METHODSStrains, plasmids and cultiv

METHODS
Strains, plasmids and cultivation of bacteria
Relevant characteristics of bacterial strains, growth conditions, and plasmids used in this study are summarized in Table 1 and in Supplementary Methods. All constructs were given TX numbers and plasmids from these constructs were assigned respective pTEX numbers (Table 1).

Escherichia coli and E. faecium cells were grown in Luria-Bertani (LB) broth/agar and Brain Heart Infusion broth/agar (Difco), respectively. For E. coli constructs, antibiotics were used at the following concentrations: 25 μg kanamycin ml-1 and 100 μg ampicillin ml-1.

Identification and structural analysis of CWA proteins
Bioinformatics methods used for genome-wide identification of CWA proteins are described in the Supplementary Methods. Domain architecture as well as fold-recognition analyses were carried out by comparing the protein sequences against domain databases as described in Supplementary Methods.

Construction of expression plasmids
Genomic DNA from E. faecium strains was isolated as described earlier (Wilson, 1994). DNA regions encoding amino acids 27 to 624 (A-domain and B-repeats) and 27 to 333 (A-domain) of Scm and aa 33 to 590 of EbpCfm (Fms9 was renamed as EbpCfm based on its 74% aa identity

(84% similarity) with EbpC of E. faecalis over the entire protein) (mature protein without the signal peptide and the CWA domain) were amplified using primers listed in Supplementary Table S1 and cloned into the expression vector pQE30 (Qiagen) to obtain pTEX5432, pTEX5628 and pTEX5630 (Table 1). The corresponding expressed protein segments of Scm were designated as rScm65 and rScm36, respectively, based on their calculated molecular masses. Similarly, the cloned segment of EbpCfm was designated as rEbpCfm62. Constructs were confirmed by sequencing.

Purification of recombinant proteins
Recombinant proteins with N-terminal His6-tags were expressed and purified using nickel affinity chromatography followed by anion exchange chromatography (Nallapareddy et al., 2007a; Sillanpaa et al., 2004). Protein concentrations were determined by absorption spectroscopy at 280 nm using calculated molar absorption coefficient values. Molecular masses were determined with MALDI-TOF MS for rScm36 and rScm65.

Circular dichroism (CD) specta
Far-UV CD spectroscopy data were collected as described previously (Sillanpaa et al., 2004). Secondary structure compositions were quantitated with ContinLL, SELCON3 and CDSSTR (http://www.cryst.bbk.ac.uk/cdweb/html/home.html) (Lobley et al., 2002; Whitmore & Wallace, 2004).

ELISA-type solid phase ligand binding assays
Binding of the recombinant His-tag fusion proteins to components of the ECM (extracellular matrix) was tested using a previously described assay with minor modifications (Nallapareddy et al., 2000). In brief, 1 μg of each ECM protein (for source, see Supplementary Methods) was coated in 100 μl PBS in Immulon 2HB (Thermo Scientific) 96-well microplate wells. Wells were incubated with various concentrations of rScm and bound His-tag proteins were detected with anti-His6 mAb (GE Healthcare) followed by alkaline phosphatase-conjugated anti-mouse antibody (Bio-Rad). p-nitrophenyl phosphate (Sigma) was used for signal detection.

Production of polyclonal antibodies and purification of antigen-specific Igs
Polyclonal goat antibodies against rScm36 and rEbpCfm62 were raised at Bethyl Laboratories. Scm36- and EbpCfm62-specific Igs were eluted from CnBr-activated Sepharose 4B coupled with the corresponding antigen, according to the manufacturer’s protocol (GE Healthcare). 0.1 M glycine, pH 2.8, was used for elution of bound antibodies, which were immediately neutralized by 1 M Tris/HCl, pH 8.0, and dialyzed extensively against PBS. Antibody concentrations were determined using an estimated IgG molar absorption coefficient value of 210 000 M-1cm-1 and a molecular mass of 150 000 Da.

Whole-cell ELISA and FACS
Surface expression of Scm on E. faecium cells was detected by a whole-cell ELISA assay (Nallapareddy et al., 2003) using affinity purified rScm36-specific Igs. Control antiserum against formalin-killed TX0016-whole-cells (Rakita et al., 2000) was used as a positive control.

