Cell debris was removed by centrifu

Cell debris was removed by centrifugation at 12,000 g for 15 min at 4°C. The supernatant was mixed with 0.5 g of raw cornstarch to make a 1% (wt/vol) starch solution and agitated for 2 h at 4°C. After centrifugation at 12,000 g for 15 min, the starch pellet containing the enzyme was washed three times in 50 ml of cold 50 mM glycine-NaOH buffer (pH 9.0), suspended with 20 ml of 20% (wt/vol) maltose solution, agitated for 2 h at 37°C, and centrifuged to remove starch. The eluate was loaded onto a QSepharose column (anion exchanger; 1.6 by 40 cm) (Pharmacia) equilibrated with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5). The column was washed with the same buffer at a flow rate of 2 ml/min; bound protein was eluted with a linear gradient of 0 to 0.6 M NaCl in the same buffer. Active fractions from Q-Sepharose chromatography were pooled and concentrated to 10 ml by using Centriprep 50 (Amicon Co.). The concentrate was dialyzed against 15% glycerol and 0.2 M NaCl in 50 mM glycine-NaOH buffer (pH 9.0) for 24 h with buffer changes every 6 h. The preparation was stored at 20°C until use. Amylase activity determination. Determination of amylolytic activity was carried out by using the dinitrosalicylic acid method, which is a procedure for the determination of reducing sugar (21). The enzyme reaction mixture was composed of substrate and an appropriate quantity of enzyme in 20 mM glycineNaOH buffer (pH 9.0); 500 l of the enzyme mixture was incubated at the appropriate temperature for 10 min. The reaction was stopped by adding 500 l of dinitrosalicylic acid solution (10.6 g of 3,5-dinitrosalicylic acid, 19.8 g of NaOH, 306 g of potassium sodium tartrate, 7.6 ml of phenol, 8.3 g of sodium metabisulfate, and 1,416 ml of distilled water). The reaction mixture was boiled for 5 min and cooled by placing the tubes on ice. Absorbance was measured at 575 nm in a 1-cm polystyrene cuvette by using a Hitachi U-1100 spectrophotometer (Tokyo, Japan). One unit of hydrolyzing activity was defined as the amount of enzyme required to produce 1 mol of maltose-equivalent reducing sugar in 1 min. For the determination of optimal pH, the following buffers were used for the different pH ranges: pH 4.5 to 6.0, 50 mM sodium acetate; pH 5.5 to 8.0, 50 mM sodium phosphate; pH 7.5 to 9.0, 50 mM Tris-HCl; pH 8.5 to 10, 50 mM CHES [(2-(cyclohexylamino)ethanesulfonic acid]; pH 9.0 to 11.0, 50 mM glycineNaOH; and pH 10.5 to 12.5, 50 mM Na2HPO4-NaOH. Thin layer chromatography (TLC). An appropriate amount of enzyme was incubated with substrate at 42°C. A silica gel K6F thin-layer chromatography plate (Whatman) was activated by incubation at 110°C for 30 min. Prepared samples were spotted on the silica gel plate with a pipette; the plate was placed in a TLC chamber containing a solvent mixture of isopropanol-ethyl acetatewater (3:1:1, vol/vol/vol) and developed at room temperature. The plate was dried completely and dipped rapidly into a methanol solution containing 3 g of N-(1-naphthyl)-ethylenediamine and 50 ml of concentrated H2SO4 solution per liter. The plate was dried and placed at 110°C