30 Journal of Science Ho Chi Minh C

30 Journal of Science Ho Chi Minh City Open University – No. 1(13) 2015- February/2015
EGFR AND K-RAS IN MOLECULARLY TARGETED THERAPY:
FROM IN SILICO TO IN VITRO STUDY
Lieu Chi Hung1, Lao Duc Thuan2, Le Huyen Ai Thuy2
1
Tay Ninh Hospital, Viet Nam
2
Ho Chi Minh City Open University
Email: [e-mail]
(Received: 23/01/2015; Revised: 26/01/2015; Accepted: 03/02/2015)
ABSTRACT
Molecularly targeted therapy is a new type of cancer treatment which uses monoclonalantibodies or small substances to identify and attack cancer cells, except normal cell. This has
more advantages than classical treatments. EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) and Kras (Kirsten-ras) are considered as two well molecular-targeted agent.
In present study, we performed a systematic literature review in NCBI and computed
average frequencies of EGFR and K-ras mutations in some common cancers. According to data
analysis, we conclude that global published mutations which belong to these genes neither
exclude each other nor associate with factors of race. We successfully designed and evaluated
(1) primers for detection of EGFR and K-ras mutations by PCR-sequencing; (2) primer/probe
sets are used for detection of the most seven common K-ras mutations by Allele-Specific-Realtime PCR (AS-Real-time PCR) as well as Allele-Specific PCR. Due to initial experimental
results, an appropriate DNA extraction procedure from FFPE (Formalin-Fixed, ParaffinEmbedded) samples and optimal Tm for each primer couple of amplified mutation, containing
regions on K-ras have been drawn. Results of K-ras mutation on colorectal cancer patients
obtained from Tay Ninh Province, Viet Nam was firstly detected by using PCR-sequencing
methods, then, confirmed by AS-Real-Time PCR.
Keywords: EGFR, K-RAS, colorectal cancer, PCR-sequencing, Allele-Specific Real-time PCR.
1. Introduction
Targeted therapy is a new progressive
technology in the field of internal cancer
treatment; it is relied on the application of
research achievements in molecular biology
(Sawyers C, 2004). This new treatment has
more advantages. The drugs, which are used in
this therapy, tend to be less toxic and site
effects to non-cancerous cells while cancer
cells are treated. Due to this intervene into
special molecules which are directly relevant
to tumorigenesis mechanism and proliferation
of tumors, this molecular is called “molecular
targets” and this therapy is called “molecularly
targeted therapies” or “targeted therapies”.
One of “molecular target”, the first target
for this therapy, is EGFR (Epidermal Growth
Factor Receptor). It is glycoprotein, the cellsurface receptor for members of the epidermal
growth factor family (EGF-family) of
extracellular protein ligands. Its function is
tyrosine kinase, which exists on cell signaling
and proliferation (Francoual et al, 2006). It is
found that overexpression of EGFR is
observed in many cancers (Nicholson et al,
2001). For this reason, the new therapy
focuses on inhibiting the active of protein
EGFR (Mendelsohn, 2002). Nowadays, two
group of medicines effect on the target of
EGFR are Tyrosine Kinase Inhibitors (TKIs),
for examples: Erlotinib (Tarceva, Roche), and
and in molecularly targeted therapy: from to study 31
monoclonal antibodies such as cetiximad
(ErbituxTM, Bristol Myers Squibb and Merck
KgaA), Pantitumumab (VectibixTM, Amgen)
(Mendelsohn, 2002).
The basic for selection of personalized
drug is screening of mutations on EGFR gene.
If mutations, especially in the translated
regions for EGFR gene’s tyrosine kinase, are
detected, TKIs will be used for treatment
(Blanke, 2005, Tsao et al, 2005). Other nomutated cases will be directly instructed in
using antibodies resist EGFR such as
Cetuximab hoặc Panitumumab (Mendelsohn,
2002).
Alternatively, the signal transduction of
EGFR is RAS/RAF/MAPK pathway in which
K-ras is important protein of this axis.
(Karapetis et al, 2008). The activity of normal
K-ras is depended on activity of EGFR
receptor. However, K-ras protein is changed to
be EGFR-independent if there are mutations on
K-ras gene (The signal for proliferation and
differentiation of cells also continuously
transmitted) (Karapetis et al, 2008). Besides,
patients are directly instructed to take the
treatment with Catuximab and Panitumumab
antibodies, it is necessary to have a screening
on the mutation on K-ras gene whether or not.
The reason is these antibodies only have affect
on patient without mutations on K-ras
(Benvenuti et al., 2007; Amado et al., 2008;
Karapetis et al., 2008; Jönsson et al., 2009). In
some common cancer such as colorectal cancer,
lung cancer, breast cancer, esophageal cancer…
It is reported that either EGFR or K-ras with
their mutations led to the disruptions of gene
functions (Kwak E.L, 2006; Yunxia Z, 2010)
To sum up, it is necessary to have more
researches on EGFR and K-ras mutations such
as frequent mutated regions, mutation types,
methods and techniques for detecting… in
order to have more applications on targeted
therapies for cancers treatment in Vietnam.