To quantitate surface expression of Scm by FACS analysis, bacteria grown in BHI 14 h from an inoculum of OD600nm = 0.01, were labeled with preimmune or affinity-purified anti-Scm- specific antibodies followed by donkey anti-goat IgG conjugated with F(ab’)2-fragment- specific R-phycoerythrin, as described earlier (Kemp et al., 2007). Cells were then fixed in 1
% paraformaldehyde in PBS and analyzed with a Coulter EPICSXL AB6064 flow cytometer (Beckman Coulter) and System II software.

Extraction of CWA proteins and Western blot analysis
CWA proteins were extracted from E. faecium strains grown for 8 h in BHI broth to late- exponential phase (starting inoculum, ∼0.01 OD600nm) with mutanolysin as described earlier (Nallapareddy et al., 2006). Equal amounts of concentrated mutanolysin extracts were separated using 4%-15% gradient SDS-PAGE gels (Bio-Rad) under reducing conditions and transferred to PVDF membranes according to the manufacturer’s protocol. Membranes were probed with affinity-purified anti-Scm36 and anti-EbpCfm62 antibodies (see above) followed by HRP-conjugated anti-goat IgG antibodies and, as a control, total IgG antibodies purified from preimmune goat sera were used. Signal was detected using SuperSignal West Pico Chemilumiscent detection reagents (Thermo Scientific).

Northern hybridization
Total RNA was isolated from TX0082 grown in BHI to mid-exponential phase using the RNAprotect Bacteria Reagent and RNeasy Mini Kit (Qiagen). Thirty micrograms of total RNA were separated using a formaldehyde-containing agarose gel under denaturing conditions and transferred to a Hybond-N+ membrane as described by the manufacturer (GE Healthcare).
DNA probes obtained with primers listed in Supplementary Table S1 were radiolabeled by using the RadPrime DNA labeling system (Invitrogen). Hybridization was performed under high stringency conditions as detailed earlier for Southern blots (Murray et al., 1993).


RT-PCR


Total RNA (isolated as above for Northern hybridization) was treated twice with 20 U RQ1 DNase (Promega) for 30 minutes at 37°C. DNase was removed using the RNeasy Mini Kit and purification protocol (Qiagen). Total RNA was then reverse transcribed with specific primers (Supplementary Table S1) using the SuperScript One-Step RT-PCR with Platinum Taq kit (Invitrogen) according to the manufacturer’s instructions. DNA sequencing verified that the primer regions of TX0082 are 100 % identical to the corresponding sequences in TX0016. As an internal control, a 509-bp fragment of gyrA (encoding gyrase A) was amplified using the FmGyrF and FmGyrR primers (Supplementary Table S1). Reactions without RT were used as controls to verify lack of DNA contamination in the total RNA preparation.


Colony hybridization
Preparation of colony lysate membranes and hybridization under high stringency conditions were performed as previously described (Coque et al., 1995; Singh et al., 1998). DNA probes were generated and radiolabeled as described above for Northern hybridization.

RESULTS AND DISCUSSION
Identification of putative CWA proteins with Ig-like folds
Our search of the nearly completed genome sequence of E. faecium endocarditis-derived strain TX0016 (GW, BEM, et al., unpublished data, http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/) yielded a total of 22 ORFs encoding putative CWA proteins (designated Fms, for E. faeciumsurface proteins) with a tripartite pattern near the C-terminus (an LPXTG motif or variant, followed by a membrane-spanning hydrophobic region and a positively charged tail). This number is in the range of predicted CWA proteins of related gram-positive bacteria (Ponnuraj et al., 2003) which vary from 8 (Streptococcus mutans) to 41 (E. faecalis). While the number of CWA proteins identified here is the same as the number reported in a recent study (Hendrickx et al., 2007), which identified CWA proteins from a partial TX0016 genome sequence (available at NCBI), the published report did not include one of the ORFs here (Fms6) and classified a pseudogene (Fms15) as two ORFs (Supplementary Results).