for 10 min for visualization. HPIC. Reaction mixtures were heated in boiling water for 5 min and filtered through a 4.5- m-pore-size syringe filter. A CarboPac (PA1) column (0.4 by 25 cm; Dionex) and an electrochemical detector (ED40; Dionex) were used for high-performance ion chromatography (HPIC) analysis. Buffer A (150 mM aqueous NaOH solution) and buffer B (600 mM sodium acetate solution in buffer A) were used to make a linear gradient for the elution of saccharides. Computer programs and services used. Sequence similarity searches were conducted with BLAST provided by the National Center for Biotechnology Information (2). Sequence manipulation, open reading frame (ORF) searches, and multiple alignments among similar enzymes were conducted with DNASTAR software. Signal peptides were analyzed with SignalP version 1.1 (Center for Biological Sequence Analysis, Technical University of Denmark [http://www .cbs.dtu.dk]). Nucleotide sequence accession number. The nucleotide sequence of the insert of pS2A4 has been deposited in the GenBank database under the accession number AY383543. RESULTS Construction of metagenomic libraries. DNAâ

Kết quả (Việt) 1:

Mảnh vỡ tế bào đã được gỡ bỏ bởi số 12.000 g cho 15 phút ở 4° C. Supernatant được trộn lẫn với cách 0.5 g nguyên bột bắp để làm cho một giải pháp tinh bột 1% (wt/vol) và giao động cho 2 h 4° C. Sau khi số 12.000 g cho 15 phút, tinh bột viên có chứa enzyme được rửa ba lần trong 50 ml của bộ đệm glycine-NaOH lạnh 50 mM (pH 9.0), bị đình chỉ với 20 ml 20% (wt/vol) giải pháp maltose, giao động cho 2 h 37° C, và ly để loại bỏ các tinh bột. Eluate đã được nạp vào một cột QSepharose (trao đổi anion; 1.6 bởi 40 cm) (Pharmacia) equilibrated với 50 mM Tris-HCl đệm (pH 7,5). Các cột được rửa sạch với các bộ đệm cùng một tốc độ dòng chảy 2 ml/phút; protein ràng buộc eluted với một độ dốc tuyến tính của 0 đến cách 0.6 M NaCl trong cùng một bộ đệm. Phần phân đoạn của hoạt động từ Q-Sepharose sắc kí được gộp lại và tập trung để 10 ml bằng cách sử dụng Centriprep 50 (Amicon công). Tập trung dialyzed chống lại nhóm glycerol 15% và thay đổi cách 0.2 M NaCl trong 50 mM glycine-NaOH bộ đệm (pH 9.0) cho 24 h với bộ đệm mỗi 6giờ. Việc chuẩn bị đã được lưu trữ ở 20° C cho đến khi sử dụng. Amylase hoạt động xác định. Xác định amylolytic hoạt động được thực hiện bằng cách sử dụng các phương pháp axit dinitrosalicylic, mà là một thủ tục xác định giảm đường (21). Hỗn hợp phản ứng enzym gồm bề mặt và một số lượng thích hợp của enzym trong bộ đệm glycineNaOH 20 mM (pH 9.0); 500 l của hỗn hợp enzym được ủ ở nhiệt độ thích hợp cho 10 phút. Phản ứng được dừng lại bằng cách thêm 500 l của giải pháp axit dinitrosalicylic (10,6 g của 3,5-dinitrosalicylic axit, 19,8 g NaOH, 306 g của kali natri tartrat, 7.6 ml phenol, 8.3 g natri metabisulfate và 1.416 ml nước cất). Hỗn hợp phản ứng đã được đun sôi trong 5 phút và làm mát bằng nước bằng cách đặt các ống trên băng. Hấp thu được đo tại 575 nm ở một 1-cm polystyrene cuvette bằng cách sử dụng một phối Hitachi U-1100 (Tokyo, Nhật bản). Một đơn vị của chế hoạt động được định nghĩa là số lượng các men tiêu hóa cần thiết để sản xuất 1 mol maltose