Journal of Virological Methods 187

Journal of Virological Methods 187 (2013) 138–143


Contents lists available at SciVerse ScienceDirect

Journal of Virological Methods


j ourna l ho me p ag e: www.elsevier.com/locate/jviromet




The validation and utility of a quantitative one-step multiplex RT real-time PCR
targeting Rotavirus A and Norovirus

Tran Thi Ngoc Dung a , Voong Vinh Phat a , Tran Vu Thieu Nga a , Phan Vu Tra My a , Pham Thanh Duy a , James I. Campbell a,b , Cao Thu Thuy a , Nguyen Van Minh Hoang a , Pham Van Minh a , Hoang Le Phuc c , Pham Thi Ngoc Tuyet d , Ha Vinh e , Duong Thi Hue Kien a , Huynh Le Anh Huy a , Nguyen Thanh Vinh a , Tran Thi Thu Nga a , Nguyen Thi Thu Hau d , Nguyen Tran Chinh e , Tang Chi Thuong c , Ha Manh Tuan d ,
Cameron Simmons a,b , Jeremy J. Farrar a,b , Stephen Baker a,b,∗

a The Hospital for Tropical Diseases, Wellcome Trust Major Overseas Programme, Oxford University Clinical Research Unit, Ho Chi Minh City, Viet Nam
b Centre for Tropical Diseases, University of Oxford, Oxford, United Kingdom
c Children’s Hospital 1, Ho Chi Minh City, Viet Nam
d Children’s Hospital 2, Ho Chi Minh City, Viet Nam
e The Hospital for Tropical Diseases, Chi Minh City, Viet Nam


a b s t r a c t

Article history:
Received 13 March 2012
Received in revised form
21 September 2012
Accepted 25 September 2012
Available online 6 October 2012

Keywords: Rotavirus Norovirus
Real-time PCR Quantitation Internally controlled

Rotavirus (RoV) and Norovirus (NoV) are the main causes of viral gastroenteritis. Currently, there is no validated multiplex real-time PCR that can detect and quantify RoV and NoV simultaneously. The aim of the study was to develop, validate, and internally control a multiplex one-step RT real-time PCR to detect and quantify RoV and NoV in stool samples. PCR sensitivity was assessed by comparing amplification against the current gold standard, enzyme immunoassay (EIA), on stool samples from 94 individuals with diarrhea and 94 individuals without diarrhea. PCR detected 10% more RoV positive samples than EIA in stools samples from patients with diarrhea. PCR detected 23% more NoV genogroup II positive samples from individuals with diarrhea and 9% more from individuals without diarrhea than EIA, respectively. Genotyping of the PCR positive/EIA negative samples suggested the higher rate of PCR positivity, in comparison to EIA, was due to increased sensitivity, rather than nonspecific hybridization. Quantitation demonstrated that the viral loads of RoV and NoV in the stools of diarrheal patients were an order of magnitude greater than in individuals without diarrhea. This internally controlled real-time PCR method is robust, exhibits a high degree of reproducibility, and may have a greater utility and sensitivity than commercial EIA kits.
© 2012 Elsevier B.V. All rights reserved.



1. Introduction

Diarrhea remains a major cause of childhood morbidity and mortality globally (Thapar et al., 2004; Wardlaw et al., 2010), with the vast majority of the 2 billion annual infections and
2.5 million resulting deaths occurring in low and middle-income countries. Viruses, specifically Rotavirus A (RoV) and genogroup I and II Norovirus (NoVI and II) are predominant causes of viral gastroenteritis worldwide, and are responsible for over
40% of all cases of diarrhea in developing countries (Davidson




∗ Corresponding author at: The Hospital for Tropical Diseases, Wellcome Trust Major Overseas Programme, Oxford University Clinical Research Unit, 764 Vo Van Kiet, Quan 5, Ho Chi Minh City, Viet Nam. Tel.: [phone]; fax: [phone].
E-mail address: [e-mail] (S. Baker).

et al., 2002; Patel et al., 2008; Widdowson et al., 2009). A vari- ety of techniques are used to detect RoV and NoV in stool samples, including electron microscopy (Caul, 1996a,b), latex agglutination (Lee et al., 2010), PCR amplification, and enzyme immunoassay (EIA) (Jiang et al., 2000). Commercial EIA kits are the most common methods used for diagnosis, as they offer simplicity and good specificity, but may lack overall sen- sitivity in some settings (Barreira et al., 2010; Ramani et al.,
2010). Typically, the sensitivity of viral detection in biological material can be increased using molecular methods (Freeman et al., 2008; Kageyama et al., 2003), with real-time reverse transcriptase (RT) PCR having advantages over conventional RT- PCR (Freeman et al., 2008; Trujillo et al., 2006). The aim of the study was to develop and validate a multiplex one-step RT real-time PCR, controlled internally, to detect and quantify RoV and NoV in stool samples from individuals with and without diarrhea.