Kết quả (Việt) 1:

PHƯƠNG PHÁPChủng, plasmid và trồng trọt của các vi khuẩnCác đặc điểm có liên quan của chủng vi khuẩn, điều kiện phát triển, và chúng được sử dụng trong nghiên cứu này được tóm tắt trong bảng 1 và trong phương pháp bổ sung. Tất cả cấu trúc đã được đưa ra con số TX và plasmid từ các cấu trúc được bố trí tương ứng pTEX số (bảng 1).Escherichia coli và E. faecium tế bào được trồng ở Luria-Bertani (LB) canh/agar và não trái tim truyền canh/agar (Difco), tương ứng. Đối với E. coli xây dựng, thuốc kháng sinh được sử dụng ở nồng độ sau: 25 μg kanamycin ml-1 và 100 μg ampicillin ml-1.Phân tích nhận dạng và cấu trúc của protein CWATin sinh học phương pháp được sử dụng để xác định toàn bộ gen của CWA protein được mô tả trong các phương pháp bổ sung. Tên miền kiến trúc cũng như màn hình đầu tiên công nhận phân tích được thực hiện bằng cách so sánh các chuỗi protein chống lại cơ sở dữ liệu tên miền như mô tả trong phương pháp bổ sung.Xây dựng một plasmid biểu hiệnGen DNA từ E. faecium chủng được cô lập như mô tả trước đó (Wilson, 1994). DNA vùng mã hóa axit amin 27 để 624 (tên miền A và B-lặp đi lặp lại) và 27 đến 333 (A-tên miền) của Scm và aa 33 để 590 của EbpCfm (Fms9 được đổi tên thành do EbpCfm dựa trên danh tính aa 74%(84% similarity) với EbpC E. faecalis qua protein toàn bộ) (trưởng thành protein mà không có tín hiệu peptide và vùng CWA) đã được khuếch đại bằng cách sử dụng chất nền, mồi được liệt kê trong bổ sung bảng S1 và nhân bản vào biểu hiện vector pQE30 (Qiagen) để có được pTEX5432, pTEX5628 và pTEX5630 (bảng 1). Các phân đoạn bày tỏ protein tương ứng của Scm được đặt tên như rScm65 và rScm36, tương ứng, dựa trên khối lượng phân tử tính toán của họ. Tương tự như vậy, các phân đoạn nhân bản của EbpCfm được chỉ định làm rEbpCfm62. Cấu trúc đã được xác nhận bởi trình tự.Thanh lọc của protein tái tổ hợpProtein tái tổ hợp với N-ga His6-thẻ đã bày tỏ và tinh chế bằng cách sử dụng sắc ký niken ái lực theo sắc kí trao đổi anion (Nallapareddy et al., 2007a; Sillanpaa et al, 2004). Nồng độ chất đạm đã được xác định bởi sự hấp thụ quang phổ tại 280 nm sử dụng sự hấp thụ phân tử tính toán hệ số giá trị. Khối lượng phân tử đã được xác định với MALDI-TOF MS cho rScm36 và rScm65.Thông tư dichroism (CD) spectaXa UV CD phổ dữ liệu được thu thập như mô tả trước đó (Sillanpaa et al, 2004). Cấu trúc bậc hai tác phẩm đã được quantitated với ContinLL, SELCON3 và CDSSTR (http://www.cryst.bbk.ac.uk/cdweb/html/home.html) (Lobley et al., 2002; Whitmore & Wallace, năm 2004).ELISA-loại rắn giai đoạn phối tử ràng buộc thử nghiệmCác ràng buộc của các protein fusion tái tổ hợp của ông từ khóa để các thành phần của ECM (ngoại bào ma trận) đã được thử nghiệm bằng cách sử dụng một khảo nghiệm trước đó được mô tả với sửa đổi nhỏ (Nallapareddy và ctv., 2000). Trong tóm tắt, 1 μg mỗi protein ECM (cho nguồn, xem phương pháp bổ sung) được bọc trong 100 μl PBS ở Immulon 2HB (nhiệt khoa học) 96-cũng microplate wells. Wells đã được ủ với nồng độ khác nhau của rScm và protein ràng buộc của ông-thẻ được phát hiện với anti-His6 mAb (GE y tế) theo sau kiềm phosphatase kết chống chuột kháng (Bio-Rad). p-nitrophenyl phosphate (Sigma) được sử dụng để phát hiện tín hiệu.Sản xuất kháng thể polyclonal và thanh lọc của kháng nguyên cụ thể IgsPolyclonal dê kháng thể chống lại rScm36 và rEbpCfm62 đã được nâng lên ở phòng thí nghiệm Bethyl. Scm36 và EbpCfm62 cụ thể Igs được eluted từ CnBr kích hoạt Sepharose 4B kết hợp với kháng nguyên tương ứng, theo giao thức của nhà sản xuất (GE y tế). 0.1 M glycine, pH 2,8, được sử dụng cho elution kháng thể bị ràng buộc, ngay lập tức vô hiệu hóa bởi 1 M Tris/HCl, pH 8.0, và dialyzed rộng rãi chống lại PBS. Nồng độ kháng thể đã được xác định bằng cách sử dụng một ước tính IgG phân tử hấp thụ hệ số giá trị của 210 000 M-1cm-1 và một khối lượng phân tử của 150 000 Da.Toàn bộ di động ELISA và FACSCác biểu hiện bề mặt của Scm trên tế bào E. faecium đã được phát hiện bởi một khảo nghiệm ELISA di động toàn bộ (Nallapareddy và ctv., 2003) bằng cách sử dụng mối quan hệ tinh khiết dành riêng cho rScm36 Igs. Kiểm soát antiserum chống lại giết chết formalin TX0016-toàn bộ-tế bào (Rakita và ctv., 2000) đã được sử dụng như là một điều khiển tích cực.Để quantitate bề mặt biểu hiện của Scm bằng cách phân tích FACS, vi khuẩn phát triển trong BHI 14 h từ một inoculum OD600nm = 0,01, được dán nhãn với preimmune hoặc tinh khiết ái lực chống Scm cụ thể kháng thể theo sau bởi donkey chống dê IgG kết với F(ab') 2 mảnh cụ thể R-phycoerythrin, như mô tả trước đó (Kemp và ctv., 2007). Tế bào sau đó đã được cố định trong 1% paraformaldehyde trong PBS và phân tích Coulter EPICSXL AB6064 dòng chảy cytometer (Beckman Coulter) và phần mềm hệ thống II.Khai thác CWA protein và Western blot phân tíchCWA protein được chiết xuất từ chủng E. faecium phát triển cho 8 h ở BHI canh đến cuối mũ pha (bắt đầu từ inoculum, ∼0.01 OD600nm) với mutanolysin như mô tả trước đó (Nallapareddy và ctv., 2006). Các khối lượng bằng nhau của chiết xuất tập trung mutanolysin đã được tách ra bằng cách sử dụng 4% - 15% gradient dùng mũi SDS-trang sáp bọt dùng (Bio-Rad) theo giảm điều kiện và chuyển sang PVDF màng theo giao thức của nhà sản xuất. Màng đã được thăm dò với tinh khiết ái lực chống-Scm36 và kháng thể anti-EbpCfm62 (xem ở trên) HRP kết kháng thể IgG chống dê và, như một điều khiển, tổng số kháng thể IgG tinh khiết từ preimmune dê huyết thanh được sử dụng. Tín hiệu đã được phát hiện bằng cách sử dụng SuperSignal West Pico Chemilumiscent phát hiện thuốc thử (Thermo khoa học).Bắc lai ghépTất cả RNA được cô lập từ TX0082 tăng năm BHI giữa mũ giai đoạn bằng cách sử dụng RNAprotect vi khuẩn tinh khiết và RNeasy Mini Kit (Qiagen). Ba mươi microgram tổng số RNA đã được tách ra bằng cách sử dụng một agarose có chứa formaldehyde gel dưới biến tính điều kiện và chuyển giao cho một Hybond-N + màng như được mô tả bởi nhà sản xuất (GE y tế).