C. Enzymatic AssayThe assay of enzy

C. Enzymatic Assay
The assay of enzymatic activity toward EROD
involves providing the isolated CYP1A microsomal
fraction containing the enzyme with 7-ER
and the appropriate cofactors and fluorometrically
measuring the formation of the single metabolite,
resorufin. Activity in the samples is standardized
based on protein content of the microsomes (Lowry
et al., 1951; Bradford, 1976; Lorenzen and Kennedy,
1993). The measurement of resorufin production
has been accomplished with a variety of protocols
(Table 3). Originally, resorufin concentration was
determined using spectrophotometers or spectrofluorometers
that were not automated and could
accommodate only a small number of samples
(Burke and Mayer, 1974; Pohl and Fouts, 1980).
Automated fluorescence microwell plate scanners
have allowed faster processing of large numbers
of samples with reliability equal to or greater than
former methods (Eggens and Galgani, 1992;
Kennedy and Jones, 1994). Tyle et al. (1991)
found a good correlation between spectrophotometric
(Klotz et al., 1984) and fluorometric (Burke
and Mayer, 1974) measures of EROD activity in
rainbow trout, although they found that the
fluorometric assay provided greater repeatability
and shorter reaction times in noninduced fishes
compared with the spectrophotometric method.
To detect resorufin fluorometrically, excitation
and emission wavelengths are generally set at 530
and 580 nm, respectively. These excitation and
emission maxima are beyond the range of wavelengths
where amino acids (e.g., tryptophan present
in microsomes) or NADPH (nicotine adenine dinucleotide-phosphate, see below) interfere (Burke
and Mayer, 1974). After a suitable amount of time
for the EROD reaction to occur, the extent of
fluorescence increase should be calibrated to an
authentic resorufin standard (Burke et al., 1985).
Spectrofluorometric estimation of the purity of
resorufin standards used to calibrate EROD measurements
is an essential step in the assay (Stagg
and Addison, 1995; Pluta, 1995). Extinction coefficients
reported for resorufin have varied among
laboratories and therefore should be reported to
ensure comparability among data sets (Goksøyr
and Förlin, 1992).
Enzymatic activity can be estimated through the
use of batch assays, in which the amount of resorufin
produced is measured after a fixed period of time, or
as kinetic assays, in which resorufin production is
repeatedly measured at 60- to 90-s intervals
(Melancon, 1996). Kinetic assays yield more data
per sample, increasing the confidence level in EROD
estimates when compared with batch assay and are
easily run using automated microwell plate scanners
(Hodson et al., 1996). Regardless of the assay type,
data used in EROD calculations must be selected
from the portion of the reaction that is linear. The
kinetic assay allows for direct observation of the
reaction curve, providing greater confidence in results
than the batch assay.
Choice of reagents used in the assay (buffers,
cofactors, etc.) differ between labs, but in general
microsomal preparations are combined with a buffer
(pH 6.8 to 8.0), Mg2+, NADPH, and 7-ER. The
buffer pH and type can influence EROD measurements
(Burke and Wolf, 1987). CYP1A activity
is pH-dependent, and there are tissue and species
differences in optimal pH that range from approximately
7.2 to 8.0 (Kennedy and Jones, 1994).
Klotz et al. (1984) reported that scup liver microsomal
EROD activity had a sharp pH-dependence
with a peak between pH 7.8 and 8.0. Other assays
report lower values; optimal pH of 6.8 and 7.5 are
reported for measurement of EROD in Nile tilipia
(Oreochromis niloticus) and mudfish (Clarias
anguillaris), respectively (Gadagbui et al., 1996).
Assays that measure both EROD activity and protein
simultaneously should be conducted at a pH
that yields the best performance for both reactions.
