Transdermal protein delivery by a c

Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display
Yongping Chen1,2, Yuanyuan Shen1,2, Xin Guo1,2, Caoshou Zhang1, Wenjuan Yang1, Minglu Ma1, Shu Liu1, Maobin Zhang1 & Long-Ping Wen1
Abstract
Efficient transdermal drug delivery of large hydrophilic drugs is challenging. Here we report that the short synthetic peptide, ACSSSPSKHCG, identified by in vivo phage display, facilitated efficient transdermal protein drug delivery through intact skin. Coadministration of the peptide and insulin to the abdominal skin of diabetic rats resulted in elevated systemic levels of insulin and suppressed serum glucose levels for at least 11 h. Significant systemic bioavailability of human growth hormone was also achieved when topically coadministered with the peptide. The transdermal-enhancing activity of the peptide was sequence specific and dose dependent, did not involve direct interaction with insulin and enabled penetration of insulin into hair follicles beyond a depth of 600 m. Time-lapse studies suggested that the peptide creates a transient opening in the skin barrier to enable macromolecular drugs to reach systemic circulation.
Introduction
As the largest organ of the human body, skin provides a painless interface for systemic drug delivery1, 2. However, the permeability of foreign molecules, especially large hydrophilic molecules, across the stratum corneum in the outer skin surface is extremely low3. In the last 50 years a large number of chemical penetration enhancers (CPEs), belonging to several different classes such as surfactants, fatty acids, fatty esters and Azone-like compounds, have enabled limited skin permeation enhancement4, 5. CPEs have two major limitations: skin irritation and inability to deliver large molecules. Without physical enhancement, mediated by iontophoresis6, ultrasound7 or microneedles8, CPEs are generally unable to deliver therapeutic levels of relatively large drugs (molecular mass >500 Da) through intact skin to the systemic circulation9. Recent progress in high-throughput screening to identify enhancer combinations10 and application of CPE design principles11 may help overcome these two limitations, but transdermal delivery of large hydrophilic proteins remains a formidable task.
Phage display peptide libraries are commonly used to obtain defined peptide sequences that interact with a particular molecule. As many as 109 different peptides are expressed on the phage surface by fusion to one of the phage surface proteins, and the desired peptides are selected on the basis of binding to the target molecule12. Phage libraries have been used to select for peptides that bind to immobilized proteins, carbohydrates, cultured cells and even inorganic material. An extension of this technique is in vivo phage display, which entails the injection of a peptide display phage library into the bloodstream of an animal and subsequent isolation and identification of phage that have the ability to home to a particular organ or tissue13, 14, 15. Filamentous phage, known to reach the brain after intranasal administration, have been used as a carrier to deliver antibodies against amyloid plaques16. Furthermore, a recent study used in vivo phage display to identify peptide sequences that induced the transport of phage across the gastrointestinal mucosal barrier17. These studies prompted us to study whether in vivophage display could identify peptides with transdermal capability.
We applied Ph.D.-C7C, a disulfide-constrained, phage-display, peptide library, onto the abdominal skin of BALB/cA nude mice and recovered phage particles from the blood circulation. Recovered phage were amplified and used for the next round of in vivoselection. Amplified phage from the first round exhibited a transdermal efficiency two orders of magnitude higher than that of the library phage. After the second round, twelve clones were randomly picked and sequenced. Eight of them contained an identical nucleotide sequence insert (termed PH-1), which coded for the displayed peptide CSSSPSKHC. When tested in Wistar rats, a representative phage carrying this sequence consistently crossed the skin barrier and reached the bloodstream, achieving an average titer of 4,556 infective phage particles per milliliter of blood 1 h after topical administration. In contrast, a control phage randomly selected from the library exhibited an average titer of 6.8 infective phage particles per milliliter of blood, with zero infective phage particles detected in the majority of the experiments (n =16).