These also are the targets of our studies.
2. Materials and methods
Clinical samples collection
In present study, 19 colorectal cancer
specimens were collected from Tay Ninh
Hospital, Vietnam from January, 2007 to May,
2011. Samples were embedded in paraffin and
kept in -30oC before further used.
Data mining, primer designed and
DNA isolation
Data was collected on Pubmed by using
different key words in order to study types of
mutations on two gene EGFR and K-ras.
Then, weighted average frequency was
calculated to determine prominent mutations.
Simultaneously, ANOVA analysis was carried
out to evaluate the correlation between
mutations and racial factors.
EGFR and K-ras sequences were
collected from Genbank (NCBI), and primers
for PCR were designed to detect promient
mutations of EGFR and K-ras. Primer
parameters were evaluated by several online
bioinformatics tools such as BLAST
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/), IDT analyzer
(www.idtdna.com/analyzer/Applications/Oligo
Analyzer/), Primer Express, Annhyb,
BatchPrimer 3
(http://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/).
DNA extraction was isolated by using
Phenol/Chloroform method (Sacchi, 1987).
Because samples were embedded in paraffin, it
was necessary to disintegrate paraffin by using
xylene solution.
PCR-sequencing and Allele-Specific
Real-time PCR
The amplifications were done in a total
volume of 15l, reaction was subjected to
initial incubation at 95oC for 5 min, followed
by 40 cycles at 95oC for 30s, XoC for 30s (X
was the annealing temperature of
corresponding with each primer) , 72oC for 30s
and 72oC for 6 min for final incubation. PCR
products were directly performed sequencing
in Macrogen Co. (Korea).
3. Results and methods
Data mining
We systematically reviewed more than
40 studies which related to analysis of
mutations on EGFR and K-ras of five types of
32 Journal of Science Ho Chi Minh City Open University – No. 1(13) 2015- February/2015
cancer. In our revision, we found that paraffin
embedded tissues were used more commonly
(60% on the studies of EGFR and 67.27% on
K-ras) than fresh tissues and frozen tissues.
About the technique for detecting mutations,
Sanger sequencing method was more
commonly used than (54.05% on EGFR and
60.29% on K-ras) another methods such as
Real-time PCR, COLD (Co-amplification at
lower denaturation temp) PCR. Moreover,
besides the characteristic of method’s
sensitivity, we considered the main factor
affected the sensitivity which was the
proportion of cancer cells presented in
samples. Hence, the percentage of mutant cells
in sample must to be greater than 70%, in
contract, the samples would be eliminated.
For the aim to have a general revision
about mutations on EGFR and K-ras, the
weighted average frequencies were calculated.
As the results, we concluded that (1) K-ras
gene existed 7 prominent mutations, which
were G12D, G12V, G13D, G12S, G12C,
G12A, G12R; (2) EGFR gene existed 2
mutations with high frequencies which were
L858R on exon 21 and gene deletion E746 –
A750 on exon 19; (3) there was rarely mutant
EGFR and almost no sense on colorectal
cancer.
According to statistical analysis, there
were no significant differences among various
local population when making a comparison
on K-ras and EGFR mutations (Table 1).
Furthermore, we considered that types of
mutation on each gene did not exclude each
other. This statement was similar to the study
of Sun and at el (2011).
