A total of 21 L. paracasei strains,

A total of 21 L. paracasei strains, 20 clinical isolates from the oral cavity and a L. paracasei CCUG 32212 reference strain, wereobtained from the previous study of Piwat et al. [13], and the cul- ture collection was kept at —80 ○C in the Department of Stoma- tology, Faculty of Dentistry, Prince of Songkla University, Thailand. All strains were identified using restriction fragment length poly-
morphism (RFLP) analysis of a polymerase chain reaction (PCR) [14]. Sequencing of the 16S-rRNA was performed for strains with uncertain identifications.
Initially, the cell free supernatant and supernatant of sonicated cells of all tested strains were screened for inhibitory activity, and Streptococcus mutans ATCC 25175 was used as an indicator strain at
this step. After recovery from storage, each tested strain was inoculated into a De Man Rogosa Sharpe (MRS) broth at 37 ○C for
24 h. Bacterial cells were separated from the broth culture by centrifugation at 8000 g for 10 min. The supernatant was adjusted to pH 6.5 with 1 M NaOH and then treated with proteinase K, catalase and lysozyme at a final enzyme concentration of 1 mg
mL—1. The treated supernatants were tested for antimicrobial ac-
tivity using an agar well diffusion assay.
The supernatant was concentrated 10-fold in a Speed-Vac concentrator, and then the pH was adjusted to 6.5 with 1 M NaOH. One part of the concentrated supernatant was extracted with equal volume of either chloroform or ethyl acetate separately. After thoroughly mixing, the organic phase evaporated and the sediment was resuspended in phosphate buffer saline (PBS, pH 7.0) to the original volume.
The bacterial cells were washed three times with PBS, and the sediment was than resuspended in PBS to the original volume. The washed cells suspension was sonicated with a cell disrupter to lyse the bacterial cell wall for 5 min in an ice bath. Cell debris was removed by centrifugation at 8000 g for 10 min, and the superna- tant was used as the sonicated cell free extract.
All samples were examined for inhibitory activity against
S. mutans ATCC 25175 using a microdilution assay. The inhibitory activity was defined as >80% inhibition growth of an indicator strain by the tested sample compared to the control (indicator strains with medium only).
From our screening study, the results indicated that the stron- gest inhibitory activity was observed in the aqueous phase of the supernatant of L. paracasei SD1. Thus, the strain was subjected to a further bacteriocin purification study.

2.2. Purification of the bacteriocin

One liter of the supernatant of L. paracasei SD1 was precipitated with 40% ammonium sulfate overnight at 4 ○C with stirring. The precipitated proteins were collected by centrifugation of 20,000 g at 4 ○C for 20 min and then resuspended in 10 mL of 0.1 M PBS. The precipitated proteins were dialyzed twice against 2 L of 0.05 M PBS for 24 h using a dialysis bag with a molecular weight cutoff of
3.5 kDa. The dialyzed proteins were mixed thoroughly with an equal volume of chloroform and then centrifuged with 6000 g at 4 ○C for 10 min. The organic phase was evaporated and the sedi- ment was resuspended in PBS.
The sample (0.5 mL) was loaded on a Superdex 200 HR 10/30 column (LKB-Pharmacia, Uppsala, Sweden); a fast protein liquid
chromatography (FPLC) system. A buffer was applied in 0.5 mL min—1 with a 0.05 M sodium phosphate buffer (pH 6.5) with the addition of 0.15 M NaCl for elution, with a time interval of 20 min
after the samples were injected. The elution was monitored simultaneously at 280 nm and controlled in 0.5 mL min—1. Fractions of 3 mL each were collected and then dialyzed two times against 2 L
of distilled water for 24 h using a dialysis bag with a molecular weight cutoff of 3.5 kDa. The flow-through and the dialysates were concentrated by lyophilization before testing for bacteriocin activity.

Kết quả (Việt) 1:

Tổng cộng 21 L. paracasei chủng, 20 lâm sàng cô lập từ khoang miệng và một L. paracasei CCUG 32212 tham khảo căng thẳng, wereobtained từ các nghiên cứu trước đó của Piwat et al. [13], và bộ sưu tập cul-ture được lưu giữ tại — 80 ○C trong vùng Stoma-tology, giảng viên Nha khoa, Prince of Songkla University, Thái Lan. Tất cả các chủng đã là sử dụng hạn chế mảnh dài poly - identifiedmorphism (RFLP) các phân tích của một phản ứng chuỗi polymerase (PCR) [14]. Trình tự của 16S rRNA được thực hiện cho giống với identifications không chắc chắn.Ban đầu, các tế bào miễn phí supernatant và supernatant của các tế bào sonicated của tất cả các chủng thử nghiệm đã được chiếu cho ức chế hoạt động, và Streptococcus mutans ATCC 25175 được sử dụng như một chỉ số căng thẳng tạibước này. Sau khi phục hồi từ lưu trữ, căng thẳng thử nghiệm mỗi đã được tiêm chủng vào một canh De Man Rogosa Sharpe (MRS) tại 37 ○C cho24 h. tế bào vi khuẩn đã được tách ra từ các nền văn hóa canh số 8000 g cho 10 phút. Supernatant đã được điều chỉnh để pH 6,5 với 1 M NaOH và sau đó được điều trị với proteinase K, catalase, lysozyme lúc một nồng độ enzym ngoài của 1 mgmL-1. Supernatants điều trị đã được thử nghiệm cho các chế phẩm kháng ac-cao bằng cách sử dụng một khảo nghiệm cũng phổ biến agar.Supernatant là 10-fold tập trung ở một tốc độ-Vac tập trung, và sau đó độ pH được điều chỉnh để 6,5 với 1 M NaOH. Là một phần của supernatant tập trung được chiết xuất với khối lượng bằng nhau của cloroform hay etyl axetat một cách riêng biệt. Sau khi triệt để trộn, giai hữu cơ bốc hơi và trầm tích đã được resuspended trong nước muối đệm phosphat (PBS, pH 7,0) với khối lượng ban đầu.Các tế bào vi khuẩn đã được rửa sạch ba lần với PBS, và trầm tích là hơn resuspended trong PBS với khối lượng ban đầu. Đình chỉ rửa các tế bào đã được sonicated với disrupter di động để lyse vách tế bào vi khuẩn trong 5 phút trong một tắm nước đá. Mảnh vỡ tế bào đã được gỡ bỏ bởi số 8000 g cho 10 phút, và superna-ý được sử dụng như các chiết xuất miễn phí di động sonicated.Tất cả mẫu đã được kiểm tra cho các hoạt động ức chế chống lạiS. mutans ATCC 25175 bằng cách sử dụng một khảo nghiệm microdilution. Ức chế hoạt động là defined như > 80% ức chế sự phát triển của một căng thẳng chỉ bằng cách thử nghiệm mẫu so với sự kiểm soát (chỉ số giống có trung bình chỉ).Từ nghiên cứu kiểm tra của chúng tôi, kết quả chỉ ra rằng hoạt động ức chế stron-gest được quan sát thấy ở giai đoạn dung dịch nước của supernatant L. paracasei SD1. Vì vậy, sự căng thẳng đã phải chịu một bacteriocin purification nghiên cứu thêm.2.2. Purification bacteriocinMột lít supernatant L. paracasei SD1 được kết tủa với 40% amoni sulfat qua đêm tại ○C 4 với khuấy. Các protein sản được thu thập bởi số 20.000 g tại 4 ○C cho 20 phút và sau đó resuspended trong 10 mL 0.1 M PBS. Các protein sản đã dialyzed hai lần chống lại 2 L 0,05 M PBS cho 24 h, bằng cách sử dụng một túi lọc máu với cutoff trọng lượng phân tử của3.5 kDa. Các protein dialyzed được trộn kỹ với một khối lượng bằng nhau của cloroform và sau đó ly với 6000 g tại 4 ○C cho 10 phút. Giai đoạn hữu cơ được bốc hơi và sedi-ment resuspended trong PBS.Mẫu (cách 0.5 mL) đã được nạp vào một Superdex 200 nhân sự 10/30 cột (LKB-Pharmacia, Uppsala, Thuỵ Điển); một chất lỏng nhanh chóng proteinHệ thống sắc ký (FPLC). Một bộ đệm được áp dụng trong cách 0.5 mL min-1 với một bộ đệm natri photphat 0,05 M (pH 6.5) với việc bổ sung 0,15 M NaCl cho elution, với một khoảng thời gian 20 phútsau khi các mẫu đã được tiêm. Elution đã được giám sát đồng thời tại 280 nm và kiểm soát trong cách 0.5 mL min-1. Phân số của 3 mL mỗi đã được thu thập và sau đó dialyzed hai lần chống lại 2 Lnước cất cho 24 h, bằng cách sử dụng một túi lọc máu với một trọng lượng phân tử cutoff của 3,5 kDa. flow-qua và các dialysates đã được tập trung bởi lyophilization trước khi thử nghiệm cho bacteriocin hoạt động.

