(B) Scratch assay on transfected ce

(B) Scratch assay on transfected cells
(i) Plate growing cells at 50–60% confluency for 12–18 h
before transfection. Transfect cells with the plasmid
encoding the gene of interest (or siRNA) along with
a marker plasmid (i.e., GFP) in a 7:1 ratio, or with a
vector-encoding GFP fusion protein containing the gene
of interest by LipofectAmine and PLUS transfection
reagents (Invitrogen). Incubate the dishes at 371C until cells reach 100% confluence to form a monolayer.
(ii) Use a p200 pipet tip to create a scratch of the cell monolayer. Wash the plate once and replace with the desired medium.
If time-lapse microscopy is used, CO
2-independent media (e.g., HEPES-buffered media) may be required. The time-lapse
microscope is used for acquiring the images from the same field automatically. It can be equipped with a stage incubator
either with only temperature control or with both temperature and CO2control. For the chamber with only temperature
control, it is necessary to use CO2-independent medium during the assay. Nonetheless, it is not very practical to examine
cell migration over a period of over 18 h by using the CO2
-independent medium.
(iii) Observe the cells under a fluorescence microscope to ensure that enough cells in the leading edge of the scratch
are positively transfected (i.e., as marked by GFP). Create reference markings as described in Step 6 and acquire both
phase-contrast and fluorescence images every 2 h for the same scratched region until the scratch completely close or
within a desired time frame.
(iv) Determine the rate of cell migration for the transfected cells by the available computing software that measures
the distance traveled during the desired time frame (see Step A(v)). It should be noted that the neighboring
untransfected cells could be used as controls for the positively transfected cells. It is also useful to draw an imaginary
line in the middle of the scratch in
the images captured (seeFig. 2).

Kết quả (Việt) 2:

(B) Scratch khảo nghiệm trên tế bào transfected
(i) Máy phát triển các tế bào ở 50-60% confluency cho 12-18 h
trước khi thâm chuyển. Tế bào Transfect với các plasmid
mã hóa các gen quan tâm (hay siRNA) cùng với
một plasmid marker (tức là, GFP) trong 7: 1 tỷ lệ, hoặc với một
protein GFP fusion vector mã hóa có chứa các gen
quan tâm bởi LipofectAmine và PLUS transfection
thuốc thử (Invitrogen). Ủ các món ăn tại 371C cho đến khi tế bào đạt 100% hợp lưu để tạo thành một lớp đơn.
(ii) Sử dụng một mẹo P200 Pipet để tạo ra một vết xước của lớp tế bào. Rửa tấm một lần và thay thế bằng các phương tiện truyền mong muốn.
Nếu kính hiển vi thời gian trôi đi được sử dụng, CO
2 phương tiện truyền thông độc lập (ví dụ, HEPES đệm phương tiện truyền thông) có thể được yêu cầu. Thời gian trôi đi
, kính hiển vi sử dụng cho việc mua các hình ảnh từ các lĩnh vực tương tự. Nó có thể được trang bị với một lồng ấp giai đoạn
hai với chỉ kiểm soát nhiệt độ hay với cả nhiệt độ và CO2control. Đối với các thính phòng với chỉ nhiệt độ
kiểm soát, nó là cần thiết để sử dụng phương tiện CO2 độc lập trong xét nghiệm. Tuy nhiên, nó không phải là rất thiết thực để kiểm tra
di cư tế bào trong khoảng thời gian hơn 18 h bằng CO2
trung -independent.
(iii) Quan sát các tế bào dưới kính hiển vi huỳnh quang để đảm bảo rằng các tế bào đủ trong phần đầu của mẻ
đang tích cực transfected (tức là, như đánh dấu bằng GFP). Tạo dấu tài liệu tham khảo như đã mô tả ở bước 6 và có được cả hai
giai đoạn tương phản và hình ảnh huỳnh quang mỗi 2 h cho các khu vực bị xước cùng cho đến khi đầu hoàn toàn gần hoặc
trong một khoảng thời gian mong muốn.
(iv) Xác định tỷ lệ di cư tế bào cho các tế bào transfected bởi phần mềm máy tính có sẵn để đo
khoảng cách đi trong khung thời gian mong muốn (xem Bước A (v)). Cần lưu ý rằng các lân cận
tế bào untransfected có thể được sử dụng như điều khiển cho các tế bào transfected tích cực. Nó cũng hữu ích để vẽ một tưởng tượng
dòng ở giữa của đầu trong
các hình ảnh được chụp (seeFig. 2).