Table 1. Sample’s statistic and parameter ANOVA on different types of prominent
mutation
7 prominent mutations on K-ras of colorectal cancer
Total sample
with K-ras
mutation
Europe American Asia F P value F crit Comment
1605 1052 158
No
significant
differences
at α = 5%
G12D 546 338 69 1.957671 0.234331 7.708647
G12V 358 234 38 2.845997 0.166877 7.708647
G13D 311 217 30 3.067208 0.154773 7.708647
G12C 137 100 6 4.100888 0.112845 7.708647
G12S 108 73 5 4.299204 0.106812 7.708647
G12A 90 59 3 4.417707 0.103439 7.708647
G12R 20 7 0 4.858892 0.092211 7.708647
2 prominent mutations on EGFR of non-small cell lung cancer
Total
sample
with
EGFR
mutation
Australia Europe America Asia F P value F crit Comment
75 39 133 311
No
significant
differences
at α = 5%
L858R 13 15 40 103 2.29202 0.180811 5.987378
E746-
A750 29 1 18 93 2.685696 0.152365 5.987378
and in molecularly targeted therapy: from to study 33
In silico study and PCR-sequencing
primer designed
As mention at the introduction, in the
RAS/RAF/MAPK signal pathway, if the K-ras
was mutant, K-ras protein is EGFRindependent activated. For the therapy using
Catuximab and Panitumumab antibodies
applied on colorectal cancer patient, it is
necessary to detect there was no any mutation
on K-ras, otherwises, (in the patient with
mutant K-ras), the 30 Journal of Science Ho Chi Minh City Open University – No. 1(13) 2015- February/2015
EGFR AND K-RAS IN MOLECULARLY TARGETED THERAPY:
FROM IN SILICO TO IN VITRO STUDY
Lieu Chi Hung1, Lao Duc Thuan2, Le Huyen Ai

Kết quả (Việt) 1:

30 tạp chí khoa học thành phố Hồ Chí Minh Đại học mở-số 1(13) 2015-tháng hai/2015EGFR VÀ K-RAS TRONG PHÂN TỬ ĐƯỢC NHẮM MỤC TIÊU TRỊ LIỆU:TỪ IN SILICO ĐỂ TRONG ỐNG NGHIỆM NGHIÊN CỨULieu chí Hung1, Lào Đức Thuan2, Le Huyen Ai Thuy21Tây Ninh Hospital, Việt Nam2Đại học mở TP. Hồ Chí MinhThư điện tử: [e-mail](Nhận được: 23/01/năm 2015; Sửa đổi: 26/01/2015; Chấp nhận: 03/02/2015)TÓM TẮTPhân tử được nhắm mục tiêu điều trị là một loại mới của điều trị ung thư mà sử dụng monoclonalantibodies hoặc nhỏ chất để xác định và tấn công các tế bào ung thư, ngoại trừ các tế bào bình thường. Điều này cóthuận lợi hơn so với phương pháp điều trị cổ điển. EGFR (biểu bì thụ thể yếu tố tăng trưởng) và Kras (Kirsten-ras) được coi là hai đại lý cũng phân tử nhắm mục tiêu.Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi thực hiện một đánh giá hệ thống văn học trong NCBI và tính toántần số trung bình của EGFR và K-ras đột biến ở một số bệnh ung thư phổ biến. Theo dữ liệuphân tích, chúng tôi kết luận rằng toàn cầu xuất bản đột biến mà thuộc về những gen khôngloại trừ lẫn nhau hoặc kết hợp với các yếu tố thuộc chủng tộc nào. Chúng tôi đã thiết kế và đánh giá(1) lớp lót cho các phát hiện của đột biến EGFR và K-ras bởi Đảng Cộng sản Romania-trình tự; (2) mồi/thăm dòbộ được sử dụng để phát hiện các đột biến hầu hết Bảy phổ biến K-ras Allele cụ thể thời gian thực Đảng Cộng sản Romania (PCR AS-Real-time) cũng như dành riêng cho Allele PCR. Do ban đầu thử nghiệmkết quả, một thủ tục khai thác thích hợp DNA từ FFPE (Formalin cố định, ParaffinEmbedded) mẫu và Tm tối ưu cho mỗi cặp vợ chồng mồi của khuếch đại đột biến, cócác khu vực trên K-ras đã được rút ra. Kết quả của đột biến K-ras trên bệnh nhân ung thư đại-trực tràngthu được từ tỉnh Tây Ninh, Việt Nam thứ nhất được phát hiện bằng cách sử dụng trình tự PCRphương pháp, sau đó, xác nhận bởi Đảng Cộng sản Romania AS-Real-Time.Từ khóa: EGFR, K-RAS, ung thư đại-trực tràng, Đảng Cộng sản Romania-trình tự, Allele cụ thể thời gian thực Đảng Cộng sản Romania.1. giới thiệuNhắm mục tiêu điều trị là một tiến bộ mớicông nghệ trong lĩnh vực của ung thư nội bộđiều trị; nó được dựa trên các ứng dụng củanhững thành tựu nghiên cứu trong sinh học phân tử(Sawyers C, năm 2004). Điều trị mới này cóthuận lợi hơn. Các loại thuốc, được sử dụng trongliệu pháp này, có