0166-0934/$ – see front matter © 2012 Elsevier B.V. All rights reserved.
http://dx.doi.org/10.1016/j.jviromet.2012.09.021

Sequences and concentrations of primers and probes used in this study.

Viral target Target region/amplicon size Primer/probe name Sequencesa Final conc. ( M) Reference
RoV Non-structural protein
3 (NSP3)/87 bp NVP3-FDeg

NVP3-R1 ACC ATC TWC ACR TRA CCC TC
GGT CAC ATA ACG CCC CTA 1

1

Freeman et al. (2008)

NVP3-Probe TA
FAM-ATG AGC ACA ATA
0.125
GTT AAA AGC TAA CAC TGT CAA-BHQ1
NoVII ORF1-ORF2 junction/98 bp Cog 2F

Cog 2R CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG
TCG ACG CCA TCT TCA TTC 1

1

Trujillo et al. (2006)

Ring 2 ACA
Cyan500–TGG GAG GGC
0.125
GAT CGC AAT CT–BHQ1
NoVI ORF1-ORF2 junction/84 bp Cog 1F

Cog 1R CGY TGG ATG CGI TTY CAT GA
CTT AGA CGC CAT CAT CAT 1

1

Trujillo et al. (2006)

Ring 1 C TYA C
FAM–AGA TYG CGI TCI CCT
0.125
GTC CA–BHQ1
EAV EAV-F

EAV-R CAT CTC TTG CTT TGC TCC TTA G
AGC CGC ACC TTC ACA TTG 0.2

0.2

Hue et al. (2011)
EAV-probe Cyan500–CGC GCT CGC TGT CAG AAC AAC ATT ATT GCC CAC AGC GCG–BHQ3 0.05
a W = T, U, A; R = A, G; Y = C, T; B = C, G, T; N = any; I = inosine.

2. Materials and methods

2.1. Ethics statement

This study was conducted according to the principles expressed in the Declaration of Helsinki, and was approved by the ethical review boards of the Hospital for Tropical Diseases (HTD), Chil- dren’s Hospital 1 (CH1) and Children’s Hospital 2 (CH2) in Ho Chi Minh City in Viet Nam, and the Oxford Tropical Research Ethics Committee (OxTREC) in the United Kingdom. An informed consent form, signed by a parent or guardian, was required for participation.

2.2. Stool samples and sample processing

Stool samples were obtained from a group of symptomatic children (with diarrhea) and a group of asymptomatic children (without diarrhea). The symptomatic group consisted of 217 chil- dren, aged between 0 and 60 months, admitted to CH1, CH2 or HTD between May 2009 and April 2010 with acute watery diarrhea (defined as three or more loose stools without blood within a 24 h period). The asymptomatic group consisted of 277 children, aged between 0 and 60, attending CH2 for health checks between May
2009 and April 2010 without diarrhea. Stool specimens were col- lected from all participants within 24 h of hospital admission and
prior to antimicrobial treatment. All samples were stored at 4 ◦C
before transportation to the laboratory on the same day as collec- tion. Samples were assayed to detect RoV and NoV using ProspecT Rotavirus and IDEIA Norovirus EIA tests following manufacturer’s recommendations (Oxoid, United Kingdom). Two aliquots of each
sample were stored at −80 ◦C as 10% suspensions in distilled phos-
phate buffered saline (PBS).

2.3. Equine arterititis virus (EAV)

EAV was added to all samples prior to nucleic acid extraction as an internal control (Hue et al., 2011). Aliquots of post culturing supernatant containing EAV were prepared as described previously (Hue et al., 2011; Scheltinga et al., 2005). The precise amount of

virus added to the stool samples was assessed by PCR titration. The final EAV dilution used in the PCR assay produced Cp values between 30 and 33. Amplification runs that did not produce a Cp value within this range for EAV were discarded and samples were subjected to a secondary extraction and amplification.


2.4. NoV and RoV PCR amplification primers and probes

Primers, probes and their optimal concentrations are described in Table 1. Briefly, the RoV primers targeted the gene encoding non-structural protein 3 (NSP3) (Freeman et al., 2008), and the probe incorporated a FAM reporter and a BHQ1 quencher. The NoV primers and probes targeted the ORF1-ORF2 junction of NoV I and NoVII (Trujillo et al., 2006). The reporter of the NoVII probe was adapted from the probe published in Trujillo et al. (2006) from Quasar 670 (red) to Cyan 500 (blue–green) as these probes have a higher performance using the LightCycler format and as a conse- quence of the Cy5 tag of the internal control. The primers and probe for EAV were as previously described (Hue et al., 2011; Scheltinga et al., 2005).