tương đương giảm đường trong 1 phút. Xác định độ pH tối ưu, các bộ đệm được sử dụng cho các phạm vi khác nhau độ pH: pH 4.5 để 6.0, 50 mM natri axetat; pH 5.5 để 8.0, 50 mM Dinatriyfosfat; pH 7,5 để 9.0, 50 mM Tris-HCl; pH 8.5-10, 50 mM CHES [(2-(cyclohexylamino) ethanesulfonic acid]; pH 9.0 để 11,0, 50 mM glycineNaOH; và pH 10,5 đến 12,5, 50 mM Na2HPO4-NaOH. Sắc kí lớp mỏng (TLC). Một số tiền thích hợp của enzyme được ủ với bề mặt tại 42° C. Một đệm bằng silica gel K6F sắc kí lớp mỏng tấm (tráng nhựa Whatman) đã được kích hoạt bởi ấp trứng tại 110° C cho 30 phút chuẩn bị mẫu đã được phát hiện trên tấm đệm bằng silica gel với một pipette; Các tấm được đặt trong một buồng TLC có chứa một hỗn hợp dung môi của isopropanol-ethyl acetatewater (3:1:1, vol/vol/vol) và phát triển ở nhiệt độ phòng. Các tấm được khô hoàn toàn và nhúng nhanh chóng vào một giải pháp methanol có 3 g của N-(1-naphthyl)-ethylenediamine và 50 ml của tập trung giải pháp H2SO4 / lít. Các tấm được sấy khô và đặt ở 110° C trong 10 phút cho kiểu trực quan. HPIC. Phản ứng hỗn hợp được đun nóng trong nước sôi trong 5 phút và lọc thông qua một bộ lọc 4.5-m-lỗ chân lông-kích thước ống tiêm. Một cột CarboPac (PA1) (0,4 bởi 25 cm; Dionex) và một máy dò điện hóa (ED40; Dionex) đã được sử dụng cho hiệu suất cao ion sắc ký (HPIC) phân tích. Đệm (150 mM dung dịch nước NaOH giải pháp) và bộ đệm B (600 mM natri axetat giải pháp trong vùng đệm A) được sử dụng để làm cho một độ dốc tuyến tính cho elution saccharides. Chương trình máy tính và dịch vụ được sử dụng. Trình tự tương tự tìm kiếm đã được tiến hành với vụ nổ cung cấp bởi Trung tâm quốc gia cho công nghệ sinh học thông tin (2). Trình tự thao tác, mở đọc khung (ORF) tìm kiếm, và sự sắp xếp nhiều trong số các enzyme tương tự đã được tiến hành với phần mềm DNASTAR. Tín hiệu peptide được phân tích với SignalP Phiên bản 1.1 (Trung tâm sinh học phân tích trình tự, đại học kỹ thuật Đan Mạch [http://www. cbs.dtu.dk]). Nucleotide chuỗi gia nhập số. Dãy nucleotide của chèn của pS2A4 đã được gửi trong cơ sở dữ liệu GenBank dưới số gia nhập AY383543. Kết quả các xây dựng thư viện metagenomic. DNAâ

Kết quả (Việt) 2:

Các mảnh vỡ tế bào được lấy ra bằng cách ly tâm ở 12.000 g trong 15 phút ở nhiệt độ 4 ° C. Các dịch nổi được trộn với 0,5 g bột bắp liệu để thực hiện một 1% (wt / vol), giải pháp tinh bột và kích động cho 2 h ở 4 ° C. Sau khi ly tâm ở 12.000 g trong 15 phút, viên tinh bột có chứa các enzyme đã được rửa ba lần trong 50 ml lạnh 50 mM glycine-NaOH đệm (pH 9.0), đình chỉ với 20 ml dung dịch 20% (wt / vol), giải pháp maltose, kích động trong 2 giờ ở 37 ° C, và ly tâm để loại bỏ tinh bột. Việc rửa giải được nạp vào một cột QSepharose (anion trao đổi; 1.6 40 cm) (Pharmacia) cân bằng với 50 mM Tris-HCl đệm (pH 7,5). Các cột được rửa sạch với cùng một bộ đệm tốc độ dòng chảy của 2 ml / phút; gắn kết với protein được tách rửa với một gradient tuyến tính của 0-0,6 M NaCl trong cùng một bộ đệm. Phân số hoạt động từ sắc ký Q-Sepharose được gộp lại và tập trung vào 10 ml bằng Centriprep 50 (Amicon Co.). Việc tập trung được thẩm tách so với 15% glycerol và 0,2 M NaCl trong 50 mM glycine-NaOH đệm (pH 