AFLP reactionsDNA templates for AFL

AFLP reactions
DNA templates for AFLP reactions were generated by restriction
digestion and ligation. Initially, about 100 ng of total DNA was
digested with 5U of EcoRI and MseI in 10× buffer 2ul, at 37°C for
12 h. To generate DNA template for subsequent PCR amplification,
the digested DNA fragments were ligated with 10 pmol of EcoRI
and 10 pmol MseI adapters in a reaction mixture containing
10×buffer 2 µl, 0.1 U T4DNase l at 16°C for 10 h. Preamplification
PCR reaction was conducted using a MJ MiniTM Personal Thermal
cycler (BIO-RAD) with a pair of primers containing a single selective
nucleotide. Amplification was performed at the cycling conditions for
4 min at 94°C, followed by 30 cycles of 94°C for 60 s, 55°C for 30 s,
72°C for 120 s and a final extension of 72°C for 10 min. The 20 µl
PCR product mixture was diluted 10-fold with distilled water and
used as templates for the subsequent selective PCR amplification.
The selective amplification was performed using three pairs of
primers, EcoRI-CGA/ MseI-CAA, EcoRI-AGG/MseI-CTA and
EcoRI-ACG/MseI-CTG. Fingerprint patterns were visualized on a
6% denaturing polyacrylamide gel using silver staining method.
Gel electrophoresis and silver staining
The PCR products were mixed with 10 ul AFLP loading buffer (99%
formamide, 10 mM EDTA, 0.05% bromophenol and 0.05% xylene
cyanol). The product mixtures were denatured and concentrated at
90°C for 20 min, and quickly cooled down in an ice bath after
denaturation. A 6% denaturing polyacrylamide gel was prerun at
120 W for 30 min. Each well was loaded with 10 µl of sample. The
gel was electrophoresed for 2.5 h in a BioRad Sequi-Gen GT DNA
sequencing cell (38 × 50 cm) at 110 W and 50°C. Silver staining
procedures were derived and modified from Merril et al. (1979).
After electrophoresis, the gel was fixed in 1% ethanoic acid for at
least 30 min. The gel was rinsed in distilled water and stained with
a mixture of 0.2% silver nitrate and 0.007% benzene sulphonic acid
for 30 min. The stained gel was rinsed again with distilled water and
immersed in a developing solution (2.5% sodium carbonate,
0.037% formaldehyde, 0.002% sodium thiosulphate). The
development was subsequently stopped with 1% ethanoic acid
when the bands became visualized and reached desirable intensity.
Band sizes were estimated by a standard AFLP DNA ladder and
analyzed using the Gel Imaging Analyzing System.

Kết quả (Việt) 1:

Phản ứng GENETCác mẫu DNA cho GENET phản ứng đã được tạo ra bởi các hạn chếtiêu hóa và ligation. Ban đầu, về 100 ng tổng ADN làtiêu hóa với 5U EcoRI và MseI trong 10 × đệm 2ul, 37° c cho12 h. Để tạo ra các mẫu DNA cho khuếch đại PCR tiếp theo,những đoạn DNA tiêu hóa được ligated với 10 pmol EcoRIvà 10 bộ điều hợp MseI pmol trong một phản ứng hỗn hợp chứa10 × đệm 2 ml, 0.1 U T4DNase l 16° c cho 10 h. PreamplificationPhản ứng PCR được tiến hành bằng cách sử dụng một MJ MiniTM cá nhân nhiệtngười đạp xe máy (BIO-RAD) với hai lớp lót có chứa một đĩa đơn chọn lọcnucleotide. Khuếch đại được thực hiện tại các điều kiện chạy xe đạp4 min tại 94° C, theo chu kỳ 30 94° C cho 60 s, 55° C cho 30 s,72° C trong 120 s và bản mở rộng cuối cùng của 72° C trong 10 phút. 20 mlHỗn hợp sản phẩm PCR được 10-fold pha loãng với nước cất vàdùng làm mẫu cho khuếch đại PCR lựa chọn tiếp theo.Khuếch đại chọn lọc được thực hiện bằng cách sử dụng ba cặpchất nền, mồi, EcoRI-CGA / MseI-CAA, EcoRI-AGG/MseI-cố vấn trưởng vàCác mẫu vân tay EcoRI-ACG/MseI-CTG. đã hình dung về một6% denaturing polyacrylamide gel sử dụng phương pháp nhuộm bạc.Gel electrophoresis và nhuộm màu bạcCác sản phẩm PCR được trộn lẫn với 10 ul GENET nạp đệm (99%formamide, 10 mM EDTA, 0,05% bromophenol và 0,05% xylenecyanol). Hỗn hợp sản phẩm đã denatured và tập trung tại90° C trong 20 phút, và nhanh chóng làm mát bằng xuống trong một bồn tắm nước đá sau khidenaturation. 6% denaturing polyacrylamide gel prerun tại120 W cho 30 phút. Mỗi người cũng được nạp với 10 ml mẫu. Cácgel được electrophoresed cho 2,5 h trong một BioRad Sequi-Gen GT DNAxác định trình tự di động (38 x 50 cm) tại 110 W và 50° C. Nhuộm màu bạcthủ tục đã được bắt nguồn và sửa đổi từ Merril et al. (1979).Sau khi electrophoresis, gel cố định trong axit ethanoic 1% tạiít nhất 30 phút. Các gel được rửa trong nước cất và màu vớimột hỗn hợp của 0,2% nitrat bạc và 0,007% benzen sulphonic acidtrong 30 phút. Gel nhuộm màu được rửa lại với nước cất vàđắm mình trong một giải pháp phát triển (2,5% natri cacbonat,0.037% formaldehyde, 0,002% natri thiosulphate). Cácphát triển sau đó đã được dừng lại với acid ethanoic 1%Khi các ban nhạc đã trở thành hình tượng và đạt cường độ mong muốn.Ban nhạc kích thước ước tính của một cái thang GENET DNA chuẩn vàphân tích bằng cách sử dụng Gel hình ảnh phân tích hệ thống.