xu hướng ít độc hại và trang webảnh hưởng đến các tế bào ung thư không trong khi ung thưtế bào đang được điều trị. Do đó can thiệp vàophân tử đặc biệt có liên quan trực tiếptumorigenesis cơ chế và sự gia tăngcác khối u, phân tử này được gọi là "phân tửmục tiêu"và liệu pháp này được gọi là"phân tửphương pháp điều trị được nhắm mục tiêu"hoặc"phương pháp điều trị được nhắm mục tiêu".Một trong "mục tiêu phân tử", mục tiêu đầu tiênĐối với phương pháp này, là EGFR (tăng trưởng biểu bìThụ thể yếu tố). Nó là glycoprotein, các thụ thể cellsurface cho các thành viên của các biểu bìgia đình nhân tố tăng trưởng (EGF-gia đình) củangoại bào protein ligand. Chức năng của nó làtyrosine kinase, mà tồn tại trên tế bào tín hiệuvà phổ biến vũ khí (Francoual và ctv., 2006). Nó làtìm thấy rằng tế EGFR làquan sát thấy ở nhiều bệnh ung thư (Nicholson et al,Năm 2001). vì lý do này, điều trị mớitập trung vào các hoạt động của protein ức chếEGFR (Mendelsohn, 2002). Ngày nay, haiNhóm các loại thuốc có hiệu lực vào mục tiêu củaEGFR là Tyrosine Kinase ức chế (TKIs),Ví dụ: Erlotinib (Tarceva, Roche), vàvà trong phân tử được nhắm mục tiêu trị liệu: từ nghiên cứu 31Monoclonal kháng thể chẳng hạn như cetiximad(ErbituxTM, Bristol Myers Squibb và MerckKgaA), Pantitumumab (VectibixTM, Amgen)(Mendelsohn, 2002).Cơ bản cho lựa chọn của cá nhân hoáma túy chiếu của đột biến gen EGFR trên.Nếu đột biến, đặc biệt là trong các dịchđể EGFR gen của tyrosine kinase, làphát hiện, TKIs sẽ được sử dụng để điều trị(Blanke, 2005, Tsao et al, 2005). Trường hợp nomutated khác sẽ được hướng dẫn trực tiếp trongsử dụng kháng thể chống EGFR nhưCetuximab hoặc Panitumumab (Mendelsohn,năm 2002).Ngoài ra, dẫn truyền tín hiệu củaEGFR là chương trình pathway RAS/RAF/MAPK trong đóK-ras là quan trọng protein của trục này.(Karapetis et al, 2008). Các hoạt động bình thườngK-ras phụ thuộc vào hoạt động của EGFRthụ thể. Tuy nhiên, K-ras protein được thay đổi đểlà độc lập EGFR nếu không có đột biến trênK-ras gen (tín hiệu cho phổ biến vũ khí vàsự khác biệt của các tế bào cũng liên tụctruyền) (Karapetis et al, 2008). Bên cạnh đó,bệnh nhân được trực tiếp hướng dẫn để có cácđiều trị với Catuximab và Panitumumabkháng thể, nó là cần thiết để có một kiểm tratrên đột biến K-ras gen trên hay không.Lý do là các kháng thể chỉ có ảnh hưởng đếntrên các bệnh nhân mà không có đột biến trên K-ras(Benvenuti et al., 2007; Amado et al., năm 2008;Karapetis et al., năm 2008; Jönsson et al., 2009). Ởmột số bệnh ung thư phổ biến như ung thư đại-trực tràng,ung thư phổi, ung thư vú, ung thư thực quản...Đây là báo cáo mà EGFR hoặc K-ras vớiđột biến của họ đã dẫn đến sự gián đoạn của genchức năng (Kwak E.L, năm 2006; Yunxia Z, 2010)Tổng kết, nó là cần thiết để có nhiều hơn nữanghiên cứu về EGFR và K-ras đột biến như vậynhư thường xuyên đột biến vùng, đột biến loại,phương pháp và kỹ thuật để phát hiện... trongđể có thêm các ứng dụng trên nhắm mục tiêu nhấtphương pháp điều trị cho bệnh ung thư điều trị tại Việt Nam.Đây cũng là mục tiêu của nghiên cứu của chúng tôi.2. tài liệu và phương phápLâm sàng mẫu bộ sưu tậpTrong nghiên cứu hiện nay, ung thư ruột già 19mẫu vật được thu thập từ Tây NinhBệnh viện, Việt Nam từ tháng 1, năm 2007 đến tháng,2011. mẫu được nhúng trong parafin vàgiữ trong - 30oC trước khi tiếp tục sử dụng.Khai thác dữ liệu, mồi được thiết kế vàCô lập DNADữ liệu được thu thập trên Pubmed bằng cách sử dụngtừ khóa khác nhau để nghiên cứu các loạiđột biến trên hai gene EGFR và K-ras.Sau đó, tần số trung bình trọng đãtính toán để xác định đột biến nổi bật.