOD được thể hiện bằng đơn vị mg mỗi enzyme của protein tổng số và nồng độ MDA đã được thể hiện như nmol của MDA mỗi mg protein tổng số. Tổng nồng độ protein trong tế bào gan homogenates được xác định bằng một Total Protein Assay Kit (Sigma Ba Lan Chem mèo.. Không TP0200). Phân tích thống kê khác biệt giữa các giá trị đã được phân tích bởi Kruskal-Wallis test bằng phần mềm Statistica 7.1 (Stat Soft, Ba Lan) và p < 0,05 được coi là đáng kể về mặt thống kê. Kết quả hoạt động SOD trong nhóm AMA có ý nghĩa cao hơn so với nhóm kiểm soát. Trong nhóm AMA þ BPCN, AMA þ ACC, và AMA þ SIL, hoạt động SOD là cao hơn trong việc kiểm soát đáng kể, nhưng signif- icantly thấp hơn so với nhóm AMA. Không có sự khác biệt trong hoạt động SOD được tìm thấy giữa các nhóm AMA þ BPCN, AMAþACC, và AMAþSIL (Hình 1). Hoạt động CAT trong nhóm AMA là đáng kể thấp hơn trong việc kiểm soát. Trong nhóm AMA þ BPCN, AMA þ ACC, và AMA þ SIL, hoạt động CAT là thấp hơn trong việc kiểm soát đáng kể, nhưng kể đáng cao hơn so với nhóm AMA. Không có sự khác biệt trong hoạt động CAT đã được tìm thấy giữa các nhóm AMA þ BPCN, AMA þ ACC, và AMA þ SIL (Hình 2). Nồng độ MDA cao hơn đáng kể đã được tìm thấy trong các nhóm AMA hơn trong việc kiểm soát, AMA þ ACC, và AMA þ SIL nhóm. Nồng độ MDA trong nhóm BPCN các þ AMA là không đáng kể nhau ferent từ nồng độ của nó trong nhóm AMA. Trong nhóm AMA þ ACC và AMA þ SIL, MDA nồng nồng không khác biệt đáng kể từ đó trong nhóm kiểm soát và thấp hơn đáng kể ở nhóm BPCN þ AMA (Hình 3). Trong nhóm BPCN, ACC, và SIL, giá trị của eval- thông số uated của hệ thống oxi hóa khử không signif- icantly khác nhau từ những người trong nhóm kiểm soát (dữ liệu không hiển thị). Thảo luận một-AMA là một octapeptide bicyclic. Các cấu bicyclic ture và sự hiện diện của một phân nưa tryptathionine rất quan trọng cho nhân amanitin toxicity.19 Cơ chế chính của một-AMA độc tính được liên kết với sự tổng hợp TEIN trình chặn trong tế bào gan. Ngoài ra, một-AMA độc tính có thể được kết hợp với hiệu ứng prooxidative trực tiếp tiềm năng của nó. Nghiên cứu thực nghiệm bởi Zhelev, et al.20 cho thấy một-AMA có thể được thành lập để xuyên trung gian gốc tự do (phenoxyl và / hoặc gốc sulfinyl) và