2.5. Nucleic acid extractions and one-step RT Real-time PCR

Nucleic acid was extracted from bacterial and viral sources using the Wizard Nucleic Acid Purification Kit (Promega, USA) and the QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN, USA), respectively. Nucleic acid preparations were diluted to a concentration of 20 ng/ l, and
stored at −20 ◦C. For viral RNA extractions from stool, 140 l of stool
was inoculated with 20 l of EAV and subjected to an automated
extraction on a MagNA Pure 96 nucleic extraction system using the MagNA Pure 96 DNA and the Viral NA Small Volume Kit (Roche applied sciences, UK), according to the manufacturers recommen- dations. PCR amplifications were performed using RNA Master Hydrolysis Probes (Roche applied sciences, UK), and optimized with
1.4 l of activator on a LightCycler 480II (Roche applied sciences, UK). Thermal cycling was initiated at 61 ◦C for 3 min for reverse
tr

Kết quả (Việt) 1:

Tạp chí của phương pháp Virological 187 (2013) 138-143Nội dung danh sách có sẵn tại SciVerse ScienceDirectTạp chí Virological phương phápj ourna l ho tôi p ag e: www.elsevier.com/ xác định vị trí/jviromet Xác nhận và tiện ích của một One-bước định lượng Bits RT Đảng Cộng sản Romania thời gian thựcnhắm mục tiêu Rotavirus A và NorovirusTrần Thị Ngọc Dung a, Voong Vinh Phat a, trần vũ Thieu Nga một, Phan vũ trà của tôi a, Pham Thanh Duy a, James I. Campbell a, b, Cao Thu Thuy một, Hoàng Nguyễn Văn Minh a, phạm Văn Minh một, hoàng Le phúc c, phạm thị Ngọc tuyết d, Hà Vinh e, Duong Thi Huế kiên a, Huynh Lê Anh Huy một , Nguyễn Thanh Vinh một, trần thị Thu Nga a, Nguyễn thị Thu hậu d, Nguyễn trần Chinh e, Tang chí Thuong c, Hà mạnh Tuấn d,Cameron Simmons a, b, Jeremy J. Farrar a, b, Stephen Baker a, b, ∗một bệnh viện cho bệnh nhiệt đới, Wellcome Trust lớn ở nước ngoài chương trình, đơn vị nghiên cứu lâm sàng đại học Oxford, TP. Hồ Chí Minh, Việt Namb Trung tâm cho bệnh nhiệt đới, đại học Oxford, Oxford, Vương Quốc Anhbệnh viện trẻ em c 1, TP. Hồ Chí Minh, Việt Namd bệnh viện trẻ em của 2, TP. Hồ Chí Minh, Việt Name bệnh viện đối với bệnh nhiệt đới, HCM, Việt Nammột b s t r một t c Bài viết lịch sử:Nhận được 13 tháng 3 2012Nhận được trong hình thức sửa đổi21 tháng 9 năm 2011Được chấp nhận ngày 25 tháng 9 năm 2011Có sẵn trực tuyến 6 tháng 10 năm 2012Từ khóa: Rotavirus NorovirusThời gian thực Đảng Cộng sản Romania Quantitation nội bộ điều khiển Rotavirus (RoV) và Norovirus (tháng mười một) là những nguyên nhân chính của viêm dạ dày ruột virus. Hiện nay, có là không có PCR xác nhận multiplex thời gian thực, mà có thể phát hiện và định lượng RoV và tháng mười một đồng thời. Mục đích của nghiên cứu là để phát triển, xác nhận và nội bộ kiểm soát một One-Bước multiplex RT thời gian thực PCR để phát hiện và định lượng RoV và tháng mười một trong phân mẫu. Đảng Cộng sản Romania nhạy cảm được đánh giá bằng cách so sánh amplification chống lại các tiêu chuẩn vàng hiện tại, enzym immunoassay (EIA), trên các mẫu phân từ 94 cá nhân với tiêu chảy và 94 cá nhân mà không có tiêu chảy. Đảng Cộng sản Romania phát hiện 10% thêm RoV mẫu tích cực hơn so với dự án trong phân mẫu từ các bệnh nhân với tiêu chảy. Đảng Cộng sản Romania phát hiện 23% thêm ngày genogroup II tích cực mẫu từ các cá nhân với tiêu chảy và 9% từ các cá nhân mà không có tiêu chảy hơn là dự án, tương ứng. Gen của Đảng Cộng sản Romania tích cực/dự án tiêu cực mẫu đề nghị mức cao của Đảng Cộng sản Romania positivity, so với dự án, là do sự nhạy cảm tăng lên, chứ không phải là nonspecific lai ghép. Quantitation đã chứng minh rằng tải virus RoV và tháng mười một trong ghế đẩu bệnh nhân tiêu chảy là một thứ tự cường độ lớn hơn trong các cá nhân mà không có tiêu chảy. Phương pháp PCR thời gian thực nội bộ kiểm soát này là mạnh mẽ, trưng bày một mức độ cao của reproducibility, và có thể có một tiện ích lớn hơn và nhạy cảm hơn thương mại dự án bộ dụng cụ. © 2012 Elsevier B.V Tất cả các quyền. 