Kennedy and Jones (1994) found that pH
8.0 was suitable for the measurement of EROD
and at the same time yielded high fluorescence
intensity of proteins bound to fluorescamine (see
below). In examining two different buffers at the
same pH, Arinç and Sen (1994) determined that
0.05 and 0.1 M NaCl with HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-
N-2, ethane sulfonic acid) yielded
significantly lower EROD activities in gilthead
seabream than assays using phosphate buffer. An
interlaboratory comparison of EROD assay methods
for rat liver microsomes reported that an assay
buffer based on TRIS-HCl (0.1 M final concentration,
pH 7.8) resulted in higher EROD activity
compared to a phosphate buffer (0.1 M final concentration,
pH 7.8, Rutten et al., 1992). Ionic strength
of buffers (Ic) is seldom reported, but can influence
EROD reaction rates due to its effect on
solubility. An optimal value of Ic = 0.2 has been
reported by Klotz et al. (Klotz et al., 1984) for
scup microsomes and Ic = 0.6 for Poeciliopsis sp.
(Goddard et al., 1987). Although buffer pH and
type can have significant influences on absolute
EROD activity measurements, comparisons of relative
degrees of EROD induction among fish will
not be influenced by this if assay conditions are
kept constant. If, however, time and resources
permit, optimization of EROD assay buffer can
allow for lower limits of detection and increased
confidence in detecting differences between
EROD activities close in value.
The effect of MgSO4 (providing Mg2+ ) in the
incubation mixture appears to be dependent on the
assay method, the species examined, or both. Pohl
and Fouts (1980) found that omission of MgSO4
decreased EROD activity 20 to 30% in mammals. In
other experiments with mammals, the presence of
Mg2+ did not appear to be essential in the EROD assay
(Burke and Mayer, 1974; Kennedy and Jones, 1994).
The effect of Mg2+ on the level of EROD activity in
fish seems to be species specific. Omission of Mg2+
from the reaction mixture resulted in a statistically
significant 30% decrease in EROD activity in white
sucker PMS but had no effect on EROD activity in
rainbow trout PMS (Munkittrick et al., 1993). If the
effect of Mg2+ has not been reported for a certain
species being examined, its effectiveness should be
tested using positive control microsome samples from
that species and reported in the literature.

Kết quả (Việt) 1:

C. enzym để khảo nghiệmKhảo nghiệm hoạt động enzyme đối với ERODliên quan đến việc cung cấp bị cô lập CYP1A microsomalphần nhỏ có chứa enzym với 7-ERvà thích hợp cofactors và fluorometricallyđo sự hình thành của chất chuyển hóa đơn,resorufin. Các hoạt động trong các mẫu được chuẩn hóaDựa trên protein nội dung của microsomes (Lowryet al., năm 1951; Bradford, 1976; Lorenzen và Kennedy,Năm 1993). đo resorufin sản xuấtđã được thực hiện với một loạt các giao thức(Bảng 3). Ban đầu, tập trung resorufin làxác định bằng cách sử dụng máy đo quang phổ hoặc spectrofluorometersmà không được tự động và có thểphù hợp với chỉ một số ít mẫu(Burke và Mayer, 1974; Pohl và Fouts, 1980).Huỳnh