As PH-1 differs from the random phage only in the displayed peptide sequence, the phage-displayed peptide most likely interacts with the skin to enable skin barrier penetration of PH-1. If the displayed peptide interacts with the skin in a specific manner that can be saturated, an excess of the displayed peptide would inhibit PH-1's transdermal activity. To test this model, we synthesized a cyclic peptide named TD-1 (ACSSSPSKHCG; the flanking A and G were derived from the M13 coat protein and included to make the peptide more stable). As expected, coadministered TD-1 inhibited the transdermal activity of PH-1 in a dose-dependent manner and at amounts over 5 g, completely abolished PH-1's transdermal activity (Supplementary Fig. 1 online). A control peptide named AP-1 (ACNATLPHQCG; a cyclic 11-mer with the same flanking amino acids and an unrelated internal sequence) had no effect on PH-1's ability to traverse the skin. This result strongly suggested that PH-1's transdermal activity involved a specific interaction between the displayed PH-1 peptide and an unknown skin component.
In contrast to the effect on PH-1 phage, coadministered TD-1 enhanced the transdermal penetration of the control phage, but the activity was relatively low and somewhat inconsistent, as we observed this enhancing activity on only 20% of the tested rats (data not shown). This finding led us to investigate whether TD-1 could deliver protein drugs transdermally. Insulin was selected as the first test candidate owing to the high market demand to deliver this drug noninvasively. We coadministered 125I-insulin and three different doses of TD-1 to the abdominal skin (an area 4 cm2) of rats and measured radioactivity in the systemic circulation. Significant levels of 125I were detectable in the whole blood 2 h after administration and continued to increase for 24 h (Fig. 1a). All three doses of TD-1 were effective. In the absence of TD-1, a low 125I level was detectable above background in the bloodstream, especially 24 h after administration. In principle,125I detected in the blood could be a result of any of the following: (i) 125NaI contamination (125NaI, a small molecule present as a contaminant (95% pure) was topically coadministered to dexamethasone-treated rats with AP-1, two different doses of TD-1, or saline as indicated. At various time points after administration, serum growth hormone levels were measured. Mean s.e.m. (n 3) *P < 0.05.
Full size image (61 KB)


To confirm insulin delivery and determine whether TD-1–delivered insulin can elicit therapeutic effects, we used streptozotocin-induced diabetic rats. In untreated diabetic rats the measured levels of insulin were relatively constant, ranging between 0.2 and 0.7 ng/ml, and were most likely due to low levels of endogenous insulin or a cross-reacting component in the radioimmunoassay. Upon topical coadministration of a saline solution of TD-1/porcine insulin (500:70 g), we detected serum insulin at an elevated level at 2 h (0.66–1.18 ng/ml, P = 0.100, compared to TD-1 alone), peaked at 5 h (2.85–4.76 ng/ml,P = 0.002) and returned to basal level at 11 h (0.37–0.81 ng/ml, P = 0.169) after administration (Fig. 1b). Correspondingly, blood glucose was decreased at 2 h (65.7–84.4%, P = 0.004, compared to TD-1 alone) after administration, reached its lowest level at 8 h (16.2–38.4%, P = 6.7710e-005) and was sustained at a significantly reduced level for at least 11 h (25.4–52.9%, P = 0.000149) (Fig. 1c). The control peptide AP-1 was inactive. The CPE combination sodium laureth

Kết quả (Việt) 1:

Transdermal protein giao hàng bằng một peptide coadministered được xác định thông qua phage Hiển thịYongping Chen1, 2, Yuanyuan Shen1, 2, Xin Guo1, 2, Caoshou Zhang1, Wenjuan Yang1, Minglu Ma1, Shu Liu1, Maobin Zhang1 & Long-Ping Wen1Tóm tắtPhân phối thuốc hiệu quả transdermal lớn Purifying thuốc là đầy thách thức. Ở đây chúng tôi báo cáo rằng ngắn tổng hợp peptide, ACSSSPSKHCG, được xác định bởi Hiển thị tại vivo phage, tạo điều kiện giao hàng thuốc protein hiệu quả transdermal qua da còn nguyên vẹn. Coadministration của các peptide và insulin để da bụng của bệnh tiểu đường chuột dẫn đến nồng độ insulin hệ thống và mức độ glucose bị đàn áp huyết thanh cho ít 11 h. đáng kể hệ thống khả dụng sinh học của hormone tăng trưởng nhân lực cũng đã đạt được khi tại chỗ coadministered với peptide. Transdermal, tăng cường hoạt động của peptide là chuỗi cụ thể và liều phụ thuộc, không liên quan đến các tương tác trực tiếp với insulin và cho phép thâm nhập của insulin vào nang lông ngoài độ sâu 600 m. thời gian trôi đi nghiên cứu đề xuất peptide đã tạo nên một thoáng qua mở trong các rào cản da để cho phép các loại thuốc phân tử để đạt được hệ thống lưu thông.Giới thiệuLà cơ quan lớn nhất của cơ thể con người, da cung cấp một giao diện không đau cho hệ thống thuốc delivery1, 2. Tuy nhiên, tính thấm của các phân tử nước ngoài, đặc biệt là lớn Purifying phân tử, trên tầng lớp sừng ở bề mặt bên ngoài da là vô cùng low3. Trong 50 năm qua một số lượng lớn các hóa chất thâm nhập enhancers (CPEs), thuộc về một số các lớp khác nhau chẳng hạn như bề mặt, axit béo, béo Este và các hợp chất như Azone, đã cho phép giới hạn da permeation enhancement4, 5. CPEs có hai hạn chế lớn: da kích ứng và không có khả năng cung cấp các phân tử lớn. Mà không cần nâng cao thể chất, do trung gian bởi iontophoresis6, ultrasound7 hoặc microneedles8, CPEs được thường không thể cung cấp điều trị cấp các loại thuốc tương đối lớn (phân tử khối lượng > 500 Da) thông qua da còn nguyên vẹn để circulation9 hệ thống. Các tiến bộ tại trong cao thông qua kiểm tra để xác định enhancer combinations10 và các ứng dụng của CPE thiết kế principles11 có thể giúp khắc phục những hạn chế hai, nhưng transdermal gửi protein Purifying lớn vẫn là một nhiệm vụ ghê gớm.Thư viện peptide phage Hiển thị thường được sử dụng để có được chuỗi peptide được xác định tương tác với một phân tử cụ thể. Bao nhiêu là 109 peptide khác nhau được thể hiện trên bề mặt thực khuẩn bằng phản ứng tổng hợp để một trong những protein trên bề mặt thực khuẩn, và peptide mong muốn được lựa chọn trên cơ sở các ràng buộc để mục tiêu molecule12. Phage thư viện đã được sử dụng để chọn cho peptide đó ràng buộc để hỏng protein, carbohydrate, nuôi cấy tế bào và thậm chí vô cơ vật liệu. Một phần mở rộng của kỹ thuật này là hiển thị tại vivo phage, mà đòi hỏi phải tiêm một thư viện thực khuẩn peptide Hiển thị vào máu của một động vật và sau đó cô lập và nhận dạng của phage mà có khả năng đến nhà để một cơ quan cụ thể hoặc tissue13, 14, 15. Phage sợi nhỏ, được biết đến để tiếp cận não sau khi chính quyền mũi, đã được sử dụng như một tàu sân bay để cung cấp các kháng thể chống lại amyloid plaques16. Hơn nữa, một nghiên cứu gần đây sử dụng tại vivo phage Hiển thị để xác định chuỗi peptide gây ra vận chuyển thực khuẩn trên barrier17 niêm mạc đường tiêu hóa. Các nghiên cứu này đã thúc đẩy chúng tôi để nghiên cứu cho dù trong vivophage Hiển thị có thể xác định peptide với khả năng transdermal.Chúng tôi áp dụng tiến sĩ-C7C, một disulfua hạn chế, Hiển thị thực bào phage, thư viện peptide, lên da bụng của BALB/cA khỏa thân chuột và phục hồi thực khuẩn hạt từ lưu thông máu. Phục hồi thực khuẩn được khuếch đại và sử dụng cho vòng tiếp theo của trong vivoselection. Khuếch