Đầu dò DNA thu được với chất nền, mồi được liệt kê trong bổ sung bảng S1 được radiolabeled bằng cách sử dụng ADN RadPrime ghi nhãn hệ thống (Invitrogen). Lai ghép được thực hiện trong điều kiện stringency cao như chi tiết trước đó cho miền Nam blots (Murray và ctv., 1993). RT-PCR Tất cả RNA (cô lập như trên cho phía bắc lai ghép) đã được điều trị hai lần với 20 U RQ1 DNase (Promega) trong 30 phút ở 37° C. DNase đã được gỡ bỏ bằng cách sử dụng giao thức RNeasy Mini Kit và làm sạch (Qiagen). Tất cả RNA sau đó là đảo ngược phiên âm với lớp lót cụ thể (bổ sung bảng S1) bằng cách sử dụng SuperScript One-Bước RT-PCR với bạch kim Taq kit (Invitrogen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Trình tự DNA xác minh rằng các vùng mồi của TX0082 là 100% giống hệt nhau để các chuỗi tương ứng ở TX0016. Như là một kiểm soát nội bộ, một mảnh 509-bp của gyrA (mã hóa gyrase A) được mở rộng bằng cách sử dụng FmGyrF và FmGyrR lớp lót (bổ sung bảng S1). Các phản ứng mà không có RT được sử dụng như điều khiển để kiểm chứng thiếu của DNA ô nhiễm trong việc chuẩn bị tất cả RNA. Thuộc địa lai ghépChuẩn bị của thuộc địa lysate màng và lai ghép trong điều kiện cao stringency đã được thực hiện như mô tả trước đó (Coque et al., 1995; Singh và ctv, 1998). Đầu dò DNA đã được tạo ra và radiolabeled như mô tả ở trên cho phía bắc lai ghép.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬNXác định các giả định CWA protein với Ig như nếp gấpChúng tôi tìm kiếm các chuỗi gần như hoàn thành bộ gen của căng thẳng có nguồn gốc endocarditis E. faecium TX0016 (GW, BEM, et al., chưa công bố dữ liệu, http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/) mang lại tổng số 22 ORFs mã hóa protein CWA giả định (định Fms, cho E. faeciumsurface protein) với một mô hình ba bên gần C-terminus (một LPXTG motif hay biến thể, theo sau bởi một màng bao trùm vùng kỵ nước và một đuôi tích cực tính). Con số này là trong phạm vi của dự đoán CWA protein liên quan Gram dương vi khuẩn (Ponnuraj và ctv., 2003) mà thay đổi từ 8 (Streptococcus mutans) đến 41 (E. faecalis). Trong khi số lượng CWA protein xác định ở đây là giống như số báo cáo trong một nghiên cứu gần đây (Hendrickx et al., 2007), mà xác định CWA protein từ một phần TX0016 gen chuỗi (có sẵn tại NCBI), xuất bản báo cáo không bao gồm một trong những ORFs ở đây (Fms6) và phân loại một pseudogene (Fms15) là hai ORFs (kết quả bổ sung).