Đồng thời, ANOVA phân tích được thực hiệnra để đánh giá sự tương quan giữađột biến và chủng tộc yếu tố.EGFR và K-rasthu thập từ Genbank (NCBI), và lớp lótcho Đảng Cộng sản Romania được thiết kế để phát hiện promientđột biến của EGFR và K-ras. Chất mồi đệmtham số được đánh giá bởi một số trực tuyếncông cụ tin sinh học như vụ nổ(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/), phân tích IDT(www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoPhân tích /), mồi Express, Annhyb,BatchPrimer 3(http://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/).Khai thác DNA đã được cô lập bằng cách sử dụngPhenol/cloroform các phương pháp (Sacchi, 1987).Bởi vì mẫu được nhúng trong parafin, nólà cần thiết để tan rã parafin bằng cách sử dụnggiải pháp Xylen.Đảng Cộng sản Romania-trình tự và dành riêng cho AlleleĐảng Cộng sản Romania thời gian thựcCác amplifications đã được thực hiện trong tổng cộngkhối lượng của 15l, phản ứng đã phải chịu đểCác ấp trứng đầu tiên tại 95oC cho 5 phút, sau đó làbởi 40 chu kỳ tại 95oC cho độ tuổi 30, XoC cho độ tuổi 30 (Xlà nhiệt độ tôi củatương ứng với mỗi mồi), 72oC cho độ tuổi 30và 72oC cho 6 phút để làm phẳng ủ bệnh cuối cùng. ĐẢNG CỘNG SẢN ROMANIAsản phẩm đã được trực tiếp thực hiện xác định trình tựMacrogen co. (Hàn Quốc).3. kết quả và phương phápKhai thác dữ liệuChúng tôi có hệ thống xem xét nhiều hơn40 nghiên cứu trong đó liên quan đến phân tíchđột biến trên EGFR và K-ras của năm loại32 tạp chí khoa học thành phố Hồ Chí Minh Đại học mở-số 1(13) 2015-tháng hai/2015ung thư. Trong phiên bản của chúng tôi, chúng tôi tìm thấy rằng dầu thô paraffinnhúng mô đã được sử dụng thường(60% trên các nghiên cứu của EGFR và 67.27% vàoK-RAS) hơn tươi mô và đông lạnh mô.Về kỹ thuật để phát hiện các đột biến,Phương pháp sắp xếp Sanger thêmsử dụng phổ biến hơn (54.05% trên EGFR và60.29% trên K-ras) các phương pháp khác chẳng hạn nhưThời gian thực PCR, lạnh (đồng khuếch đại tạithấp hơn denaturation temp) Đảng Cộng sản Romania. Hơn nữa,bên cạnh việc đặc trưng của phương phápnhạy cảm, chúng tôi xem xét các yếu tố chínhảnh hưởng sự nhạy cảm đó là cáctỷ lệ của tế bào ung thư, trình bày trongmẫu. Do đó, tỷ lệ phần trăm của các đột biến tế bàotrong mẫu phải được lớn hơn 70%, tronghợp đồng, các mẫu sẽ được loại bỏ.Cho mục đích để có một phiên bản chungvề đột biến trên EGFR và K-ras, cáctần số trung bình trọng đã được tính toán.Như là kết quả, chúng tôi kết luận rằng (1) K-rasgen tồn tại 7 đột biến nổi bật, màlà G12D, G12V, G13D, mutation, G12C,G12A, G12R; (2) EGFR gen tồn tại 2đột biến với tần số cao đượcL858R trên exon 21 và gen xóa E746-A750 trên exon 19; (3) có đột biến hiếm khiEGFR và hầu như không có ý nghĩa trên kết tràngung thư.Theo phân tích thống kê, cókhông có sự khác biệt đáng kể giữa khác nhaudân địa phương khi thực hiện một so sánhtrên K-ras và EGFR đột biến (bảng 1).Hơn nữa, chúng tôi xem xét rằng loạiđột biến trên mỗi gen không loại trừ mỗikhác. Tuyên bố này là tương tự như nghiên cứuSun và el (2011).Bảng 1. Của mẫu thống kê và tham số ANOVA vào loại khác nhau của nổi bậtđột biến7 đột biến nổi bật trên K-ras của bệnh ung thư đại-trực tràngTất cả mẫuvới K-rasđột biếnChâu Âu người Mỹ Châu á F P giá trị F crit bình luận1605 1052 158Khôngđáng kểsự khác biệtở α = 5%G12D 546 338 69 1.957671 0.234331 7.708647G12V 358 234 38 2.845997 0.166877 7.708647G13D 311 217 30 3.067208 0.154773 7.708647G12C 137 100 6 4.100888 0.112845 7.708647G12S 108 73 5 4.299204 0.106812 7.708647G12A 90 59 3 4.417707 0.103439 7.708647G12R 20 7 0 4.858892 0.092211 7.7086472 prominent mutations on EGFR of non-small cell lung cancerTotalsamplewithEGFRmutationAustralia Europe America Asia F P value F crit Comment75 39 133 311Nosignificantdifferencesat α = 5%L858R 13 15 40 103 2.29202 0.180811 5.987378E746-A750 29 1 18 93 2.685696 0.152365 5.987378and in molecularly targeted therapy: from to study 33In silico study and PCR-sequencingprimer designedAs mention at the introduction, in theRAS/RAF/MAPK signal pathway, if the K-raswas mutant, K-ras protein is EGFRindependent activated. For the therapy usingCatuximab and Panitumumab antibodiesapplied on colorectal cancer patient, it isnecessary to detect there was no any mutationon K-ras, otherwises, (in the patient withmutant K-ras), the 30 Journal of Science Ho Chi Minh City Open University – No. 1(13) 2015- February/2015EGFR AND K-RAS IN MOLECULARLY TARGETED THERAPY:FROM IN SILICO TO IN VITRO STUDYLieu Chi Hung1, Lao Duc Thuan2, Le Huyen Ai