1. giới thiệuTiêu chảy vẫn là một nguyên nhân chính của thời thơ ấu tỷ lệ mắc và tử vong trên toàn cầu (Thapar et al., năm 2004; Wardlaw et al., 2010), với phần lớn các bệnh nhiễm trùng 2 tỷ hàng năm và2,5 triệu quả là cái chết xảy ra ở các nước thu nhập trung bình và thấp. Vi-rút, specifically Rotavirus A (RoV) và genogroup I và II Norovirus (NoVI và II) là nguyên nhân chủ yếu của virus viêm dạ dày ruột trên toàn thế giới, và có trách nhiệm hơn40% của tất cả các trường hợp tiêu chảy trong nước đang phát triển (Davidson∗ Corresponding tác giả tại: The bệnh viện bệnh nhiệt đới, Wellcome Trust lớn ở nước ngoài chương trình, Oxford University nghiên cứu lâm sàng đơn vị, 764 Võ Văn Kiệt, Quận 5, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. Điện thoại: + 84 839 239210; Fax: + 84 839 238904.E-mail địa chỉ: [e-mail] (S. Baker). et al., 2002; Patel et al., năm 2008; Widdowson et al., 2009). Vari-ety kỹ thuật được sử dụng để phát hiện RoV và tháng mười một trong phân mẫu, bao gồm cả kính hiển vi điện tử (chài, 1996a, b), cao su agglutination (Lee et al., 2010), amplification Đảng Cộng sản Romania, và enzym immunoassay (EIA) (Giang và ctv., 2000). Thương mại dự án bộ dụng cụ là phương pháp phổ biến nhất được sử dụng để chẩn đoán, khi họ cung cấp đơn giản và tốt specificity, nhưng có thể thiếu sen-sitivity tổng thể trong một số cài đặt (Barreira et al., 2010; Hoang et al.,2010). thông thường, sự nhạy cảm của các phát hiện virus trong vật liệu sinh học có thể được tăng lên bằng cách sử dụng phương pháp phân tử (Freeman et al., năm 2008; Kageyama et al., 2003), với thời gian thực reverse transcriptase (RT) Đảng Cộng sản Romania có lợi thế hơn thông thường RT - PCR (Freeman et al., năm 2008; Trujillo et al., 2006). Mục đích của nghiên cứu là để phát triển và xác nhận mua phiên bản thời gian thực PCR One-Bước multiplex RT, kiểm soát nội bộ, để phát hiện và định lượng RoV và tháng mười một trong phân mẫu từ các cá nhân có và không có tiêu chảy. 0166-0934 / $ – xem trước vấn đề © 2012 Elsevier B.V Tất cả các quyền.http://DX.Doi.org/10.1016/j.jviromet.2012.09.021 Trình tự và nồng độ của chất nền, mồi và đầu dò được sử dụng trong nghiên cứu này.Virus mục tiêu mục tiêu vùng/amplicon kích thước mồi/thăm dò tên cuối cùng Sequencesa conc. tham khảo (M)Phòng Không RoV-cấu trúc protein3 (NSP3) / 87 bp NVP3-FDegNVP3-R1 ACC ATC TWC ACR TRÀ CCC TCGGT CAC ATA ACG CCC CTA 11 Freeman et al. (2008) NVP3-thăm dò TAFAM-ATG AGC ACA ATA 0,125 GTT AAA AGC TAA CAC TGT CAA-BHQ1 NoVII ORF1-ORF2 giao lộ/98 bp Cog 2FCOG 2R xe GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AGTCG ACG CCA TCT TCA TTC 11 Trujillo et al. (2006) Vòng 2 ACACyan500-TGG GAG GGC 0,125 GAT CGC AAT CT-BHQ1 NoVI ORF1-ORF2 giao lộ/84 bp Cog 1FCOG 1R CGY TGG ATG CGI TTY mèo GACTT AGA CGC CAT CAT CAT 11 Trujillo et al. (2006) Vòng 1 C TYA CFAM-AGA TYG CGI TCI CCT 0,125 GTC CA-BHQ1 EAV EAV-FEAV-R MÈO CTC TTG CTT TGC TCC TTA GAGC CGC ACC TTC ACA TTG 0,20,2 Huế et al. (2011) EAV-thăm dò Cyan500-CGC GCT CGC TGT CAG AAC AAC ATT ATT GCC CAC AGC GCG-BHQ3 0,05 một W = T, U, A; R = A, G; Y = C, T; B = C, G, T; N = bất kỳ; Tôi = inosine. 