Kết quả (Việt) 2:

PHƯƠNG PHÁP
chủng, plasmid và trồng các loại vi khuẩn
đặc điểm có liên quan của các chủng vi khuẩn, điều kiện phát triển, và plasmid được sử dụng trong nghiên cứu này được tóm tắt trong Bảng 1 và trong phương pháp bổ sung. Tất cả các cấu trúc đã được cấp số TX và plasmid từ các cấu trúc được phân số pTEX tương ứng (Bảng 1). Tế bào faecium Escherichia coli và E. được trồng trong Luria-BERTANI (LB) canh / agar và Brain tim Infusion canh / agar (Difco) , tương ứng. Đối với E. coli xây dựng, kháng sinh được sử dụng ở nồng độ sau đây:. 25 mg kanamycin ml-1 và 100 mg ampicillin ml-1 Xác định và phân tích cấu trúc của CWA protein sinh học phương pháp được sử dụng để xác định toàn bộ gen của protein CWA được mô tả trong Phương pháp bổ sung. Kiến trúc miền cũng như lần công nhận phân tích được thực hiện bằng cách so sánh các chuỗi protein chống lại cơ sở dữ liệu tên miền như được mô tả trong phương pháp bổ sung. Xây dựng các plasmid biểu hiện DNA bộ gen từ chủng E. faecium được phân lập như mô tả trước đó (Wilson, 1994). Vùng DNA mã hóa axit amin 27-624 (A-domain và B-lặp lại) và 27-333 (A-domain) của SCM và aa 33-590 của EbpCfm (Fms9 được đổi tên thành EbpCfm dựa trên 74% tính aa của nó (84 % tương tự) với EbpC của E. faecalis trên toàn bộ protein) (protein trưởng thành mà không có các peptide tín hiệu và các tên miền CWA) được khuếch đại sử dụng mồi được liệt kê trong Bảng bổ sung S1 và nhân bản vào vector biểu hiện pQE30 (Qiagen) để có được pTEX5432, pTEX5628 và pTEX5630 (Bảng 1). Tương ứng với các phân đoạn protein được biểu hiện của SCM được thiết kế như rScm65 và rScm36, tương ứng, dựa trên khối lượng phân tử tính toán của họ. Tương tự như vậy, các phân đoạn nhân bản của EbpCfm đã được chỉ định là rEbpCfm62. Cấu trúc đã được khẳng định bởi trình tự. Thanh lọc các protein tái tổ hợp protein tái tổ hợp với N-terminal His6-thẻ đã thể hiện được tinh chế bằng sắc ký ái lực niken theo sau sắc ký trao đổi anion (Nallapareddy et al, 2007a;. Sillanpaa et al., 2004). Nồng độ protein được xác định bởi sự hấp thụ quang phổ ở bước sóng 280 nm sử dụng tính toán các giá trị hệ số hấp thụ phân tử. Khối lượng phân tử được xác định với MALDI-TOF MS cho rScm36 và rScm65. Thông tư lưỡng sắc (CD) specta dữ liệu CD Far-UV quang phổ được thu thập như mô tả trước đây (Sillanpaa et al., 2004). Tác phẩm cấu trúc thứ cấp được quantitated với ContinLL, SELCON3 và CDSSTR (http://www.cryst.bbk.ac.uk/cdweb/html/home.html) (Lobley et al, 2002;. Whitmore & Wallace, 2004). ELISA -Loại rắn giai đoạn thử nghiệm ligand ràng buộc Ràng buộc của tái tổ hợp protein fusion-tag của Ngài cho các thành phần của ECM (ma trận ngoại bào) đã được thử nghiệm bằng cách sử dụng một thử nghiệm được mô tả trước đây với những thay đổi nhỏ (Nallapareddy et al., 2000). Nói tóm lại, 1 mg mỗi protein ECM (đối với nguồn, xem phương pháp bổ sung) được bọc trong 100 ml PBS trong Immulon 2HB (Thermo Scientific) giếng microplate 96 giếng. Wells được ủ với nồng độ khác nhau của rScm và ràng buộc His-tag protein đã được phát hiện với anti-His6 mAb (GE Healthcare) tiếp theo là phosphatase kiềm liên hợp chống chuột kháng thể (Bio-Rad). p-nitrophenyl phosphate (Sigma) đã được sử dụng cho các tín hiệu phát hiện. Sản xuất kháng thể đa dòng và tinh lọc các kháng nguyên đặc IGS đa giá kháng thể chống lại dê rScm36 và rEbpCfm62 đã được nêu ra tại Bethyl Laboratories. Scm36- và EbpCfm62 cụ thể IGS được tách rửa từ CnBr kích hoạt Sepharose 4B cùng với các kháng nguyên tương ứng, theo giao thức của nhà sản xuất (GE Healthcare). 