Kết quả (Việt) 2:

30 Tạp chí Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Khoa học - Số 1 (13) 2015- tháng Hai / 2015
EGFR VÀ K-RAS TRONG ĐIỀU TRỊ phân tử MỤC TIÊU:
TỪ TRÊN Silico trong ống nghiệm NGHIÊN CỨU
Liêu Chí Hung1, Lao Đức Thuan2, Lê Huyền Ái Thuy2
1
Bệnh viện Tây Ninh, Việt Nam
2
Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh
Email: [e-mail]
(Received: 23/01/2015; Sửa đổi: 26/01/2015; Accepted: 2015/03/02 )
Tóm tắt
phân tử mục tiêu điều trị là một loại mới của điều trị ung thư trong đó sử dụng monoclonalantibodies hoặc các chất nhỏ để xác định và các tế bào ung thư tấn công, ngoại trừ tế bào bình thường. Điều này có
lợi thế hơn so với phương pháp điều trị cổ điển. EGFR (biểu bì tăng trưởng Factor Receptor) và Kras (Kirsten-ras) được coi là hai đại lý cũng phân tử mục tiêu.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện một nghiên cứu tài liệu hệ thống trong NCBI và tính
tần số trung bình của EGFR và K-ras đột biến ở một số chung ung thư. Theo số liệu
phân tích, chúng tôi kết luận rằng đột biến bố toàn cầu thuộc các gen này không
loại trừ lẫn nhau và cũng không kết hợp với các yếu tố của cuộc đua. Chúng tôi thiết kế thành công và được đánh giá
(1) mồi để phát hiện của EGFR và đột biến K-ras bằng PCR-trình tự; (2) lót / thăm dò
bộ được sử dụng để phát hiện các đột biến phổ biến nhất bảy K-ras bởi Allele-Cụ-Realtime PCR (AS-Real-time PCR) cũng như Allele-PCR cụ thể. Do thử nghiệm bước đầu
kết quả, một quy trình tách chiết DNA thích hợp từ FFPE (Formalin-cố định, ParaffinEmbedded) mẫu và tối ưu Tm cho mỗi cặp vợ chồng mồi của đột biến khuếch đại, có chứa
các vùng trên K-ras đã được rút ra. Kết quả của K-ras đột biến trên bệnh nhân ung thư đại trực tràng
lấy từ Tỉnh Tây Ninh, Việt Nam lần đầu tiên được phát hiện bằng PCR-trình tự
các phương pháp, sau đó, có xác nhận của AS-Real-Time PCR.
Từ khóa: EGFR, K-RAS, ung thư đại trực tràng, PCR-sequencing, Allele-cụ thể Real-time PCR.
1. Giới thiệu
mục tiêu điều trị là một tiến bộ mới
công nghệ trong lĩnh vực ung thư nội bộ
, chữa bệnh; nó được dựa trên việc áp dụng các
thành tựu nghiên cứu trong sinh học phân tử
(Sawyers C, 2004). Điều trị mới này có
nhiều ưu điểm hơn. Các loại thuốc, được sử dụng trong
liệu pháp này, có xu hướng ít độc hại và các trang web
ảnh hưởng đến các tế bào không ung thư trong khi ung thư
tế bào được điều trị. Do điều này can thiệp vào
các phân tử đặc biệt có liên quan trực tiếp
tới cơ chế khối u và tăng sinh
của các khối u, phân tử này được gọi là "phân tử
mục tiêu "và liệu pháp này được gọi là" phân tử
liệu pháp nhắm mục tiêu "hay" liệu pháp nhắm mục tiêu ".
Một trong những "mục tiêu phân tử", mục tiêu đầu tiên
cho điều trị này là EGFR (biểu bì tăng trưởng
Factor, Receptor). Nó là glycoprotein, các receptor cellsurface cho các thành viên của lớp thượng bì
gia đình yếu tố tăng trưởng (EGF-gia đình) của
các phối tử protein ngoại bào. Chức năng của nó là
tyrosine kinase, mà tồn tại trên tín hiệu tế bào
và tăng sinh (Francoual et al, 2006). Nó được
tìm thấy rằng quá mức của EGFR được
quan sát thấy ở nhiều bệnh ung thư (Nicholson et al,
2001). Vì lý do này, các liệu pháp mới
tập trung vào việc ức chế sự hoạt động của protein
EGFR (Mendelsohn, 2002). Ngày nay, hai
nhóm thuốc tác dụng trên các mục tiêu của
EGFR là Tyrosine Kinase Inhibitors (TKIs),
cho ví dụ: Erlotinib (Tarceva, Roche), và
trong điều trị và mục tiêu phân tử: từ nghiên cứu 31
kháng thể đơn dòng như cetiximad
(ErbituxTM, Bristol Myers Squibb và Merck
KGaA), Pantitumumab (VectibixTM, Amgen)
(Mendelsohn, 2002).
Các cơ bản để lựa chọn cá nhân hóa
thuốc là sàng lọc các đột biến trên gen EGFR.
Nếu đột biến, đặc biệt là trong các dịch
vùng cho tyrosine kinase gen EGFR, đang
được phát hiện , TKIs sẽ được sử dụng để điều trị
(Blanke, 2005, Tsao et al, 2005). Trường hợp nomutated khác sẽ trực tiếp hướng dẫn trong
sử dụng kháng thể chống EGFR như
Cetuximab or Panitumumab (Mendelsohn,
2002).
Ngoài ra, việc dẫn truyền tín hiệu của
EGFR là RAS / RAF / MAPK con đường trong đó
K-ras là protein quan trọng của trục này.
( Karapetis et al, 2008). Các hoạt động của bình thường
K-ras là phụ thuộc vào hoạt động của EGFR
thụ. Tuy nhiên, protein K-ras được thay đổi để
được EGFR độc lập nếu có đột biến về
gen K-ras (Các tín hiệu cho sự tăng sinh và
biệt hóa của các tế bào này cũng liên tục
truyền) (Karapetis et al, 2008). Bên cạnh đó,
bệnh nhân được trực tiếp hướng dẫn để có những
điều trị với Catuximab và Panitumumab
kháng thể, nó là cần thiết để có một cuộc kiểm tra
trên các đột biến trên gen K-ras hay không.
Lý do là các kháng thể này chỉ có ảnh hưởng
trên bệnh nhân mà không có đột biến trên K- ras
(Benvenuti et al, 2007;. Amado et al 2008,;.
Karapetis et al, 2008;.. Jönsson et al, 2009). Trong
một số bệnh ung thư phổ biến như ung thư đại trực tràng,
ung thư phổi, ung thư vú, ung thư thực quản ...
Đây là báo cáo rằng một trong hai EGFR hoặc K-ras với
đột biến của họ đã dẫn đến sự gián đoạn của gen
chức năng (Kwak EL, 2006; Yunxia Z, 2010)
Để Tóm lại, nó là cần thiết để có nhiều
nghiên cứu về đột biến EGFR và K-ras chẳng hạn
như các khu vực thường xuyên bị đột biến, các loại đột biến,
phương pháp và kỹ thuật để phát hiện ... trong
để có nhiều ứng dụng hơn nhắm mục tiêu
các liệu pháp điều trị ung thư ở Việt Nam.
Đây cũng là các mục tiêu nghiên cứu của chúng tôi.
2. Vật liệu và phương pháp
thu thập mẫu lâm sàng
Trong nghiên cứu này, 19 bệnh ung thư đại trực tràng
mẫu vật được thu thập từ Ninh Tây
Hospital, Việt Nam từ tháng Giêng năm 2007 đến tháng,
năm 2011. Các mẫu được nhúng trong parafin và
lưu giữ trong -30oC trước khi tiếp tục sử dụng.
Khai thác dữ liệu, sơn lót được thiết kế và
phân lập DNA
liệu được thu thập trên Pubmed bằng cách sử dụng
các từ khóa khác nhau để nghiên cứu các loại
đột biến gen EGFR trên hai và K-ras.
Sau đó, tần số bình quân được
tính toán để xác định đột biến nổi bật.
Đồng thời, phân tích ANOVA được thực
hiện nhằm đánh giá mối tương quan giữa
đột biến và các yếu tố chủng tộc.
EGFR và K-ras trình tự đã được
thu thập từ GenBank (NCBI), và mồi
cho PCR đã được thiết kế để phát hiện promient
đột biến của EGFR và K-ras. Primer
thông số đã được đánh giá bởi nhiều tuyến
các công cụ tin sinh học như BLAST
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/), IDT phân tích
(www.idtdna.com/analyzer/Applications/Oligo
Analyzer /), Primer Express, Annhyb,
BatchPrimer 3
(http://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/).
chiết DNA được phân lập bằng cách sử dụng
Phenol / Chloroform phương pháp (Sacchi, 1987).
Bởi vì mẫu được nhúng trong parafin, nó
là cần thiết để phân hủy paraffin bằng cách sử dụng
giải pháp xylene.
PCR-sequencing và Allele-cụ thể
Real-time PCR
Các khuyếch đại được thực hiện trong một tổng
khối lượng của 15l, phản ứng đã bị
tắt ủ ở 95oC trong 5 phút, sau
40 chu kỳ ở 95oC cho độ tuổi 30, xóc cho tuổi 30 (X
là nhiệt độ gắn mồi
tương ứng với mỗi mồi), 72oC cho độ tuổi 30
và 72oC trong 6 phút để ủ thức. PCR
sản phẩm đã được trực tiếp thực hiện trình tự
trong Macrogen Co (Hàn Quốc).
