High-molecular-mass genomic DNA was

High-molecular-mass genomic DNA was prepared from peripheral blood leukocytes by a standard method [18]. For PCR-SSCP analysis, the promoter region and the translated parts of the 18 exons including flanking intron sequences were amplified with the oligonucleotide primer pairs shown in Table 1. Each PCR was performed in 100 j.tL containing 0.5 ig of genonlic DNA, 25 pmol of each primer, 200 .tmol of dNTPs,0.33 pmol of [32P]dCTP [111 TBq (3000 Ci)/mmol], 2 U of Taq
DNA polymerase (Perkin-Elmer, Norwalk, CT), and 10 iL of buffer as recommended by the manufacturer. Exon 15 was, however, amplified with Tbr DNA polymerase (NBL Gene Science, Cramlington, UK) and 20 L of buffer as recommended by the manufacturer because it amplified exon 15 much better than Taq DNA polymerase. Conditions used for thermal cycling with a DNA Thermal Cycler (Perkin-Elmer) are shown #{149} BIOTIN S SENSF.PRJMER- - ppjg S1 SENSEPRIMER WITH BIOTmN
-( STRZPTAVIDIN ON MAGNETIC BEADS AS ANTISENSEPRIMER AS1 AN11SENSEPRIMER WITh BIOTIN Fig. 1. Principle of the magnetic separation of single-stranded DNA, in which a solid support (streptavidin-coated beads) captures the biotinylated DNA fragment obtained after PCR with either a biotinylated sense primer (SB)/nonbiotinylated antisense primer (AS) or a nonbiotinylated sense primer (S)/biotinylated antisense primer (ASB) to sequence both the sense and antisense strands.Semiautomated direct sequencing of single-stranded DNA is performed with
Sequenase and four fluorescent dideoxynucleotides. in Table I. There were 35 thermal cycles followed by extension for 10 mm at 74 #{176}C. After amplification, 5 j.L of radiolabeled
PCR product were added to 5 L of loading buffer (950 mL/L formamide, 10 mmollL NaOH, 0.5 g/L bromphenol blue, 0.5 g/L xylene cyanol) and denatured by heating at 94 #{176}C for 2 mm.
Aliquots of 2 L were electrophoresed (6 W for 14 h at room temperature) in a Hydrolink-MDE polymer gel (AT Biochem,Malvern, PA) with or without 50 mLIL glycerol in 0.6x Tris-borate EDTA (0.0534 mol/L Tris-borate, 0.0534 mol/L boric acid, 0.00 12 molIL EDTA) as described by the manufacturer. Each gel was dried and autoradiographed for 1-3 days at room temperature.

Kết quả (Việt) 1:

Cao phân tử khối lượng gen DNA đã được chuẩn bị từ máu ngoại vi leukocytes bằng phương pháp tiêu chuẩn [18]. Đảng Cộng sản Romania-SSCP phân tích, vùng promoter và phần dịch của 18 exon bao gồm sườn trình tự intron được khuếch đại với cặp mồi oligonucleotide Hiển thị trong bảng 1. Mỗi Đảng Cộng sản Romania được thực hiện trong 100 j.tL có cách 0.5 ig genonlic DNA, 25 pmol mỗi mồi, 200 .tmol dNTPs, 0,33 pmol [32P] dCTP [111 TBq (3000 Ci) / mmol], 2 U TaqDNA polymerase (Perkin-Elmer, Norwalk, CT), và 10 iL đệm theo khuyến cáo của các nhà sản xuất. Exon 15 được, Tuy nhiên, khuếch đại với Tbr DNA polymerase (NBL Gene khoa học, Cramlington, Vương Quốc Anh) và 20 L đệm theo khuyến cáo của các nhà sản xuất vì nó khuếch đại exon 15 tốt hơn nhiều so Taq DNA polymerase. Điều kiện sử dụng để đi xe đạp nhiệt với một DNA nhiệt người đạp xe máy (Perkin-Elmer) được hiển thị # (149) BIOTIN S SENSF.PRJMER-- ppjg S1 SENSEPRIMER với BIOTmN-(STRZPTAVIDIN trên từ tính hạt AS ANTISENSEPRIMER AS1 AN11SENSEPRIMER với BIOTIN hình 1. Các nguyên tắc của từ tách đơn-stranded DNA, trong đó có một hỗ trợ vững chắc (bọc streptavidin hạt) bắt đoạn DNA biotinylated thu được sau khi Đảng Cộng sản Romania với hoặc là một cảm giác biotinylated mồi (SB) / nonbiotinylated antisense mồi (AS) hoặc nonbiotinylated một cảm giác mồi (S) / biotinylated antisense mồi (ASB) để trình tự ý thức và antisense sợi.Semiautomated trực tiếp trình tự DNA duy nhất-stranded được thực hiện vớiSequenase và bốn huỳnh quang dideoxynucleotides. trong bàn tôi. Có được 35 chu kỳ nhiệt được tiếp nối bởi phần mở rộng cho 10 mm tại 74 # (176) C. Sau khi khuếch đại, 5 j.L của radiolabeledĐảng Cộng sản Romania sản phẩm đã được thêm vào 5 L tải bộ đệm (950 mL/L formamide, 10 mmollL NaOH, cách 0.5 g/L bromphenol màu xanh, cách 0.5 g/L Xylen cyanol) và denatured nung tại 94 # (176) C cho 2 mm.Aliquots 2 L là electrophoresed (6 W cho 14 h ở nhiệt độ phòng) trong một Hydrolink-MDE polymer gel (AT Biochem, Malvern, PA) có hoặc không có 50 mLIL glyxêrin trong cách 0.6 x Tris-borat EDTA (0.0534 mol/L Tris-borat, 0.0534 axit boric mol/L, 0.00 12 molIL EDTA) được mô tả bởi nhà sản xuất. Mỗi gel là khô và autoradiographed trong 1-3 ngày ở nhiệt độ phòng.