Kết quả (Việt) 2:

Tổng cộng có 21 chủng L. paracasei, 20 phân lập lâm sàng từ khoang miệng và một chủng tham khảo L. paracasei CCUG 32.212, wereobtained từ các nghiên cứu trước đây của Piwat et al. [13], và Nestle hoá bộ sưu tập đã được giữ ở -80 ○ C tại Khoa Stoma- tology, Khoa Nha Khoa, Đại học Prince of Songkla, Thái Lan. Tất cả các chủng đã identi ed fi sử dụng hạn chế chiều dài đoạn poly-
cấu xạ (RFLP) phân tích của một phản ứng dây chuyền polymerase (PCR) [14]. Trình tự của 16S-rRNA thực hiện cho các chủng với các cation fi identi không chắc chắn.
Ban đầu, các tế bào bề miễn phí và nổi của các tế bào âm trong của tất cả các chủng thử nghiệm đã được sàng lọc hoạt động ức chế, và Streptococcus mutans ATCC 25.175 đã được sử dụng như là một chủng chỉ số ở
bước này. Sau khi phục hồi từ lưu trữ, từng dòng thử nghiệm đã được cấy vào một De Man Rogosa Sharpe (MRS) nước dùng ở 37 ○ C trong
24 h. Tế bào vi khuẩn đã được tách ra từ các nền văn hóa nước dùng bằng ly tâm ở 8000 g trong 10 phút. Các dịch nổi được điều chỉnh pH 6,5 với 1 M NaOH và sau đó được điều trị với proteinase K, catalase và lysozyme ở nồng độ enzyme fi nal của 1 mg
mL-1. Các nước nổi điều trị đã được thử nghiệm cho ac- kháng khuẩn
tivity sử dụng một xét nghiệm cũng khuếch tán thạch.
Các bề được tập trung 10 lần trong một bộ tập trung Speed-Vac, và sau đó để điều chỉnh pH 6,5 với 1 M NaOH. Một phần của sự nổi tập trung được chiết xuất với khối lượng bằng nhau hoặc chloroform hoặc ethyl acetate riêng. Sau khi trộn đều, pha hữu cơ bay hơi và các trầm tích đã được lơ lửng trong dung dịch muối đệm phosphat (PBS, pH 7.0) với khối lượng ban đầu.
Các tế bào vi khuẩn được rửa ba lần bằng PBS, và các trầm tích là hơn lơ lửng trong PBS với khối lượng ban đầu . Các tế bào rửa treo được âm trong với một Disrupter tế bào để Lyse vách tế bào vi khuẩn trong 5 phút trong một bồn tắm nước đá. Các mảnh vỡ tế bào đã được loại bỏ bằng cách ly tâm ở 8000 g trong 10 phút, và các quan superna- đã được sử dụng như là các tế bào âm trong chiết xuất miễn phí.
Tất cả các mẫu đã được kiểm tra hoạt động ức chế chống lại
S. mutans ATCC 25.175 sử dụng một thử nghiệm pha loãng. Các hoạt động ức chế được định nghĩa là> 80% tăng trưởng sự ức chế của một chủng chỉ bởi một mẫu thử nghiệm so với đối chứng (chỉ số dòng virus với phương tiện duy nhất).
Từ nghiên cứu sàng lọc của chúng tôi, kết quả chỉ ra rằng hoạt động ức chế gest stron- đã được quan sát trong pha nước của bề của L. paracasei SD1. Như vậy, sự căng thẳng đã phải chịu một bacteriocin nghiên cứu puri fi cation thêm. 2.2. Puri fi cation của bacteriocin Một lít phần nổi của L. paracasei SD1 đã bị kết tủa với 40% ammonium sulfate đêm tại 4 ○ C với khuấy. Các protein kết tủa được thu thập bằng cách ly tâm 20.000 g 4 ○ C trong 20 phút và sau đó lơ lửng trong 10 ml dung dịch 0,1 M PBS. Các protein kết tủa được thẩm tách hai lần so với 2 L 0,05 M PBS trong 24 h sử dụng một túi lọc máu với một cắt trọng lượng phân tử 3,5 kDa. Các protein thẩm tách được trộn đều với một lượng bằng cloroform và sau đó ly tâm với 6000 g 4 ○ C trong 10 phút. Các pha hữu cơ được bốc hơi và sự phát trầm tích đã được lơ lửng trong PBS. Các mẫu (0,5 ml) đã được nạp vào một Superdex 200 nhân sự 10/30 cột (LKB-Pharmacia, Uppsala, Thụy Điển); một protein nhanh lỏng hệ thống sắc ký (FPLC). Một bộ đệm đã được áp dụng trong 0,5 mL min-1 với một bộ đệm phosphate 0,05 M sodium (pH 6.5) với việc bổ sung 0,15 M NaCl cho rửa giải, với một khoảng thời gian là 20 phút sau khi mẫu được tiêm. Việc rửa giải được theo dõi đồng thời tại 280 nm và kiểm soát trong 0,5 mL min-1. Các phần phân đoạn của 3 mL từng được thu thập và sau đó thẩm tách hai lần so với 2 lít nước cất 24 h sử dụng một túi lọc máu với một cắt trọng lượng phân tử 3,5 kDa. Fl ow qua và dialysates được tập trung bởi lyophilization trước khi thử nghiệm cho hoạt động bacteriocin.