The p53 reporter construct was desi

The p53 reporter construct was designed as follows: 4 repeats of a blunt HindIII/SPHI 3 × p53 consensus responsive element (p53RE) (GAACATGCCCAACATGTTG) [26] fragment were inserted into a promoter-less luciferase reporter-construct pLuc [12]. For the Nrf2-construct, two oligos were synthesized (GeneArt®/Invitrogen) containing four different EPRE sequences: 1 × consensus
EPRE (TCACAGTGACTAAGCAAAAT), 1 × hNQO1 EPRE (TCACAGTGAC TCAGCAGAAT), 1 × hGCLM EPRE (AGACAATGACTAAGCAGAAA) and 1 × hGCLC EPRE (TCACAGTCAGTAAGTGATGG). The two oligos were also ligated into a promoterless luciferase reporter-construct pLuc [12]. The luciferase control-vector for the Cytotox CALUX consisted of the luciferase reporter inserted into a pSG5-neo [12]
expression vector. In all plasmids, a minimal TATA promoter sequence was inserted downstream in the pGL3-basic construct. Because the U2OS cells express both the p53 and the Nrf2 pathways endogenously, a selection construct (pSG5-neo) was used to differentiate between expressing and non-expressing clones by use of G418 [12].

Kết quả (Việt) 1:

Xây dựng PV p53 được thiết kế như sau: 4 lặp đi lặp lại của cùn HindIII/SPHI 3 × p53 đồng thuận đáp ứng nguyên tố (p53RE) (GAACATGCCCAACATGTTG) [26] đoạn đã được chèn vào một promoter-ít luciferase phóng viên xây dựng pLuc [12]. Cho xây dựng, Nrf2, hai oligos đã tổng hợp (GeneArt®/Invitrogen) chứa 4 khác nhau EPRE trình tự: 1 × đồng thuậnEPRE (TCACAGTGACTAAGCAAAAT), 1 × hNQO1 EPRE (TCACAGTGAC TCAGCAGAAT), 1 × hGCLM EPRE (AGACAATGACTAAGCAGAAA) và 1 × hGCLC EPRE (TCACAGTCAGTAAGTGATGG). Hai oligos cũng được ligated vào một promoterless luciferase phóng viên xây dựng pLuc [12]. Kiểm soát luciferase-vector cho Cytotox CALUX bao gồm các phóng viên luciferase chèn vào một pSG5-neo [12]vector biểu hiện. Trong tất cả các plasmid, một chuỗi các promoter TATA tối thiểu đã được đưa vào hạ trong xây dựng cơ bản pGL3. Bởi vì các tế bào U2OS nhận cả p53 và con đường Nrf2 endogenously, một xây dựng lựa chọn (pSG5-neo) được sử dụng để phân biệt giữa thể hiện và không thể hiện dòng vô tính bằng việc sử dụng G418 [12].

Kết quả (Việt) 2:

Các cấu trúc p53 phóng viên đã được thiết kế như sau: 4 lần lặp lại của một cùn HindIII / SPHI 3 × p53 đồng thuận yếu tố đáp ứng (p53RE) (GAACATGCCCAACATGTTG) [26] đoạn đã được đưa vào một promoter ít luciferase phóng-xây dựng pLuc [12]. Đối với các Nrf2-xây dựng, hai oligos được tổng hợp (GeneArt® / Invitrogen) gồm bốn chuỗi EPRE khác nhau: 1 × đồng thuận
EPRE (TCACAGTGACTAAGCAAAAT), 1 × hNQO1 EPRE (TCACAGTGAC TCAGCAGAAT), 1 × hGCLM EPRE (AGACAATGACTAAGCAGAAA) và 1 × hGCLC EPRE (TCACAGTCAGTAAGTGATGG). Hai oligos cũng được gắn vào một promoterless luciferase phóng-xây dựng pLuc [12]. Các luciferase điều khiển vector cho Cytotox CALUX gồm các phóng viên luciferase chèn vào một pSG5-neo [12]
vector biểu hiện. Trong tất cả các plasmid, một trình tự promoter TATA tối thiểu đã được đưa vào dây chuyền trong các cấu trúc pGL3-cơ bản. Bởi vì các tế bào U2OS hiện cả p53 và các con đường nội sinh Nrf2, một cấu trúc lựa chọn (pSG5-neo) được sử dụng để phân biệt giữa các thể hiện và không thể hiện nhân bản bằng cách sử dụng G418 [12].

Kết quả (Việt) 3:

Phóng viên như sau: 4 p53 cấu trúc thiết kế lặp lại cùn enzyme cắt / 3 * p53 yếu tố phản ứng phù hợp (p53re) (gaacatgcccaacatgttg) [26] những con báo cáo hoạt động chèn gen tạo ra ít PLUC [12].Với cấu trúc của Nrf2, tổng hợp hai loại (Geneart ® / Invitrogen) gồm 4 người: Its 1 * * * * trình tự khác nhau.Its (tcacagtgactaagcaaaat), 1 * hnqo1 EPRE (tcacagtgac tcagcagaat), 1 * hgclm EPRE (agacaatgactaagcagaaa) và 1 * hgclc EPRE (tcacagtcagtaagtgatgg).Hai cũng được kết nối với một con báo cáo hoạt động gen xây dựng PLUC [12].Tế bào của cơ thể vector điều khiển của của báo cáo pSG5 chèn gen mới. [12]Hãng bày tỏ.Trong tất cả các plasmid, một người con trai út của chuỗi khởi động chèn hạ lưu pGL3-Basic xây dựng.Bởi vì U2OS bày tỏ trong tế bào và lựa chọn con đường Nrf2 p53, cấu trúc (new material) là dùng để phân biệt thể hiện và không thể hiện bản, dùng G418 lọc [12].