Kết quả (Việt) 2:

DNA cao phân tử có khối lượng đã được chuẩn bị từ bạch cầu máu ngoại vi bằng một phương pháp tiêu chuẩn [18]. Đối với phân tích PCR-SSCP, vùng promoter và các bộ phận dịch của 18 exon bao gồm chầu trình tự intron được khuếch đại với cặp mồi oligonucleotide thể hiện trong Bảng 1. Mỗi PCR được thực hiện trong 100 j.tL chứa 0,5 ig của DNA genonlic, 25 pmol của mỗi mồi, 200 .tmol của dNTP, 0.33 pmol của [32P] dCTP [111 TBq (3000 Ci) / mmol], 2 U của Taq
DNA polymerase (Perkin-Elmer, Norwalk, CT), và 10 iL của bộ đệm theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Exon 15 lần, tuy nhiên, khuếch đại với polymerase DNA TBR (NBL Gene Khoa học, Cramlington, Vương quốc Anh) và 20 L của bộ đệm theo khuyến cáo của nhà sản xuất vì nó khuếch đại exon 15 tốt hơn nhiều so với Taq DNA polymerase. Điều kiện sử dụng để đi xe đạp nhiệt với một DNA Thermal Cycler (Perkin-Elmer) được thể hiện # {149} biotin S SENSF.PRJMER- - ppjg S1 SENSEPRIMER VỚI BIOTmN
-. (STRZPTAVIDIN ON HẠT TỪ AS ANTISENSEPRIMER AS1 AN11SENSEPRIMER với biotin Hình 1. Nguyên tắc của sự phân tách từ tính của DNA sợi đơn, trong đó một sự hỗ trợ vững chắc (hạt streptavidin bọc) bắt đoạn biotinylated DNA thu được sau phản ứng PCR với mồi hoặc là một cảm giác biotinylated (SB) / nonbiotinylated mồi antisense (AS) hay một mồi cảm giác nonbiotinylated (S) / biotinylated antisense mồi (ASB) trình tự cả về ý thức và antisense strands.Semiautomated trình tự trực tiếp của DNA sợi đơn được thực hiện với
Sequenase và bốn dideoxynucleotides huỳnh quang. trong Bảng I. Có 35 chu kỳ nhiệt theo sau là phần mở rộng cho 10 mm tại 74 # {176} C. Sau khi khuếch đại, JL của phóng xạ 5
sản phẩm PCR đã được thêm vào 5 L bốc đệm (950 mL / L Formamid, 10 mmollL NaOH, 0,5 g / L xanh bromphenol, 0,5 g / L xylene cyanol ) và biến tính bằng cách nung nóng ở 94 # {176} C cho 2 mm.
phân ước của 2 L được electrophoresed (6 W cho 14 giờ ở nhiệt độ phòng) trong một gel polymer HYDROLINK-MDE (AT Biochem, Malvern, PA) có hoặc không có 50 mLIL glycerol trong 0.6x Tris-EDTA borat (0,0534 mol / L Tris-borat, 0,0534 mol / L axit boric, 0.00 12 molIL EDTA) như mô tả của các nhà sản xuất. Mỗi gel được sấy khô và autoradiographed cho 1-3 ngày ở nhiệt độ phòng.