đại thực bào phage từ vòng đầu tiên triển lãm một transdermal hiệu quả hai đơn đặt hàng của các cường độ cao hơn của thư viện phage. Sau vòng thứ hai, mười hai dòng vô tính ngẫu nhiên được chọn và trình tự. Tám người trong số họ có một giống hệt nhau nucleotide tự chèn (gọi là PH-1), mà mã hóa cho peptide Hiển thị CSSSPSKHC. Khi thử nghiệm ở Wistar chuột, một thực khuẩn đại diện, mang theo trình tự này luôn vượt qua các rào cản da và đạt đến máu, đạt được một titer trung bình của 4.556 lây nhiễm phage hạt trên milliliter của máu 1 h sau khi tại chỗ. Ngược lại, một phage kiểm soát lựa chọn ngẫu nhiên từ thư viện trưng bày một titer trung bình của 6.8 lây nhiễm phage hạt trên milliliter của máu, với số không hạt thực khuẩn lây nhiễm phát hiện trong đa số các thí nghiệm (n = 16).Như PH-1 khác với thực khuẩn ngẫu nhiên chỉ trong chuỗi peptide Hiển thị, Hiển thị thực khuẩn peptide rất có thể tiếp xúc với da cho phép da rào cản xâm nhập của PH-1. Nếu peptide Hiển thị tương tác với da một cách cụ thể mà có thể được bão hòa, một vượt quá peptide Hiển thị sẽ ức chế độ PH-1 transdermal hoạt động. Để thử nghiệm mô hình này, chúng tôi tổng hợp một peptide cyclic tên là TD-1 (ACSSSPSKHCG; các sườn A và G được bắt nguồn từ M13 áo protein và bao gồm để thực hiện peptide ổn định hơn). Theo dự kiến, coadministered TD-1 ức chế hoạt động transdermal PH-1 một cách phụ thuộc vào liều lượng và số lượng hơn 5 g, hoàn toàn bãi bỏ hoạt động transdermal PH-1 (bổ sung hình 1 trực tuyến). Một peptide kiểm soát đặt tên là AP-1 (ACNATLPHQCG; một 11-mer cyclic với cùng một axit amin sườn và một chuỗi nội bộ không liên quan) đã không ảnh hưởng của PH-1 có thể đi qua da. Kết quả này mạnh mẽ đề nghị rằng PH-1 transdermal hoạt động liên quan đến một tương tác cụ thể giữa các peptide PH-1 Hiển thị và một thành phần không rõ da.In contrast to the effect on PH-1 phage, coadministered TD-1 enhanced the transdermal penetration of the control phage, but the activity was relatively low and somewhat inconsistent, as we observed this enhancing activity on only 20% of the tested rats (data not shown). This finding led us to investigate whether TD-1 could deliver protein drugs transdermally. Insulin was selected as the first test candidate owing to the high market demand to deliver this drug noninvasively. We coadministered 125I-insulin and three different doses of TD-1 to the abdominal skin (an area 4 cm2) of rats and measured radioactivity in the systemic circulation. Significant levels of 125I were detectable in the whole blood 2 h after administration and continued to increase for 24 h (Fig. 1a). All three doses of TD-1 were effective. In the absence of TD-1, a low 125I level was detectable above background in the bloodstream, especially 24 h after administration. In principle,125I detected in the blood could be a result of any of the following: (i) 125NaI contamination (125NaI, a small molecule present as a contaminant (<5%) in the 125I-insulin preparation, may penetrate the skin barrier without the aid of TD-1); (ii) skin degradation of 125I-insulin and subsequent delivery of the breakdown products to the blood; (iii) systemically delivered 125I-insulin without degradation in the skin and with degradation in the blood; (iv) systemically delivered 125I-insulin without any degradation in the skin and blood. As insulin cannot traverse the skin barrier, the low level of 125I detected in the blood of the rat treated without TD-1 was most likely due to the delivery of either 125NaI or degraded 125I-insulin.Hình 1: Giao hàng ma túy hệ thống protein do trung gian bởi TD-1. (a) 125I-Insulin giao hàng. 125I-insulin (5.000.000 c.p.m.) là