2. tài liệu và phương pháp2.1. đạo Đức tuyên bốNghiên cứu này được thực hiện theo các nguyên tắc thể hiện trong tuyên bố Helsinki, và được tán thành bởi Hội đồng xem xét lại đạo đức của bệnh viện nhiệt đới bệnh (HTD), Haru-dren bệnh viện 1 (CH1) và trẻ bệnh viện 2 (CH2) tại thành phố Hồ Chí Minh ở Việt Nam, và Oxford nhiệt đới nghiên cứu đạo Đức ban (OxTREC) ở Vương Quốc Anh. Một hình thức thông báo chấp thuận, chữ ký của cha mẹ hoặc người giám hộ, là cần thiết cho sự tham gia.2.2. phân mẫu và mẫu chế biếnCác mẫu phân được lấy từ một nhóm các trẻ em có triệu chứng (với tiêu chảy) và một nhóm các trẻ em không có triệu chứng (không có tiêu chảy). Nhóm có triệu chứng bao gồm 217 Haru-dren, độ tuổi giữa 0 và 60 tháng, thừa nhận để CH1, CH2 hoặc HTD giữa tháng 5 năm 2009 và tháng tư năm 2010 với tiêu chảy chảy nước cấp tính (defined như ba hoặc nhiều hơn phân lỏng lẻo mà không có máu trong một khoảng thời gian 24 h). Nhóm không có triệu chứng bao gồm 277 trẻ, tuổi từ 0 đến 60, tham dự CH2 cho kiểm tra sức khỏe giữa ngàynăm 2009 và tháng tư năm 2010 mà không có tiêu chảy. Mẫu vật phân là đại tá-lected từ tất cả những người tham gia trong vòng 24 h döoùi vàtrước khi điều trị kháng sinh. Tất cả các mẫu được lưu trữ tại 4 ◦Ctrước khi vận chuyển đến phòng thí nghiệm trong cùng một ngày như là cách-tion. Mẫu đã được assayed để phát hiện RoV và tháng mười một bằng cách sử dụng khách hàng tiềm năng Rotavirus và IDEIA Norovirus dự án kiểm tra sau đây của nhà sản xuất khuyến nghị (Oxoid, Vương Quốc Anh). Hai aliquots của mỗimẫu được lưu trữ tại −80 ◦C như đình chỉ 10% ở cất phos-phate đệm saline (PBS).2.3. ngựa arterititis virus (EAV)EAV đã được thêm vào tất cả các mẫu trước khi axit nucleic khai thác như là một kiểm soát nội bộ (Huế và ctv., năm 2011). Aliquots của bài đánh supernatant có EAV đã được chuẩn bị như mô tả trước đó (Huế et al., năm 2011; Scheltinga et al., 2005). Số tiền chính xác của virus được bổ sung vào các mẫu phân được đánh giá bởi Đảng Cộng sản Romania chuẩn độ. Pha loãng EAV ngoài được sử dụng trong các khảo nghiệm PCR sản xuất Cp giá trị giữa 30 và 33. Amplification chạy mà không sản xuất một giá trị Cp trong phạm vi này cho EAV đã bị loại bỏ và mẫu đã phải chịu một trung khai thác và amplification.2.4. Tháng mười một và Đảng Cộng sản Romania RoV amplification chất nền, mồi và đầu dòChất nền, mồi, thăm dò và nồng độ tối ưu của họ được mô tả trong bảng 1. Briefly, lớp lót RoV nhắm mục tiêu các gen mã hóa không phải là cấu trúc protein 3 (NSP3) (Freeman et al., 2008), và thăm dò kết hợp một phóng viên FAM và một quencher BHQ1. Tháng mười một chất nền, mồi và đầu dò nhắm mục tiêu giao lộ ORF1-ORF2 ngày tôi và NoVII (Trujillo và ctv., 2006). Các phóng viên thăm dò NoVII đã được chuyển thể từ các thăm dò công bố ở Trujillo et al. (2006) từ Quasar 670 (màu đỏ) để Cyan 500 (blue-green) khi các đầu dò có một hiệu suất cao bằng cách sử dụng định dạng LightCycler và như là một conse-quence của Cy5 thẻ của kiểm soát nội bộ. Chất nền, mồi và thăm dò cho EAV sống như mô tả trước đó (Huế và ctv., 2011; Scheltinga et al., 2005).2.5. axit Nucleic nhổ và One-Bước RT Real-time PCRAxit nucleic được chiết xuất từ vi khuẩn và virus nguồn bằng cách sử dụng thuật sĩ Nucleic Acid Purification Kit (Promega, Hoa Kỳ) và QIAamp virus RNA Mini Kit (QIAGEN, Hoa Kỳ), tương ứng. Chế phẩm axit nucleic được pha loãng với một nồng độ 20 ng / l, vàlưu trữ ở nhiệt độ-20 ◦C. Cho virus RNA nhổ từ phân, 140 l phânđược tiêm chủng với 20 l EAV và phải chịu một tự độngkhai thác trên một hệ thống khai thác nucleic MagNA Pure 96 sử dụng MagNA Pure 96 DNA và virus NA nhỏ khối lượng bộ (Roche áp dụng khoa học, UK), theo các nhà sản xuất recommen-dations. Đảng Cộng sản Romania amplifications đã được thực hiện bằng cách sử dụng đầu dò thủy phân RNA Master (Roche áp dụng khoa học, UK), và tối ưu hóa với1.4 l kích hoạt trên một 480II LightCycler (Roche áp dụng khoa học, UK). Chạy xe đạp nhiệt đã được khởi xướng tại 61 ◦C cho 3 phút để đảo ngượctr