9.0) trong 24 h với bộ đệm thay đổi mỗi 6 h. Việc chuẩn bị đã được lưu trữ ở 20 ° C cho đến khi sử dụng. Xác định hoạt động amylase. Xác định hoạt -phân giải tinh bột đã được thực hiện bằng cách sử dụng các phương pháp axit dinitrosalicylic, đó là một thủ tục để xác định đường khử (21). Hỗn hợp phản ứng enzyme được sáng tác của chất nền và một số lượng thích hợp các enzyme trong 20 mM glycineNaOH đệm (pH 9.0); 500 l của hỗn hợp enzyme đã được ủ ở nhiệt độ thích hợp trong 10 phút. Các phản ứng đã được ngừng lại bằng cách thêm 500 l dung dịch axit dinitrosalicylic (10,6 g axit 3,5-dinitrosalicylic, 19,8 g NaOH, 306 g kali natri tartrate, 7,6 ml của phenol, 8,3 g natri metabisulfate, và 1,416 ml nước cất). Hỗn hợp phản ứng được đun sôi trong 5 phút và làm lạnh bằng cách đặt ống trên băng. Độ hấp thụ được đo ở 575 nm trong một 1-cm polystyrene cuvette bằng cách sử dụng một máy quang phổ Hitachi U-1100 (Tokyo, Nhật Bản). Một đơn vị hoạt động thủy phân được định nghĩa là lượng enzyme cần thiết để sản xuất ra 1 mol của maltose tương đương giảm lượng đường trong 1 phút. Đối với việc xác định pH tối ưu, các bộ đệm sau đây đã được sử dụng cho các pH khác nhau dao động: pH 4,5-6,0, 50 mM sodium acetate; pH 5,5-8,0, 50 mM sodium phosphate; pH 7,5-9,0, 50 mM Tris-HCl; pH 8,5-10, 50 mM Ches [(2- (cyclohexylamino) axit ethanesulfonic]; pH 9,0-11,0, 50 mM glycineNaOH;.. và pH 10,5-12,5, 50 mM Na2HPO4-NaOH sắc ký lớp mỏng (TLC) Một số tiền thích hợp các enzyme đã được ủ với chất nền ở 42 ° C A silica gel K6F sắc ký lớp mỏng tấm (Whatman) đã được kích hoạt bằng cách ủ ở 110 ° C trong 30 phút mẫu đã chuẩn bị được phát hiện trên các tấm gel silica với một pipette;.. tấm đã được đặt trong một buồng TLC có chứa một hỗn hợp dung môi isopropanol-ethyl acetatewater (3: 1: 1, vol / vol / vol) và phát triển ở nhiệt độ phòng Các tấm được sấy khô hoàn toàn và giảm nhanh chóng thành một giải pháp methanol có chứa 3 g. N- (1-naphthyl) -ethylenediamine và 50 ml dung dịch H2SO4 đậm đặc cho mỗi lít. Các tấm được sấy khô và được đặt ở 110 ° C trong 10 phút để hình dung. HPIC. Hỗn hợp phản ứng được đun nóng trong nước sôi trong 5 phút và lọc qua một 4.5- m-lỗ chân lông, kích thước lọc ống A CarboPac (PA1) cột (0,4 bằng 25 cm; Dionex). và một máy dò điện hóa (ED40; Dionex) đã được sử dụng cho phương pháp sắc ký ion hiệu năng cao (HPIC) phân tích. Buffer A (150 mM dung dịch NaOH dung dịch nước) và bộ đệm B (600 mM sodium acetate trong bộ đệm A) đã được sử dụng để tạo ra một gradient tuyến tính cho rửa giải sacarit. Các chương trình và dịch vụ máy tính sử dụng. Tìm kiếm tương tự đã được tiến hành với BLAST được cung cấp bởi Trung tâm Quốc gia về Thông tin Công nghệ sinh học (2). Thao tác trình tự, khung đọc mở (ORF) tìm kiếm, sắp xếp, và nhiều trong số các enzyme tương tự đã được tiến hành với phần mềm DNASTAR. Peptide tín hiệu được phân tích với SignalP phiên bản 1.1 (Trung tâm Sinh học Phân tích trình tự, Trường Đại học Kỹ thuật Đan Mạch [http: // www .cbs.dtu.dk]). Nucleotide số thứ tự nhập. Trình tự nucleotide của chèn của pS2A4 đã được gửi vào cơ sở dữ liệu GenBank dưới AY383543 số nhập. KẾT QUẢ Xây dựng các thư viện metagenomic. DNAâ