tại chỗ coadministered để các con chuột bình thường với số tiền khác nhau của TD-1. Phóng xạ trong các mẫu máu toàn bộ đã được đo tại các thời điểm sau khi. (b, c) Cung cấp điều trị cấp insulin. Streptozotocin gây ra bệnh tiểu đường chuột được tổ chức tại chỗ như hiển thị, với liều lượng sau: TD-1, 500 g; AP-1, 500 g; SLA/PP, 0,5% (wt/vol); Porcine insulin, 70 g, với ngoại lệ dưới da điều trị (14 g). Tại các điểm thời gian sau khi, nồng độ insulin huyết thanh (b) và mức độ đường trong máu (c) được đo. Mức độ glucose được chuẩn hoá chống lại giá trị ban đầu (0 h). Có nghĩa là s.e.m. (n = 6 cho glucose và n 3 cho insulin). * P < 0,05, ** P < 0.01, *** P < 0,001. (d, e) Liều-phản ứng của TD-1. Porcine insulin (70 g) và các liều lượng khác nhau của TD-1 đã được tại chỗ coadministered để streptozotocin gây ra bệnh tiểu đường chuột. Huyết thanh insulin (d) và glucose (e) trong máu được đo trước và 5 h sau khi. Có nghĩa là s.e.m. (n = 6 cho glucose và n 3 cho insulin). (f) transdermal gửi của hormone tăng trưởng nhân lực. 500 g tái tổ hợp hormone tăng trưởng nhân lực (> 95% tinh khiết) là tại chỗ coadministered để xử lý dexamethasone chuột với AP-1, hai liều khác nhau, TD-1, hoặc dung dịch muối như được chỉ ra. Tại các điểm thời gian sau khi, mức độ hormone tăng trưởng huyết thanh được đo. Có nghĩa là s.e.m. (n 3) * P < 0,05.Đầy đủ kích thước hình ảnh (61 KB)Để xác nhận giao hàng insulin và xác định cho dù TD-1-giao insulin có thể elicit tác dụng điều trị, chúng tôi sử dụng streptozotocin gây ra bệnh tiểu đường chuột. Không được điều trị bệnh tiểu đường chuột đo mức độ insulin đã tương đối không đổi, khác nhau, từ 0,2 đến cách 0.7 ng/ml, và đã rất có thể do mức thấp của nội sinh insulin hoặc một thành phần cross-reacting trong radioimmunoassay. Sau khi coadministration tại chỗ của một giải pháp mặn TD-1/porcine insulin (500:70 g), chúng tôi phát hiện insulin huyết thanh ở một mức độ cao lúc 2 h (0,66-1.18 ng/ml, P = 0,100, so với TD-1 một mình), đạt vị trí tại 5 h (2,85-4.76 ng/ml, P = 0,002) và quay trở lại cơ sở cấp tại 11 h (0,37-0,81 ng/ml, P = 0.169) sau khi (hình 1b). Tương ứng, lượng đường trong máu giảm lúc 2 h (65.7-84.4%, P = 0.004, so với TD-1 một mình) sau khi quản trị, đạt mức thấp nhất tại 8 h (16.2-38.4%, P = 6.7710e-005) và được duy trì ở mức độ đáng kể giảm cho ít 11 h (25.4-52,9%, P = 0.000149) (hình 1 c). Kiểm soát peptide AP-1 đã không hoạt động. CPE kết hợp natri laureth

Kết quả (Việt) 2:

Transdermal giao protein bởi một peptide dùng đồng thời xác định thông qua màn hình hiển thị phage
Yongping Chen1,2, Yuanyuan Shen1,2, Xin Guo1,2, Caoshou Zhang1, Wenjuan Yang1, Minglu MA1, Shu Liu1, Maobin Zhang1 & Long-Ping Wen1
Tóm tắt
thẩm thấu qua da hiệu quả phân phối thuốc thuốc ưa nước lớn là một thách thức. Dưới đây chúng tôi báo cáo rằng các peptide tổng hợp ngắn, ACSSSPSKHCG, xác định bởi trong cơ thể thực khuẩn màn hình hiển thị, tạo điều kiện phân phối thuốc protein thẩm thấu qua da hiệu quả thông qua da còn nguyên vẹn. Dùng đồng thời các peptide và insulin cho da bụng của chuột bị tiểu đường dẫn đến mức hệ thống cao của insulin và ức chế nồng độ glucose huyết thanh cho ít nhất 11 h. Sinh khả dụng hệ thống quan trọng của hormone tăng trưởng của con người cũng đã đạt được khi tại chỗ dùng chung với các peptide. Các hoạt động thẩm thấu qua da tăng cường của các peptide được trình tự cụ thể và phụ thuộc liều, không liên quan đến sự tương tác trực tiếp với insulin và kích hoạt sự thâm nhập của insulin vào nang lông ngoài độ sâu 600 m. Nghiên cứu thời gian trôi gợi ý rằng các peptide tạo ra một lỗ thoáng trong hàng rào da để kích hoạt thuốc phân tử để đạt được hệ tuần hoàn.