0.1 M glycine, pH 2.8, đã được sử dụng để rửa giải của các kháng thể ràng buộc, mà ngay lập tức đã bị vô hiệu hóa bởi 1 M Tris / HCl, pH 8,0, và thẩm tách rộng rãi chống lại PBS. Nồng độ kháng thể được xác định bằng cách sử dụng một phân tử IgG giá trị hệ số hấp thụ ước tính 210 000 M-1cm-1 và một lượng phân tử khoảng 150 000 Đà. Tổng số các tế bào ELISA và FACS biểu hiện bề mặt của SCM trên các tế bào E. faecium đã được phát hiện bởi một sỉ tế bào ELISA xét nghiệm (Nallapareddy et al., 2003) bằng cách sử dụng mối quan hệ tinh khiết IGS rScm36 cụ thể. Kiểm soát huyết thanh chống TX0016-toàn-tế bào formalin-giết (Rakita et al., 2000) đã được sử dụng như một điều khiển tích cực. Để định lượng biểu hiện bề mặt của SCM bởi phân tích FACS, vi khuẩn phát triển trong BHI 14 h từ một chất tiêm chủng của OD600nm = 0,01, được dán nhãn preimmune hoặc ái lực tinh khiết chống Scm- kháng thể đặc hiệu theo sau con lừa chống dê IgG liên hợp với F (ab ') 2-fragment- cụ thể R-phycoerythrin, như được mô tả trước đó (Kemp et al., 2007). Các tế bào này sau đó được cố định trong 1% paraformaldehyde trong PBS và phân tích với một Coulter EPICSXL AB6064 chảy cytometer (Beckman Coulter) và phần mềm hệ thống II. Chiết xuất protein CWA và phân tích Western blot CWA protein được chiết xuất từ các chủng E. faecium trồng cho 8 h trong BHI nước dùng để pha late- mũ (bắt đầu tiêm chủng, ~0.01 OD600nm) với mutanolysin như được mô tả trước đó (Nallapareddy et al., 2006). Một lượng bằng nhau của chất chiết xuất mutanolysin tập trung được tách bằng 4% -15% Gradient SDS-PAGE gel (Bio-Rad) dưới điều kiện giảm và chuyển đến màng PVDF theo giao thức của nhà sản xuất. Màng được thăm dò với anti-Scm36 và chống EbpCfm62 kháng thể có ái lực tinh khiết (xem ở trên) tiếp theo là kháng thể anti-dê IgG HRP-liên hợp và, như một điều khiển, tổng số kháng thể IgG tinh chế từ huyết thanh dê preimmune đã được sử dụng. Tín hiệu đã được phát hiện bằng cách sử dụng SuperSignal West Pico Chemilumiscent thuốc thử phát hiện (Thermo Scientific). Lai Bắc RNA tổng số được phân lập từ TX0082 trồng ở BHI đến giai đoạn giữa hàm số mũ bằng cách sử dụng vi khuẩn RNAprotect thuốc thử và RNeasy Mini Kit (Qiagen). Ba mươi microgram tổng RNA được tách bằng một gel agarose formaldehyde chứa trong điều kiện biến tính và chuyển giao cho một màng Hybond-N + như mô tả của các nhà sản xuất (GE Healthcare). Đầu dò DNA thu được với mồi được liệt kê trong phụ Bảng S1 được đánh dấu phóng xạ bằng cách sử dụng các hệ thống ghi nhãn RadPrime DNA (Invitrogen). Lai được thực hiện theo các điều kiện nghiêm ngặt cao như chi tiết trước đó cho blots Nam (Murray et al., 1993). RT-PCR Tổng RNA (cô lập như trên để lai phía Bắc) đã được điều trị hai lần với 20 U RQ1 DNase (Promega) cho 30 phút ở 37 ° C. DNase đã được gỡ bỏ bằng cách sử dụng Kit và thanh lọc giao thức RNeasy Mini (Qiagen). Tổng số RNA sau đó đã được đảo ngược chép với mồi đặc hiệu (bổ sung Bảng S1) bằng cách sử dụng superscript One-Step RT-PCR với Taq Platinum kit (Invitrogen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Trình tự DNA xác nhận rằng những vùng mồi của TX0082 là 100% giống hệt với các đoạn tương ứng trong TX0016. Là một kiểm soát nội bộ, một mảnh 509-bp của gyrA (mã hóa gyrase A) đã được khuếch đại bằng cách sử dụng mồi FmGyrF và FmGyrR (bổ sung Bảng S1). Phản ứng mà không RT đã được sử dụng như điều khiển để xác minh thiếu ô nhiễm DNA trong tổng chuẩn bị RNA. Colony lai Chuẩn bị thuộc địa màng lysate và lai tạo trong điều kiện nghiêm ngặt cao được thực hiện như mô tả trước đây (Coque et al, 1995;.. Singh et al, 1998). Đầu dò DNA đã được tạo ra và đánh dấu phóng xạ như đã mô tả ở trên cho Bắc lai. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Xác định các protein CWA giả định với Ig-như nếp tìm kiếm của chúng tôi về trình tự bộ gen gần hoàn thành của E. faecium viêm nội tâm mạc có nguồn gốc từ chủng TX0016 (GW, BEM, et al ., dữ liệu chưa được công bố, http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/) cũng cho thấy tổng số 22 ORFs mã hóa protein CWA giả định (FMS được chỉ định, cho protein faeciumsurface E.) với một mô hình ba bên gần C-terminus ( một motif LPXTG hoặc biến thể, theo sau là một khu vực kỵ màng trải dài và một cái đuôi mang điện tích dương). Con số này là trong phạm vi của các protein CWA dự đoán của các vi khuẩn gram dương có liên quan mà thay đổi từ 8 (Streptococcus mutans) (Ponnuraj et al., 2003) đến 41 (E. faecalis). Trong khi số lượng protein CWA xác định đây là giống như số báo cáo trong một nghiên cứu gần đây (Hendrickx et al., 2007), trong đó xác định các protein CWA từ một chuỗi TX0016 bộ gen một phần (có sẵn tại NCBI), các báo cáo được công bố không bao gồm một trong những ORFs đây (Fms6) và phân loại một pseudogene (Fms15) là hai ORFs (kết quả bổ sung).