quang tự động microwell mảng máy quétcó cho phép xử lý số lượng lớn nhanh hơnmột mẫu với độ tin cậy bằng hoặc lớn hơnphương pháp cũ (Eggens và Galgani, 1992;Kennedy và Jones, 1994). Tyle et al. (1991)tìm thấy một sự tương quan tốt giữa spectrophotometric(Klotz và ctv., 1984) và fluorometric (Burkevà Mayer, 1974) các biện pháp của EROD hoạt động trongcá hồi cầu vồng, mặc dù họ thấy rằng cácfluorometric khảo nghiệm cung cấp lớn hơn độvà thời gian phản ứng ngắn hơn trong noninduced cáso với các phương pháp spectrophotometric.Để phát hiện resorufin fluorometrically, kích thíchvà bước sóng phát xạ thường được thiết lập tại 530và 580 nm, tương ứng. Kích thích vàphát thải maxima là vượt ra ngoài phạm vi của các bước sóngnơi các axit amin (ví dụ như, tryptophan hiện naytrong microsomes) hoặc NADPH (nicotin adenine dinucleotide-phosphate, xem dưới đây) can thiệp (Burkevà Mayer, 1974). Sau một khoảng thời gian thích hợpcho phản ứng EROD xảy ra, trong phạm vi củahuỳnh quang tăng nên được hiệu chỉnh để mộtxác thực resorufin tiêu chuẩn (Burke và ctv., 1985).Spectrofluorometric ước lượng về độ tinh khiết củatiêu chuẩn resorufin được sử dụng để hiệu chỉnh số đo ERODlà một bước quan trọng trong khảo nghiệm (Staggvà Addison, 1995; Pluta, 1995). Hệ số tuyệt chủngbáo cáo cho resorufin có khác nhau trong sốPhòng thí nghiệm và do đó nên được báo cáo chođảm bảo comparability giữa các bộ dữ liệu (Goksøyrvà Förlin, 1992).Enzym để hoạt động có thể được ước tính thông qua cácviệc sử dụng hàng loạt thử nghiệm, trong đó số lượng resorufinsản xuất được đo sau một thời gian cố định của thời gian, hoặcnhư là động lực thử nghiệm, trong đó resorufin sản xuất làliên tục đo tại khoảng s 60 đến 90(Melancon, 1996). Động lực thử nghiệm mang lại nhiều dữ liệumột mẫu, tăng mức độ tự tin trong ERODước tính khi so sánh với hàng loạt khảo nghiệm vàdễ dàng chạy bằng cách sử dụng tự động microwell mảng máy quét(Hodson et al., 1996). Bất kể loại khảo nghiệm,dữ liệu được sử dụng trong tính toán EROD phải được chọntừ phần phản ứng là tuyến tính. Cácđộng khảo nghiệm cho phép cho các quan sát trực tiếp của cácphản ứng đường cong, cung cấp sự tự tin hơn trong các kết quảhơn khảo nghiệm hàng loạt.Sự lựa chọn của chất sử dụng trong các khảo nghiệm (bộ đệm,cofactors, vv) khác biệt giữa phòng thí nghiệm, nhưng nói chungchuẩn bị microsomal kết hợp với một bộ đệm(pH 6.8 để 8,0), Mg2 +, NADPH, và 7-ER. Cácbộ đệm pH và loại có thể ảnh hưởng đến số đo EROD(Burke và Wolf, 1987). Hoạt động CYP1Aphụ thuộc vào độ pH, và có những mô và loàisự khác biệt trong tối ưu pH dao động từ khoảng7.2 để 8,0 (Kennedy và Jones, 1994).Klotz et al. (1984) báo cáo rằng scup gan microsomalHoạt động EROD có một sắc nét độ pH-sự phụ thuộcvới một đỉnh cao giữa độ pH 7.8 và 8,0. Thử nghiệm khácbáo cáo giá trị thấp hơn; tối ưu pH của 6.8 và 7,5báo cáo cho đo lường EROD trong Nile tilipia(Oreochromis niloticus) và mudfish (cáanguillaris), tương ứng (Gadagbui và ctv., 1996).Thử nghiệm đánh giá hoạt động EROD và proteincùng một lúc nên được thực hiện tại một pHđó mang lại hiệu suất tốt nhất cho cả hai phản ứng.Kennedy và