Kết quả (Việt) 2:

Tạp chí của phương pháp phát virus 187 (2013) 138-143 Nội dung danh sách có sẵn tại SciVerse ScienceDirect Tạp chí Phương pháp phát virus j ourna l ho tôi p ag e: www.elsevier.com/locate/jviromet Việc xác và tiện ích của một một bước multiplex định lượng RT real-time PCR nhắm Rotavirus A và Norovirus Trần Thị Ngọc Dung một, Voong Vinh Phát một, Trần Vũ Thiệu Nga một, Phan Vũ Trà My một, Phạm Thanh Duy một, James I. Campbell a, b, Cao Thu Thuy một Nguyễn Văn Minh Hoàng một, Phạm Văn Minh một, Hoàng Lê Phúc c, Phạm Thị Ngọc Tuyết d, e Hà Vinh, Dương Thị Huế Kiên một, Huỳnh Lê Anh Huy một, Nguyễn Thanh Vinh một, Trần Thị Thu Nga một, Nguyễn Thị Thu Hậu d, Nguyễn Trần Chính e, Tang Chi Thuong c, Hà Mạnh Tuấn d, Cameron Simmons a, b, Jeremy Farrar J. a, b, Stephen Baker a, b, * một Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới, Wellcome Chương trình Niềm tin lớn ở nước ngoài, Đại học Oxford nghiên cứu lâm sàng Unit, Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam b Trung tâm Bệnh Nhiệt đới, Đại học Oxford, Oxford, Vương quốc Anh c Bệnh viện Nhi Đồng 1, Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam Bệnh viện d Nhi Đồng 2, Hồ Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam e Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới, Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam một bstract Điều lịch sử: Nhận 13 tháng 3 năm 2012 nhận bằng hình thức sửa đổi ngày 21 tháng 9 năm 2012 được chấp nhận ngày 25 tháng 9 năm 2012 có sẵn trực tuyến ngày 06 tháng 10 năm 2012 Từ khóa: Rotavirus Norovirus gian thực time PCR định lượng kiểm soát nội Rotavirus (RoV) và Norovirus (tháng) là những nguyên nhân chính của viêm dạ dày ruột do virus. Hiện nay, không có xác nhận multiplex real-time PCR có thể phát hiện và định lượng RoV và NOV cùng một lúc. Mục đích của nghiên cứu là để phát triển, xác nhận, và nội bộ kiểm soát một multiplex một bước RT real-time PCR để phát hiện và định lượng RoV và nov trong mẫu phân. Nhạy PCR được đánh giá bằng cách so sánh ampli fi cation so với tiêu chuẩn hiện hành vàng, xét nghiệm miễn dịch enzyme (EIA), trên các mẫu phân từ 94 cá nhân có tiêu chảy và 94 cá nhân mà không bị tiêu chảy. PCR phát hiện hơn 10% mẫu dương tính RoV hơn EIA trong phân mẫu từ bệnh nhân bị tiêu chảy. PCR phát hiện hơn 23% Nov genogroup II mẫu tích cực từ các cá nhân có tiêu chảy và 9% nhiều hơn từ các cá nhân mà không bị tiêu chảy hơn EIA, tương ứng. Định kiểu gen của các tích cực / tiêu cực EIA mẫu PCR đề nghị tỷ lệ cao hơn của dương PCR, so với EIA, là do tăng nhạy cảm, hơn là nonspeci fi c lai. Định lượng đã chứng minh rằng lượng virus của RoV và nov trong phân của bệnh nhân tiêu chảy là một đơn đặt hàng của các cường độ lớn hơn ở những người không bị tiêu chảy. Điều này kiểm soát nội bộ theo thời gian thực phương pháp PCR là mạnh mẽ, thể hiện một mức độ cao của khả năng tái, và có thể có một tiện ích lớn hơn và nhạy hơn so với bộ dụng cụ EIA thương mại. © 2012 Elsevier BV Tất cả các quyền. 