Giới thiệu
Là một cơ quan lớn nhất của cơ thể con người, da cung cấp một giao diện không đau cho delivery1 thuốc toàn thân, 2. Tuy nhiên, tính thấm của các phân tử nước ngoài, các phân tử ưa nước đặc biệt lớn, qua lớp sừng trên bề mặt da bên ngoài là vô cùng low3. Trong 50 năm qua một số lượng lớn các chất hỗ trợ hóa chất xâm nhập (CPE), thuộc các lớp khác nhau như bề mặt, các axit béo, các este béo và các hợp chất Azone giống, đã cho phép hạn chế enhancement4 thấm da, 5. CPE có hai hạn chế lớn : kích ứng da và không có khả năng để cung cấp các phân tử lớn. Nếu không nâng cao thể chất, qua trung gian iontophoresis6, ultrasound7 hoặc microneedles8, CPE nói chung là không thể cung cấp nồng độ điều trị của thuốc tương đối lớn (khối lượng phân tử> 500 Đà) qua da còn nguyên vẹn đến circulation9 hệ thống. Tiến bộ gần đây trong việc kiểm tra thông lượng cao để xác định enhancer combinations10 và ứng dụng thiết kế CPE principles11 có thể giúp vượt qua hai giới hạn này, nhưng transdermal giao hàng của các protein ưa nước lớn vẫn là một nhiệm vụ ghê gớm.
Thư viện hiển thị Phage peptide thường được sử dụng để có được chuỗi peptide được xác định tương tác với một phân tử đặc biệt. Có đến 109 peptide khác nhau được thể hiện trên bề mặt phage bởi phản ứng tổng hợp với một trong các protein bề mặt thực khuẩn, và các peptide mong muốn được lựa chọn trên cơ sở liên kết với các molecule12 mục tiêu. Thư viện phage đã được sử dụng để chọn cho peptide gắn vào protein cố định, carbohydrate, các tế bào được nuôi cấy và thậm chí cả vật chất vô cơ. Một phần mở rộng của kỹ thuật này là trong cơ thể hiển thị thể thực khuẩn, mà đòi hỏi phải tiêm một thư viện phage màn peptide vào dòng máu của một con vật và cách ly tiếp theo và xác định các thể thực khuẩn có khả năng nhà của một cơ quan cụ thể hoặc tissue13, 14, 15 . phage sợi, được biết đến được não sau khi tiêm mũi, đã được sử dụng như một tàu sân bay để cung cấp các kháng thể chống lại amyloid plaques16. Hơn nữa, một nghiên cứu gần đây được sử dụng trong màn hình hiển thị phage vivo để xác định trình tự peptide đó gây ra sự vận chuyển của thể thực khuẩn trên niêm mạc đường tiêu hóa barrier17. Những nghiên cứu này nhắc nhở chúng ta nghiên cứu xem trong màn vivophage có thể xác định peptide với khả năng thẩm thấu qua da.