Jones (1994) tìm thấy rằng độ pH8,0 là phù hợp để đo ERODvà đồng thời mang lại sự phát huỳnh quang caocường độ của protein ràng buộc để fluorescamine (xemdưới đây). Trong kiểm tra hai bộ đệm khác nhau tại cáccùng một độ pH, Arinç và Sen (1994) xác định rằng0,05 và cách 0.1 M NaCl với HEPES (N-2 - hydroxyethylpiperazine -N -2, êtan sulfonic acid) mang lạithấp hơn đáng kể EROD hoạt động trong giltheadseabream hơn thử nghiệm bằng cách sử dụng bộ đệm phosphat. Mộtso sánh interlaboratory EROD khảo nghiệm phương phápĐối với chuột gan microsomes báo cáo rằng một khảo nghiệmbộ đệm dựa trên TRIS-HCl (cách 0.1 M cuối cùng tập trung,pH 7.8) kết quả là cao hơn EROD hoạt độngso với một bộ đệm phosphat (cách 0.1 M cuối cùng tập trung,pH 7.8, Rutten et al., 1992). Ion sức mạnhcủa bộ đệm (Ic) hiếm khi được báo cáo, nhưng có thể ảnh hưởng đếnTỷ lệ phản ứng EROD do hiệu ứng của nó trênđộ hòa tan. Một giá trị tối ưu của Ic = 0.2 đãbáo cáo bởi Klotz et al. (Klotz và ctv., 1984) choscup microsomes và Ic = 0,6 cho Poeciliopsis sp.(Goddard et al., 1987). Mặc dù đệm pH vàloại có thể có ảnh hưởng đáng kể trên tuyệt đốiĐo EROD hoạt tính các so sánh tương đốiđộ EROD cảm ứng trong số cá sẽkhông bị ảnh hưởng bởi điều này nếu khảo nghiệm điều kiệnGiữ liên tục. Nếu, Tuy nhiên, thời gian và tài nguyêncho phép, tối ưu hóa của EROD khảo nghiệm bộ đệm có thểcho phép cho thấp hơn giới hạn phát hiện và tăngsự tự tin trong việc phát hiện sự khác biệt giữaEROD hoạt động đóng trong giá trị.Tác dụng của MgSO4 (cung cấp Mg2 +) trong cácấp hỗn hợp dường như là phụ thuộc vào cáckhảo nghiệm các phương pháp, các loài kiểm tra, hoặc cả hai. Pohlvà Fouts (1980) tìm thấy rằng thiếu sót của MgSO4giảm hoạt động EROD 20-30% trong động vật có vú. ỞCác thí nghiệm với động vật có vú, sự hiện diện củaMG2 + đã không xuất hiện để được cần thiết trong các khảo nghiệm EROD(Burke và Mayer, 1974; Kennedy và Jones, 1994).Tác dụng của Mg2 + cấp độ của EROD hoạt động trongcá có vẻ là loài cụ thể. Các thiếu sót của Mg2 +từ hỗn hợp phản ứng dẫn đến một thống kêđáng kể giảm 30% EROD hoạt động trong trắngsucker PMS nhưng đã không ảnh hưởng EROD hoạt động trongRainbow trout PMS (Munkittrick và ctv., 1993). Nếu cáctác dụng của Mg2 + đã không được báo cáo cho một sốloài đang được kiểm tra, hiệu quả của nó nênthử nghiệm bằng cách sử dụng tích cực kiểm soát microsome mẫu từloài đó và báo cáo trong các tài liệu.

Kết quả (Việt) 2:

C. enzyme Khảo nghiệm
Xét nghiệm hoạt động của enzym đối EROD
liên quan đến việc cung cấp các CYP1A microsome cô lập
phần có chứa các enzyme với 7-ER
và các đồng yếu tố thích hợp và fluorometrically
đo sự hình thành các chất chuyển hóa duy nhất,
resorufin. Hoạt động trong các mẫu được chuẩn hóa
dựa trên hàm lượng protein trong microsomes (Lowry
et al, 1951;. Bradford, 1976; Lorenzen và Kennedy,
1993). Việc đo sản xuất resorufin
đã được thực hiện với một loạt các giao thức
(Bảng 3). Ban đầu, tập trung resorufin được
xác định bằng cách sử dụng quang phổ hoặc spectrofluorometers
mà không được tự động và có thể
chứa chỉ một số lượng nhỏ các mẫu
(Burke và Mayer, 1974; Pohl và Fouts, 1980).