1. Giới thiệu Tiêu chảy vẫn là nguyên nhân chính của bệnh tật và tử vong ở trẻ em trên toàn cầu (Thapar et al, 2004;. Wardlaw et al, 2010)., với đại đa số các bệnh nhiễm trùng 2 tỷ hàng năm và 2,5 triệu ca tử vong xảy ra trong kết quả có thu nhập thấp và trung bình nước. Virus, fi Speci Cally Rotavirus A (RoV) và genogroup I và II Norovirus (Novi và II) là nguyên nhân chủ yếu của viêm dạ dày ruột do virus trên toàn thế giới, và chịu trách nhiệm cho hơn 40% của tất cả các trường hợp tiêu chảy ở các nước đang phát triển (Davidson * Tác giả tại: Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới, Chương trình Wellcome Trust lớn ở nước ngoài, Đại học Oxford nghiên cứu lâm sàng Unit, 764 Võ Văn Kiệt, Quan 5, Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam Tel .: [phone]; fax:.. [phone] E- địa chỉ mail: [e-mail] (S. Baker). et al, 2002; Patel et al, 2008; Widdowson et al, 2009).... Một ety vari các kỹ thuật được sử dụng để phát hiện RoV và nov trong các mẫu phân, như kính hiển vi điện tử (màng mỏng, 1996a, b), ngưng kết latex (Lee et al., 2010), PCR ampli fi cation, và enzyme nghiệm miễn dịch (EIA) (Jiang et al., 2000). Bộ dụng cụ EIA thương mại là phương pháp phổ biến nhất được sử dụng để chẩn đoán, vì họ cung cấp sự đơn giản và tốt Speci fi thành phố, nhưng có thể thiếu sitivity sen- tổng thể trong một số cài đặt (Barreira et al, 2010;.. Ramani et al, 2010). Thông thường, độ nhạy phát hiện virus trong các vật liệu sinh học có thể được tăng lên bằng cách sử dụng phương pháp phân tử (Freeman et al, 2008;.. Kageyama et al, 2003), với thời gian thực sao chép ngược (RT) PCR có lợi thế hơn thông thường RT-PCR ( Freeman et al, 2008;.. Trujillo et al, 2006). Mục đích của nghiên cứu là để phát triển và xác nhận một multiplex một bước RT real-time PCR, kiểm soát nội bộ, để phát hiện và định lượng RoV và nov trong các mẫu phân từ các cá nhân có và không có tiêu chảy. 0166-0934 / $ - xem vấn đề trước © 2012 Elsevier BV Tất cả quyền được bảo lưu. http://dx.doi.org/10.1016/j.jviromet.2012.09.021 Sequences và nồng độ của mồi và đầu dò được sử dụng trong nghiên cứu này. Viral mục tiêu khu vực Target / size amplicon Primer / tên thăm dò Sequencesa conc Final. (M) Reference RoV phi cấu trúc protein 3 (NSP3) / 87 bp NVP3-FDeg NVP3-R1 ACC ATC TWC ACR TRA CCC TC GGT CAC ATA ACG CCC CTA 1 1 Freeman et al. (2008) NVP3-Probe TA FAM-ATG AGC ACA ATA 0,125 GTT AAA AGC TAA CAC TGT-CAA BHQ1 ngã ba Novii ORF1-ORF2 / 98 bp Cog 2F Cog 2R CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG TCG ACG CCA TCT TCA TTC 1 1 Trujillo et al. (2006) Ring 2 ACA Cyan500-TGG GAG GGC 0,125 GAT CGC AAT CT-BHQ1 Novi ORF1-ORF2 ngã ba / 84 bp Cog 1F Cog 1R CGY TGG ATG CGI TTY CAT GA CTT AGA CGC CAT CAT CAT 1 1 Trujillo et al. (2006) Ring 1 C TYA C FAM-AGA TYG CGI TCI CCT 0,125 GTC CA-BHQ1 EAV EAV-F EAV-R CAT CTC TTG CTT TGC TCC TTA G AGC CGC ACC TTC ACA TTG 0,2 0,2 Huế et al. (2011) EAV-dò Cyan500-CGC GCT CGC TGT CAG AAC AAC ATT ATT GCC CAC AGC GCG-BHQ3 0,05 W = T, U, A; R = A, G; Y = C, T; B = C, G, T; N = có; Tôi = inosine. 2. Vật liệu và phương pháp 2.1. Đạo đức báo cáo nghiên cứu này được tiến hành theo các nguyên tắc thể hiện trong Tuyên ngôn Helsinki, và đã được phê duyệt bởi Hội đồng xét đạo đức của Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới (HTD), Bệnh viện 1 con cái của (CH1) và Bệnh viện Nhi Đồng 2 (CH 2) tại thành phố Hồ Chí Minh tại Việt Nam, và nhiệt đới Ban Oxford nghiên cứu Đạo đức (OxTREC) ở Vương quốc Anh. Một hình thức có sự đồng ý, có chữ ký của cha mẹ hoặc người giám hộ, đã được yêu cầu để tham gia. 2.2. Mẫu phân và xử lý mẫu mẫu