Kết quả (Việt) 2:

Phản ứng AFLP
DNA mẫu cho phản ứng AFLP được tạo ra bằng cách hạn chế
tiêu hóa và thắt. Ban đầu, khoảng 100 ng tổng DNA đã được
tiêu hóa với 5U của EcoRI và MseI trong 10 × 2ul đệm, ở 37 ° C trong
12 h. Để tạo ra các mẫu DNA để khuếch đại PCR sau đó,
các mảnh vỡ DNA tiêu hóa được ligated với 10 pmol của EcoRI
và 10 adapter pmol MseI trong một hỗn hợp phản ứng có chứa
10 × đệm 2 ml, 0,1 U T4DNase l ở 16 ° C trong 10 h. Preamplification
phản ứng PCR được thực hiện sử dụng MJ MiniTM cá nhân nhiệt
chu trình (BIO-RAD) với một cặp mồi có chứa một lựa chọn đơn
nucleotide. Khuếch đại được thực hiện tại các điều kiện đi xe đạp cho
4 phút ở 94 ° C, tiếp theo là 30 chu kỳ của 94 ° C trong 60 s, 55 ° C trong 30 s,
72 ° C trong 120 s và một phần mở rộng cuối cùng của 72 ° C trong 10 min. 20 ml
hỗn hợp sản phẩm PCR được pha loãng 10 lần với nước cất và
sử dụng như là mẫu cho các khuếch đại PCR chọn lọc tiếp theo.
Các khuếch đại có chọn lọc được thực hiện bằng ba cặp
mồi, EcoRI-CGA / MseI-CAA, EcoRI-AGG / MseI- Cố vấn trưởng và
EcoRI-ACG / MseI-CTG. Mẫu vân tay đã được hình dung về một
gel polyacrylamide 6% biến tính bằng phương pháp bạc nhuộm.
Gel điện di và bạc nhuộm
Sản phẩm PCR được trộn với 10 ul đệm AFLP tải (99%
formamid, 10 mM EDTA, 0,05% bromophenol và 0,05% xylene
cyanol) . Các hỗn hợp sản phẩm đã bị làm biến tính và tập trung ở
90 ° C trong 20 phút, và nhanh chóng hạ nhiệt trong một bồn tắm nước đá sau khi
biến tính. Một biến tính polyacrylamide gel 6% được prerun tại
120 W trong 30 phút. Mỗi cũng đã được nạp với 10 ml mẫu. Các
gel được electrophoresed cho 2,5 h trong một BioRad Sequi-Gen GT DNA
tế bào trình tự (38 × 50 cm) tại 110 W và 50 ° C. Nhuộm bạc
thủ tục này được lập ra và sửa đổi từ Merril et al. (1979).
Sau khi điện di, gel được cố định trong 1% axit ethanoic trong ít
nhất 30 phút. Các gel đã được rửa trong nước cất và nhuộm với
một hỗn hợp 0,2% nitrat bạc và 0,007% benzen sulphonic acid
trong 30 phút. Các gel nhuộm được rửa sạch lại bằng nước cất và
đắm mình trong một giải pháp phát triển (2,5% natri cacbonat,
0,037% formaldehyde, 0,002% sodium thiosulphate). Việc
phát triển sau đó đã dừng lại với 1% axit ethanoic
khi ban nhạc đã trở thành hình tượng và đạt cường độ mong muốn.
Kích thước ban nhạc đã được ước tính bằng một chiếc thang AFLP DNA tiêu chuẩn và
phân tích bằng Gel Imaging Hệ thống Phân tích.