3. Kết quả và phương pháp
khai thác dữ liệu
Chúng tôi xem xét một cách hệ thống hơn
40 nghiên cứu trong đó liên quan đến phân tích các
đột biến EGFR và K-ras của năm loại
32 Tạp chí Khoa học Hồ Chí Minh Đại học Thành phố mở - Số 1 (13) 2015- tháng Hai / 2015
ung thư. Trong phiên bản của chúng tôi, chúng tôi thấy rằng paraffin
mô nhúng được sử dụng nhiều hơn thường
(60% trên các nghiên cứu của EGFR và 67,27% về
K-ras) so với mô lành và mô đông lạnh.
Về kỹ thuật để phát hiện các đột biến,
phương pháp giải trình tự Sanger đã hơn
thường được sử dụng hơn (54.05% trên EGFR và
60,29% về K-ras) một phương pháp như
Real-time PCR, COLD (Co-khuếch đại ở
nhiệt độ biến tính thấp hơn) PCR. Hơn nữa,
bên cạnh những đặc điểm của phương pháp của
sự nhạy cảm, chúng tôi xem xét các yếu tố chính
ảnh hưởng đến độ nhạy cảm đó là
tỷ lệ của các tế bào ung thư được trình bày trong
các mẫu. Do đó, tỷ lệ phần trăm của các tế bào đột biến
trong mẫu phải được lớn hơn 70%, trong
hợp đồng, các mẫu sẽ được loại bỏ.
Đối với mục đích để có một phiên bản chung
về đột biến trên EGFR và K-ras, các
tần số trung bình có trọng số được tính toán.
Theo kết quả, chúng tôi kết luận rằng (1) K-ras
gen tồn tại 7 đột biến nổi bật, đó
là G12D, G12V, G13D, G12S, G12C,
G12A, G12R; (2) gen EGFR tồn tại 2
đột biến với tần số cao mà là
L858R trên exon 21 và xóa gen E746 -
A750 trên exon 19; (3) là rất hiếm khi có đột biến
EGFR và gần như không có ý nghĩa về đại trực tràng
ung thư.
Theo phân tích thống kê, có
không có khác biệt đáng kể giữa nhiều
người dân địa phương khi thực hiện một so sánh
về K-ras và đột biến EGFR (Bảng 1).
Hơn nữa, chúng tôi xem xét mà loại
đột biến trên mỗi gen đã không loại trừ mỗi
khác. Tuyên bố này cũng tương tự như các nghiên cứu
của Sun và tại el (2011).
Thống kê và tham số ANOVA Bảng 1. Mẫu trên các loại khác nhau của nổi bật
đột biến
7 đột biến nổi bật trên K-ras của đại trực tràng ung thư
Tổng số mẫu
với K-ras
đột biến
Châu Âu Mỹ Châu Á FP giá trị F crit Comment
1605 1052 158
Không
đáng kể
sự khác biệt
ở α = 5%
G12D 546 338 69 1,957671 0,234331 7,708647
G12V 358 234 38 2,845997 0,166877 7,708647
G13D 311 217 30 3,067208 0,154773 7,708647
G12C 137 100 6 4,100888 0,112845 7,708647
G12S 108 73 5 4,299204 0,106812 7.708647
G12A 90 59 3 4,417707 0,103439 7,708647
G12R 20 7 0 4,858892 0,092211 7,708647
đột biến 2 nổi bật trên EGFR của không nhỏ ung thư phổi tế bào
Tổng số
mẫu
với
EGFR
đột biến
Úc Châu Âu Châu Mỹ Châu Á FP giá trị F crit Comment
75 39 133 311
Không
đáng kể
sự khác biệt
ở α = 5%
L858R 13 15 40 103 2,29202 0,180811 5,987378
E746-
A750 29 1 18 93 2,685696 0,152365 5,987378
và trong điều trị nhắm mục tiêu phân tử: từ nghiên cứu 33
Trong nghiên cứu silico và PCR-trình tự
mồi được thiết kế
Như đề cập ở phần giới thiệu, trong
RAS / RAF / MAPK đường truyền tín hiệu, nếu K-ras
là đột biến, protein K-ras được EGFRindependent kích hoạt. Đối với các liệu pháp sử dụng
Catuximab và Panitumumab kháng thể
áp dụng trên bệnh nhân ung thư đại trực tràng, nó là
cần thiết để phát hiện không có bất kỳ sự đột biến
trên K-ras, otherwises, (ở bệnh nhân có
đột biến K-ras), 30 Tạp chí Khoa học Hồ Chí Minh Đại học Thành phố mở - Số 1 (13) 2015- tháng Hai / 2015
EGFR VÀ K-RAS TRÊN ĐIỀU TRỊ phân tử MỤC TIÊU:
TỪ TRÊN Silico trong ống nghiệm NGHIÊN CỨU
Liêu Chí Hung1, Lao Đức Thuan2, Lê Huyền Ái