máy quét tấm huỳnh quang microwell Automated
đã cho phép xử lý nhanh hơn của một số lượng lớn
các mẫu với độ tin cậy tương đương hoặc lớn hơn so với
các phương pháp cũ (Eggens và Galgani, 1992;
Kennedy và Jones, 1994). Tyle et al. (1991)
tìm thấy một mối tương quan tốt giữa quang phổ
(Klotz et al., 1984) và fluorometric (Burke
và Mayer, 1974) Các biện pháp của hoạt động EROD trong
cá hồi vân, mặc dù họ đã tìm thấy rằng các
xét nghiệm fluorometric cung cấp lặp lại lớn hơn
và thời gian phản ứng ngắn hơn trong noninduced cá
so với các phương pháp quang phổ.
Để phát hiện resorufin fluorometrically, kích thích
và phát xạ bước sóng thường được đặt ở 530
và 580 nm, tương ứng. Những kích thích và
phát xạ cực đại là vượt ra ngoài phạm vi của các bước sóng
mà các axit amin (ví dụ, hiện tại tryptophan
trong microsomes) hoặc NADPH (adenine dinucleotide nicotine-phosphate, xem bên dưới) can thiệp (Burke
và Mayer, 1974). Sau một khoảng thời gian thích hợp
cho các phản ứng EROD xảy ra, mức độ
tăng huỳnh quang phải được hiệu chuẩn để một
tiêu chuẩn resorufin xác thực (Burke et al., 1985).
ước Spectrofluorometric độ tinh khiết của
các tiêu chuẩn resorufin sử dụng để hiệu chỉnh đo EROD
là một bước quan trọng trong việc khảo nghiệm (Stagg
và Addison, 1995; Pluta, 1995). Hệ số Extinction
báo cáo cho resorufin đã có khác nhau giữa
các phòng thí nghiệm và do đó cần được báo cáo để
đảm bảo tính so sánh giữa các bộ dữ liệu (Goksøyr
và Förlin, 1992).
hoạt động enzyme có thể được ước tính thông qua
sử dụng các xét nghiệm hàng loạt, trong đó số lượng resorufin
sản xuất được đo sau một khoảng thời gian cố định thời gian, hoặc
là thử nghiệm động học, trong đó sản xuất resorufin được
nhiều lần đo ở 60 đến 90 của chu kỳ
(Melancon, 1996). Xét nghiệm Kinetic mang lại nhiều dữ liệu
cho mỗi mẫu, tăng mức độ tự tin trong EROD
ước tính khi so sánh với hàng loạt thử nghiệm và được
dễ dàng chạy chương trình quét tấm microwell tự động
(Hodson et al., 1996). Bất kể loại khảo nghiệm,
dữ liệu được sử dụng trong tính toán EROD phải được lựa chọn
từ các phần của phản ứng đó là tuyến tính. Các
khảo nghiệm động học cho phép quan sát trực tiếp của các
đường cong phản ứng, cung cấp sự tự tin hơn trong các kết quả
hơn so với khảo nghiệm hàng loạt.
Lựa chọn thuốc thử sử dụng trong khảo nghiệm (bộ đệm,
cofactors, vv) khác nhau giữa các phòng thí nghiệm, nhưng nói chung
các chế microsome được kết hợp với một đệm
(pH 6,8-8,0), Mg2 +, NADPH, và 7-ER. Các
pH đệm và loại có thể ảnh hưởng đến phép đo EROD
(Burke và Wolf, 1987). Hoạt động CYP1A
là pH phụ thuộc, và có những mô và các loài
khác biệt ở pH tối ưu là từ khoảng
7,2-8,0 (Kennedy và Jones, 1994).
Klotz et al. (1984) báo cáo rằng gan scup microsome
hoạt động EROD có một sắc nét pH phụ thuộc
với một đỉnh cao giữa pH 7,8 và 8,0. Các xét nghiệm khác
báo cáo giá trị thấp hơn; pH tối ưu là 6,8 và 7,5 được
báo cáo để đo EROD trong Nile tilipia
(Oreochromis niloticus) và mudfish (Clarias
anguillaris), tương ứng (Gadagbui et al., 1996).