Chúng tôi áp dụng tiến sĩ-C7C, một disulfide có hạn chế, thể thực khuẩn-hiển thị, thư viện peptide, lên da bụng của chuột khỏa thân BALB / cA và phục hồi hạt phage từ sự lưu thông máu. Phage phục hồi được khuếch đại và được sử dụng cho các vòng tiếp theo của trong vivoselection. Phage khuếch đại từ vòng đầu tiên trưng bày một hiệu quả thẩm thấu qua da hai đơn đặt hàng của các cường độ cao hơn so với các thể thực khuẩn thư viện. Sau vòng thứ hai, mười hai dòng vô tính đã chọn và trình tự ngẫu nhiên. Tám trong số họ bao gồm một sự chèn giống hệt trình tự nucleotide (gọi PH-1), trong đó mã hoá cho các peptide CSSSPSKHC hiển thị. Khi thử nghiệm trên chuột Wistar, một thể thực khuẩn đại diện mang theo trình tự này luôn vượt qua các rào cản da và đạt đến máu, đạt được một hiệu giá trung bình của 4556 hạt phage nhiễm mỗi ml máu 1 giờ sau khi bôi. Ngược lại, một thể thực khuẩn kiểm soát lựa chọn ngẫu nhiên từ thư viện trưng bày một hiệu giá bình quân 6,8 hạt phage nhiễm mỗi ml máu, với số không hạt phage nhiễm được phát hiện trong phần lớn các thí nghiệm (n = 16).
Như PH-1 khác với các phage ngẫu nhiên chỉ trong chuỗi peptide hiển thị, các peptide phage-hiển thị rất có thể tương tác với da để giúp da thẩm thấu rào cản của PH-1. Nếu các peptide hiển thị tương tác với da một cách cụ thể mà có thể được bão hòa, một dư thừa của các peptide hiển thị sẽ ức chế hoạt động PH-1 của thẩm thấu qua da. Để thử nghiệm mô hình này, chúng tôi tổng hợp được một peptide cyclic tên là TD-1 (ACSSSPSKHCG; A chầu và G được lấy từ lớp vỏ protein M13 và bao gồm để làm cho các peptide ổn định hơn). Theo dự kiến, dùng chung TD-1 ức chế hoạt động thẩm thấu qua da của PH-1 một cách liều phụ thuộc và ở những con số hơn 5 g, hoàn toàn bãi bỏ hoạt động PH-1 của thẩm thấu qua da (bổ sung hình. 1 trực tuyến). Một peptide kiểm soát tên AP-1 (ACNATLPHQCG; một chu kỳ 11-mer với chầu axit amin giống nhau và một chuỗi bên không liên quan) không ảnh hưởng đến khả năng đi qua da PH-1. Kết quả này gợi ý mạnh mẽ rằng hoạt động thẩm thấu qua da PH-1 liên quan đến một sự tương tác cụ thể giữa các hiển thị PH-1 peptide và một thành phần da không rõ.
Ngược lại với các hiệu ứng trên PH-1 thực khuẩn, dùng chung TD-1 tăng cường thâm nhập qua da của phage kiểm soát , nhưng hoạt động này là tương đối thấp và phần thiếu nhất quán, như chúng ta quan sát này hoạt động tăng cường về chỉ có 20% số chuột thử nghiệm (dữ liệu không hiển thị). Phát hiện này khiến chúng tôi điều tra xem liệu TD-1 có thể cung cấp các loại thuốc protein transdermally. Insulin được chọn là ứng cử viên đầu tiên thử nghiệm do nhu cầu thị trường cao để cung cấp thuốc này không xâm lấn. Chúng tôi dùng chung 125i-insulin và ba liều khác nhau của TD-1 cho da bụng (diện tích 4 cm2) của chuột và đo phóng xạ trong hệ tuần hoàn. Mức độ quan trọng của 125i được phát hiện trong máu toàn phần 2 h sau khi tiêm và tiếp tục tăng trong 24 h (Hình. 1a). Tất cả ba liều TD-1 có hiệu quả. Trong sự vắng mặt của TD-1, một mức 125i thấp đã được phát hiện trên nền trong máu, đặc biệt là 24 h sau khi dùng. Về nguyên tắc, 125i phát hiện trong máu có thể là một kết quả của bất kỳ những điều sau đây: (i) 125NaI ô nhiễm (125NaI, một phân tử nhỏ có mặt như một chất gây ô nhiễm (<5%) trong việc chuẩn bị 125i-insulin, có thể xuyên qua hàng rào da mà không cần sự trợ giúp của TD-1); (ii) sự xuống cấp của da 125i-insulin và sau đó giao của các sản phẩm phân hủy để máu; (iii) có hệ thống giao 125i-insulin mà không suy thoái ở da và với suy thoái trong máu; (iv) có hệ thống giao 125i-insulin mà không có bất kỳ suy thoái trong da và máu. Như insulin không thể đi qua được hàng rào da, mức thấp của 125i được phát hiện trong máu của chuột được điều trị mà không cần TD-1 tuổi có thể là do việc phân phối của một trong hai 125NaI hoặc bị suy thoái 125i-insulin.