phân thu được từ một nhóm trẻ em có triệu chứng (tiêu chảy) và một nhóm trẻ em có triệu chứng (không có tiêu chảy). Các nhóm triệu chứng gồm 217 con cái, ở độ tuổi từ 0 đến 60 tháng, nhập CH1, CH2 hoặc HTD giữa tháng năm 2009 và tháng 4 năm 2010 với tiêu chảy cấp tính (de định nghĩa là ba hoặc lỏng hơn phân không có máu trong một khoảng thời gian 24 h) . Các nhóm không có triệu chứng gồm 277 trẻ em có độ tuổi từ 0 đến 60, tham dự CH2 kiểm tra sức khỏe giữa tháng năm 2009 và tháng 4 năm 2010 mà không bị tiêu chảy. Mẫu phân đã được đồng nghiệp lected từ tất cả những người tham gia trong vòng 24 h nhập viện và trước khi điều trị kháng sinh. Tất cả các mẫu được lưu trữ ở 4 ◦C trước khi vận chuyển đến phòng thí nghiệm trên cùng một ngày như gom. Các mẫu đã được kiểm định để phát hiện và RoV Nov sử dụng Prospect Rotavirus và Norovirus IDEIA EIA kiểm tra sau khuyến nghị của nhà sản xuất (Oxoid, Vương quốc Anh). Hai phân ước của mỗi mẫu được lưu trữ ở -80 ◦C là 10% bị đình chỉ trong chưng cất, phospho phate đệm mặn (PBS). 2.3. Ngựa rút arterititis (EAV) EAV được thêm vào tất cả các mẫu trước khi khai thác axit nucleic như một kiểm soát nội bộ (Huế et al., 2011). Dung dòch bưu nuôi nổi chứa EAV đã được chuẩn bị như mô tả trước đây (Huế et al 2011,;. Scheltinga et al, 2005.). Số lượng chính xác của vi rút thêm vào mẫu phân được đánh giá bằng cách chuẩn độ PCR. Các fi nal pha loãng EAV được sử dụng trong các xét nghiệm PCR tạo giá trị Cp giữa 30 và 33. Ampli fi cation chạy mà không tạo ra một giá trị Cp trong phạm vi này cho EAV đã được loại bỏ và các mẫu đã phải chịu một chiết trung và ampli fi cation. 2.4. Nov và RoV PCR ampli fi mồi cation và đầu dò mồi, thăm dò và nồng độ tối ưu của họ được mô tả trong Bảng 1. Brie fl y, mồi RoV nhắm mục tiêu các gen mã hóa protein không cấu trúc 3 (NSP3) (Freeman et al., 2008), và thăm dò kết hợp một phóng viên FAM và một BHQ1 thức uống. Các mồi Nov và đầu dò mục tiêu ngã ba ORF1-ORF2 của NOV tôi và Novii (Trujillo et al., 2006). Các phóng viên của tàu thăm dò Novii được chuyển thể từ thăm dò được công bố tại Trujillo et al. (2006) từ Quasar 670 (màu đỏ) để Cyan 500 (màu xanh-màu xanh lá cây) như các đầu dò có một hiệu suất cao hơn bằng cách sử dụng định dạng LightCycler và như là một dãy quả của các tag Cy5 của kiểm soát nội bộ. Các mồi và thăm dò EAV được mô tả như trước đây (Huế et al 2011,;. Scheltinga et al, 2005.). 2.5. Chiết axit nucleic và một bước RT Real-time PCR Nucleic Acid được chiết xuất từ các nguồn vi khuẩn và virus, sử dụng Wizard Nucleic Acid Puri fi cation Kit (Promega, USA) và Kit QIAamp Viral RNA Mini (Qiagen, USA), tương ứng. Axit nucleic được pha loãng với nồng độ 20 ng / l, và được lưu trữ ở -20 ◦C. Đối với việc nhổ RNA của virus từ các phân, 140 l phân được tiêm với 20 l của EAV và bị một tự động khai thác trên một tinh khiết 96 hệ thống khai thác nucleic Magna sử dụng Magna tinh khiết 96 DNA và Viral NA Khối lượng nhỏ Kit (Roche áp dụng khoa học, Vương quốc Anh), theo nghị của nhà sản xuất khuyến. PCR cation fi ampli đã được thực hiện bằng cách sử dụng RNA tổng thể thủy phân Probes (Roche áp dụng khoa học, Vương quốc Anh), và tối ưu hóa với 1,4 l của activator trên LightCycler 480II (Roche áp dụng khoa học, Anh). Đi xe đạp nhiệt đã được bắt đầu tại 61 ◦C 3 phút cho reverse tr