Xét nghiệm có thể đo cả hai hoạt động EROD và protein
đồng thời phải được tiến hành tại một pH
rằng sản lượng hiệu quả tốt nhất cho cả hai phản ứng.
Kennedy và Jones (1994) thấy rằng pH
8,0 là thích hợp cho việc đo EROD
và đồng thời mang lại huỳnh quang cao
cường độ của các protein liên kết với fluorescamine (xem
bên dưới). Khi xem xét hai bộ đệm khác nhau tại
cùng một pH, Arinc và Sen (1994) xác định rằng
0,05 và 0,1 M NaCl với HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-
N? -2, axit sulfonic etan) cũng cho thấy
hoạt động EROD thấp hơn đáng kể ở gilthead
tráp hơn xét nghiệm sử dụng đệm phosphate. Một
so sánh liên phòng của phương pháp khảo nghiệm EROD
cho microsomes gan rat báo cáo rằng một xét nghiệm
dựa trên đệm Tris-HCl (0,1 M nồng độ cuối cùng,
pH 7,8) cho kết quả hoạt động EROD cao hơn
so với một bộ đệm phosphate (0,1 M nồng độ cuối cùng,
pH 7,8, Rutten et al., 1992). Cường độ ion
của bộ đệm (Ic) hiếm khi được báo cáo, nhưng có thể ảnh hưởng đến
tốc độ phản ứng EROD do ảnh hưởng của
độ hòa tan. Một giá trị tối ưu của Ic = 0,2 đã được
báo cáo bởi Klotz et al. (Klotz et al., 1984) cho
microsomes scup và Ic = 0,6 cho Poeciliopsis sp.
(Goddard et al., 1987). Mặc dù pH đệm và
loại có thể có ảnh hưởng đáng kể đến tuyệt đối
đo hoạt EROD, so sánh tương đối
mức độ EROD cảm ứng giữa các loài cá sẽ
không bị ảnh hưởng bởi điều này nếu có điều kiện khảo nghiệm được
giữ không đổi. Tuy nhiên, nếu thời gian và nguồn lực
cho phép, tối ưu hóa các EROD khảo nghiệm bộ đệm có thể
cho phép giới hạn thấp hơn của phát hiện và tăng
sự tự tin trong việc phát hiện sự khác biệt giữa
các hoạt động EROD gần về giá trị.
Các ảnh hưởng của MgSO4 (cung cấp Mg2 +) trong
hỗn hợp ủ bệnh dường như là phụ thuộc trên các
phương pháp khảo nghiệm, kiểm tra các loài, hoặc cả hai. Pohl
và Fouts (1980) thấy rằng sự thiếu sót của MgSO4
giảm hoạt động EROD 20-30% động vật có vú. Trong
các thí nghiệm khác với động vật có vú, sự hiện diện của
Mg2 + có vẻ không cần thiết trong việc khảo nghiệm EROD
(Burke và Mayer, 1974, Kennedy và Jones, 1994).
Tác dụng của Mg2 + trên mức độ hoạt động EROD trong
cá có vẻ là loài cụ thể. Thiếu sót của Mg2 +
ra khỏi hỗn hợp phản ứng dẫn đến một thống kê
giảm 30% đáng kể trong hoạt động EROD trong trắng
kẻ hút PMS nhưng không có ảnh hưởng đến hoạt động EROD trong
cá hồi cầu vồng PMS (Munkittrick et al., 1993). Nếu
ảnh hưởng của Mg2 + đã không được báo cáo cho một số
loài đang được kiểm tra, tính hiệu quả của nó nên được
thử nghiệm bằng cách sử dụng mẫu kiểm soát bệnh vi tích cực từ
các loài đó và báo cáo trong y văn.