Hình 1: phân phối thuốc protein có hệ thống trung gian bởi TD-1. (a) giao 125i-Insulin. 125i -insulin (5.000.000 cpm) đã được tại chỗ dùng chung với chuột bình thường với số lượng khác nhau của TD-1. Phóng xạ trong các mẫu máu được đo ở các thời điểm khác nhau sau khi uống. (b, c) Cung cấp nồng độ điều trị insulin. Chuột tiểu đường streptozotocin gây ra đã được tại chỗ tiêm như thể hiện, với liều sau: TD-1, 500 g; AP-1, 500 g; SLA / PP, 0,5% (wt / vol); insulin lợn, 70 g, với ngoại lệ của điều trị dưới da (14 g). Tại các thời điểm khác nhau sau khi uống, nồng độ trong huyết thanh insulin (b) và mức độ glucose trong máu (c) đã được đo. Nồng độ glucose được bình thường so với ban đầu (0 h) giá trị. Mean sem (n = 6 cho glucose và n 3 cho insulin). * P <0,05, ** P <0.01, *** P <0,001. (d, e) Liều lượng-phản ứng của TD-1. Insulin ở lợn (70 g) và liều lượng khác nhau của TD-1 được dùng chung tại chỗ để chuột tiểu đường streptozotocin gây ra. Insulin huyết thanh (d) và glucose máu (e) các cấp được đo trước và 5 h sau khi dùng. Mean sem (n = 6 cho glucose và n 3 cho insulin). (f) Transdermal giao hàng của hormone tăng trưởng của con người. 500 g của hormone tăng trưởng tái tổ hợp của con người (> 95% nguyên chất) đã được tại chỗ dùng chung cho những con chuột được điều trị bằng dexamethasone-AP-1, hai liều khác nhau của TD-1, hoặc nước muối như được chỉ ra. Tại các thời điểm khác nhau sau khi uống, nồng độ hormone tăng trưởng trong huyết thanh được đo. Mean sem (n 3) * P <0,05. Kích thước đầy đủ hình ảnh (61 KB) Để xác nhận giao hàng insulin và xác định xem insulin TD-1-chuyển giao có thể gợi ra những tác dụng điều trị, chúng tôi sử dụng chuột tiểu đường streptozotocin gây ra. Ở chuột bị tiểu đường không được điều trị các cấp độ đo được của insulin là tương đối ổn định, dao động từ 0,2 và 0,7 ng / ml, và đã có thể do mức độ thấp của insulin nội sinh hoặc một thành phần phản ứng chéo trong miễn dịch phóng xạ. Khi dùng đồng thời đề của một dung dịch muối của TD-1 / insulin lợn (500: 70 g), chúng tôi phát hiện insulin huyết thanh ở mức độ cao lúc 2 h (0,66-1,18 ng / ml, P = 0,100, so với TD-1 một mình ), đạt đỉnh điểm vào lúc 5 h (2,85-4,76 ng / ml, P = 0,002) và trở về mức cơ bản tại 11 h (0,37-0,81 ng / ml, P = 0,169) sau khi tiêm (Hình. 1b). Tương ứng, glucose máu giảm ở 2 h (65,7-84,4%, P = 0,004, so với TD-1 một mình) sau khi tiêm, đạt mức thấp nhất vào lúc 8 h (16,2-38,4%, P = 6.7710e-005) và được duy trì ở một mức giảm đáng kể cho ít nhất 11 h (25,4-52,9%, P = 0,000149) (Fig. 1c). Việc kiểm soát peptide AP-1 đã không hoạt động. Sự kết hợp giữa CPE sodium laureth