IntroductionGalactose oxidase (GalO

Introduction
Galactose oxidase (GalOx1; d-galactose:oxygen 6-oxidoreductase, EC 1.1.3.9) is a monomeric 68-kDa enzyme that contains a single copper ion [1] and an amino acid-derived cofactor [2] and [3], formed by cross-linking of a Cys and a Tyr residue in the direct vicinity of the copper [4], [5] and [6]. The thioether bond of the Tyr-Cys cross-link is post-translationally generated [4] and [7] and has been shown to affect the stability, the reduction potential [8] and the catalytic efficiency of the enzyme [9] and [10]. It has been classified as a member of the carbohydrate active-enzyme family AA5, subfamily 2 [11]. GalOx catalyzes the two-electron oxidation [3] and [12] of the C6-hydroxyl group of nonreducing d-galactose residues [13] as well as a range of primary alcohols to the corresponding aldehydes with concomitant reduction of oxygen to hydrogen peroxide [14], [15], [16] and [17]. During catalysis both the metal ion and the cysteine-modified tyrosine group undergo 1-electron redox interconversions [18]. Despite a wide substrate specificity, GalOx is strictly regioselective and no secondary alcohols are oxidized [19]. However, the enzyme accepts a wide variety of primary alcohols such as benzyl alcohol [20], and glycerol [21] as reducing substrates. GalOx displays remarkable stereospecificity in its reaction with sugars [22], being highly sensitive for the orientation of the C4-OH group, and hence it shows activity with galactose but not with glucose. Because of this specificity, various analytical techniques are based on GalOx, such as the determination of lactose in milk and dairy products [23] or the histochemical examination of mucus-secreting cells [24]. Furthermore, GalOx has been used in biosensors for the measurement of galactose and its derivatives in biological fluids [25], to label galactose residues in glycoconjugates [26], and for the induction of interferon in human lymphocyte culture [27] and [28]. GalOx is viewed as a competitive and cost-effective catalyst compared to chemical conversion for the manufacturing of fine chemicals for pharmaceutical purposes or in food industry, for example GalOx was used for conversion of sugars like d-galactose to food-grade cross-linking agents [29], [30], [31] and [32]. Another important application for GalOx is the istomodification of cell surface carbohydrates and has been used in cell labeling studies and hchemical staining [19]. GalOx is interesting for the use in industrial processes such as derivatization of guar gum and related polymers as well [33] and [34].


The enzyme is secreted by a number of fungal species, of which Fusarium graminearum (formerly classified as Dactylium dendroides) is the most extensively studied [35], [36], [37], [38], [39], [40], [41], [42] and [43]. The production and purification of GalOx has been reported from its natural fungal source [26], [39], [44], [45], [46], [47], [48] and [49], furthermore, various GalOx genes were cloned and successfully expressed in the filamentous fungi Aspergillus nidulans [50] and [51], Aspergillusoryzae and Fusarium venenatum [52], which have no endogenous GalOx, in the methylotrophic yeast Pichia pastoris [4], [10], [33], [36], [53], [54], [55] and [56] and in the bacterium Escherichia coli [55], [57], [58] and [59]. Typically, wild-type fungal GalOx is produced as a preproform carrying an N-terminal signal sequence, which is removed upon secretion, yielding the immature proform. The prosequence in this form was suggested to function as an intramolecular chaperone supporting copper binding and cofactor formation [42] and [50]. The maturation of GalOx requires several successive steps including cleavage of the signal sequence, which directs translocation, metal binding and cofactor processing [12] and [43]. Subsequently, the prosequence is removed and the Tyr-Cys cofactor is formed by self-processing reactions [2] and [7].

In the present paper we describe cloning and recombinant expression of a new gao gene without its prepro sequence from Fusarium sambucinum in E. coli. Furthermore, the purification and biochemical characterization of the enzyme are reported. Alternative electron acceptors, and possible activators as well as inhibitors were tested for their effect on GalOx activity

Kết quả (Việt) 1:

Giới thiệuGalactose oxidase (GalOx1; d-galactose:oxygen 6-oxidoreductase, EC 1.1.3.9) is a monomeric 68-kDa enzyme that contains a single copper ion [1] and an amino acid-derived cofactor [2] and [3], formed by cross-linking of a Cys and a Tyr residue in the direct vicinity of the copper [4], [5] and [6]. The thioether bond of the Tyr-Cys cross-link is post-translationally generated [4] and [7] and has been shown to affect the stability, the reduction potential [8] and the catalytic efficiency of the enzyme [9] and [10]. It has been classified as a member of the carbohydrate active-enzyme family AA5, subfamily 2 [11]. GalOx catalyzes the two-electron oxidation [3] and [12] of the C6-hydroxyl group of nonreducing d-galactose residues [13] as well as a range of primary alcohols to the corresponding aldehydes with concomitant reduction of oxygen to hydrogen peroxide [14], [15], [16] and [17]. During catalysis both the metal ion and the cysteine-modified tyrosine group undergo 1-electron redox interconversions [18]. Despite a wide substrate specificity, GalOx is strictly regioselective and no secondary alcohols are oxidized [19]. However, the enzyme accepts a wide variety of primary alcohols such as benzyl alcohol [20], and glycerol [21] as reducing substrates. GalOx displays remarkable stereospecificity in its reaction with sugars [22], being highly sensitive for the orientation of the C4-OH group, and hence it shows activity with galactose but not with glucose. Because of this specificity, various analytical techniques are based on GalOx, such as the determination of lactose in milk and dairy products [23] or the histochemical examination of mucus-secreting cells [24]. Furthermore, GalOx has been used in biosensors for the measurement of galactose and its derivatives in biological fluids [25], to label galactose residues in glycoconjugates [26], and for the induction of interferon in human lymphocyte culture [27] and [28]. GalOx is viewed as a competitive and cost-effective catalyst compared to chemical conversion for the manufacturing of fine chemicals for pharmaceutical purposes or in food industry, for example GalOx was used for conversion of sugars like d-galactose to food-grade cross-linking agents [29], [30], [31] and [32]. Another important application for GalOx is the istomodification of cell surface carbohydrates and has been used in cell labeling studies and hchemical staining [19]. GalOx is interesting for the use in industrial processes such as derivatization of guar gum and related polymers as well [33] and [34].Men tiêu hóa được bài tiết bởi một số loài nấm, trong đó Fusarium graminearum (trước đây được phân loại là Dactylium dendroides) là nghiên cứu rộng rãi nhất [35], [36], [37], [38], [39], [40], [41], [42] và [43]. Sản xuất và thanh lọc của GalOx đã được báo cáo từ nguồn tự nhiên nấm [26], [39], [44], [45], [46], [47], [48] và [49], hơn nữa, nhiều GalOx gen đã được nhân bản và thành công thể hiện trong sợi nấm Aspergillus nidulans [50] và [51], Aspergillusoryzae và Fusarium venenatum [52], mà đã không có GalOx nội sinh, trong nấm men methylotrophic Pichia pastoris [4], [10], [33], [36] , [53], [54], [55] và [56] và trong các vi khuẩn Escherichia coli [55], [57], [58] và [59]. Thông thường, loại hoang nấm GalOx được sản xuất như là một preproform thực hiện một chuỗi tín hiệu N thiết bị đầu cuối, mà được lấy ra sau khi tiết, năng suất các non proform. Prosequence trong hình thức này đã được đề xuất để hoạt động như một đi kèm intramolecular hỗ trợ đồng ràng buộc và hình thành cofactor [42] và [50]. Sự trưởng thành của GalOx đòi hỏi một số bước kế tiếp trong đó có cát khai của chuỗi tín hiệu, mà chỉ đạo translocation, kim loại ràng buộc và cofactor xử lý [12] và [43]. Sau đó, các prosequence được lấy ra và cofactor Tyr-Cys được hình thành bằng cách tự xử lý phản ứng [2] và [7].Trong giấy hiện nay chúng tôi mô tả thể hiện nhân bản và tái tổ hợp của một gen gao mới mà không có của nó tự prepro từ Fusarium sambucinum trong E. coli. Hơn nữa, làm sạch và các đặc tính sinh hóa của enzyme được báo cáo. Chất nhận khác ở điện tử, và có thể tính cũng như các chất ức chế đã được thử nghiệm cho hiệu quả của họ trên GalOx hoạt động

Kết quả (Việt) 2:

Giới thiệu
Galactose oxidase (GalOx1; d-galactose: Oxy 6-oxidoreductase, EC 1.1.3.9) là một enzyme 68-kDa monomeric có chứa một ion đồng duy nhất [1] và một đồng yếu tố amino axit có nguồn gốc từ [2] và [3] hình thành do liên kết ngang của một Cys và một dư lượng Tyr trong vùng lân cận trực tiếp của đồng [4], [5] và [6]. Các trái phiếu Thiôête của Tyr-Cys cross-link là hậu translationally tạo [4] và [7] và đã được chứng minh là ảnh hưởng đến sự ổn định, giảm tiềm năng [8] và hiệu quả xúc tác của enzyme [9] và [ 10]. Nó đã được phân loại như là một thành viên của các carbohydrate hoạt động enzyme gia đình AA5, phân họ 2 [11]. GalOx xúc tác cho quá trình oxy hóa hai electron [3] và [12] của nhóm C6-hydroxyl của nonreducing d-galactose dư lượng [13] cũng như một loạt các rượu chính cho các aldehyde tương ứng với giảm đồng thời với oxy để hydrogen peroxide [ 14], [15], [16] và [17]. Trong xúc tác cả các ion kim loại và các nhóm tyrosine cysteine ​​biến đổi trải qua 1-electron interconversions oxi hóa khử [18]. Mặc dù có một bề mặt đặc hiệu rộng, GalOx là đúng regioselective và không có rượu thứ cấp được oxy hóa [19]. Tuy nhiên, các enzyme chấp nhận nhiều loại rượu chính như benzyl alcohol [20], và glycerol [21] như giảm chất nền. GalOx hiển thị stereospecificity đáng chú ý trong phản ứng của nó với đường [22], là rất nhạy cảm đối với sự định hướng của nhóm C4-OH, và do đó nó cho thấy hoạt động với galactose mà không có glucose. Do tính đặc biệt này, các kỹ thuật phân tích khác nhau dựa trên GalOx, chẳng hạn như quyết tâm của lactose trong sữa và các sản phẩm sữa [23] hoặc việc khám histochemical của các tế bào nhầy tiết ra [24]. Hơn nữa, GalOx đã được sử dụng trong các cảm biến sinh học để đo galactose và các dẫn xuất của nó trong dịch sinh học [25], để nhãn dư lượng galactose trong glycoconjugates [26], và cho cảm ứng của interferon trong văn hóa nhân loại lymphocyte [27] và [28] . GalOx được xem như là một chất xúc tác cạnh tranh và hiệu quả chi phí so với chuyển đổi hóa học để sản xuất các hóa chất tốt cho mục đích dược phẩm hoặc trong ngành công nghiệp thực phẩm, ví dụ GalOx đã được sử dụng để chuyển đổi các loại đường như d-galactose cho các đại lý liên kết ngang cấp thực phẩm [29], [30], [31] và [32]. Một ứng dụng quan trọng cho GalOx là istomodification của carbohydrates bề mặt tế bào và đã được sử dụng trong nghiên cứu tế bào ghi nhãn và nhuộm hchemical [19]. GalOx là thú vị cho việc sử dụng trong các quá trình công nghiệp như dẫn suất của guar gum và liên quan polyme cũng [33] và [34]. Các enzyme được tiết ra bởi một số loài nấm, trong đó Fusarium graminearum (trước đây là phân loại như Dactylium dendroides) là nghiên cứu rộng rãi nhất [35], [36], [37], [38], [39], [40], [41], [42] và [43]. Việc sản xuất và tinh chế các GalOx đã được báo cáo từ các nguồn nấm tự nhiên của nó [26], [39], [44], [45], [46], [47], [48] và [49] Hơn nữa, GalOx khác nhau gen đã được nhân bản vô tính và thể hiện trong các nấm Aspergillus nidulans sợi thành công [50] và [51], Aspergillusoryzae và Fusarium venenatum [52], mà không có nội sinh GalOx, trong men Pichia pastoris methylotrophic [4], [10], [33 ], [36], [53], [54], [55] và [56] và trong vi khuẩn Escherichia coli [55], [57], [58] và [59]. Thông thường, hoang dại GalOx nấm được sản xuất như một preproform mang theo một trình tự tín hiệu N-terminal, được dỡ bỏ sau khi bài tiết, năng suất các PROFORM chưa trưởng thành. Các prosequence theo hình thức này đã được đề xuất để hoạt động như một chaperone intramolecular hỗ trợ đồng ràng buộc và đồng yếu tố hình thành [42] và [50]. Sự trưởng thành của GalOx đòi hỏi nhiều bước kế tiếp bao gồm sự phân tách các chuỗi tín hiệu, mà sự chuyển hướng, liên kết kim loại và chế biến cofactor [12] và [43]. Sau đó, các prosequence được loại bỏ và các đồng yếu tố Tyr-Cys được hình thành bởi các phản ứng tự chế [2] và [7]. Trong báo cáo này chúng tôi mô tả nhân bản và tái tổ hợp biểu hiện của một gen gao mới mà không tự prepro từ Fusarium sambucinum trong E. coli. Hơn nữa, việc làm sạch và đặc tính sinh hóa của các enzyme được báo cáo. Chất nhận electron thay thế, và kích hoạt có thể cũng như các chất ức chế đã được thử nghiệm cho hiệu quả của chúng đối với hoạt động GalOx