Preparation of vaccines and vaccina

Preparation of vaccines and vaccination

The BCG vaccine was prepared by reconstituting the vial of vaccine in 1ml of Sauton medium (Statens Serum Institute) and diluted 1∶4 in phosphate buffer saline (PBS). The 0.5ml dose of the diluted vaccine contained 2 to 8×105 CFU of BCG and represented 1/10 of the BCG in the vaccine vial. The TB biobead protein vaccine (Biobeads) consisted of biopolyester nanoparticles (50–300nm in diameter) displaying mycobacterial antigens, Ag85A and ESAT-6 as a fusion protein, on their surface and were produced in Escherichia coli [19]. The 2ml dose of vaccine contained 200 µg of fusion protein (40% of which was mycobacterial proteins), 250 µg of Pam3CSK4 (EMC Microcollections, Tuebingen, Germany) and mixed in Emulsigen adjuvant (30% final volume; MVP Laboratories, Omaha, NE, USA). The M. bovis culture filtrate protein vaccine (CFP) was prepared from a culture of M. bovis AN5 as previously described [21]. The 2ml dose of this vaccine contained 400 µg M. bovis culture filtrate protein, 250 µg Pam3CSK4 and mixed in dimethyldioctadecyl ammonium bromide (DDA; Sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA). DDA was prepared by heating a 10mg/ml solution at 80°C until micelles formed, cooled to room temperature and added 1∶1 to the rest of the vaccine constituents.

For the initial vaccination with BCG, the calves were divided into two groups by using a stratified random sampling system such that both groups had a similar distribution of breeds. One group contained 62 calves and the other 17 animals. When the calves were between 2–4 weeks of age, the larger group of calves were vaccinated subcutaneously in the mid-cervical region on the left side of the neck with a 0.5ml dose of the diluted BCG vaccine. The group of 17 calves served as non-vaccinated controls (negative control). Approximately 2 years later (106 weeks after first vaccination), the 62 BCG-vaccinated cattle were divided into four groups, again using a stratified random sampling system for breed distribution, with each group containing 15 to 16 animals. One group of BCG-vaccinated cattle (n = 16) was not revaccinated (BCG once group), while a second group (n = 15) was revaccinated with BCG vaccine in a similar manner as undertaken previously (BCG/BCG group). Cattle from the third group (n = 15) were vaccinated subcutaneously in the neck with a 2ml dose of the TB Biobead vaccine (BCG/Biobeads group) and cattle from the fourth group (n = 16) received M. bovis CFP vaccine administered in a similar volume and manner (BCG/CFP group). The calves in BCG/Biobeads and BCG/CFP groups were reinoculated with the same TB protein vaccine 3 weeks later.

M. bovis challenge and necropsy procedure

The calves were challenged endotracheally with 5×103 CFU of virulent M. bovis at 2½ years of age (23 weeks after revaccination) as previously described [20]. All cattle were killed 13 weeks after challenge. Procedures for identifying macroscopic tuberculous lesions and processing for histology have been described previously [20]. A lung lesion score was calculated by counting the total number of lesions and applying a score as follows: 0, no lesions; 1, 1–9 lesions; 2, 10–29 lesions; 3, 30–99 lesions; 4, 100–199 lesions; 5, ≥200 lesions. A total lymph node lesion score per animal was calculated by pooling scores for four pulmonary lymph nodes (left and right bronchial and anterior and posterior mediastinal). Scores for individual lymph nodes were: 0, no lesions; 1, 1–19 small lesions (1–4mm diameter); 2, ≥20 small lesions (1–4mm diameter) or medium size lesion(s) (5–9mm diameter); 3, large lesion(s) (≥10mm diameter). Samples from the four pulmonary lymph nodes were collected from all of the animals for bacterial culture to confirm M. bovis infection and for histological examination. Additional samples were collected from any tuberculous-like lesions observed in the lungs. For bacterial culture, tissue samples were homogenized in a Tenbroeck grinder (Wheaton, Millville NJ, USA), decontaminated in 0.75% cetylpyridium chloride for 1 hours, centrifuged at 3500×g for 20minutes and processed for isolation of mycobacteria as described previously [20]. For histological examination, sections were stained with hematoxylin and eosin. Scoring of histopathological lesions in the pulmonary lymph nodes was based on the scale described by Wangoo et al. [22]. Briefly, Stage I granulomas were composed of accumulations of epitheloid macrophages with low numbers of lymphocytes, neutrophils and Langhans multinucleated giant cells and there was an absence of necrosis. Stage II granulomas were similar to Stage I granulomas but also had central infiltrates of neutrophils and lymphocytes and necrosis could be present. Stage III granulomas exhibited complete fibrous encapsulation and significant necrosis and mineralisation could be present. Stage IV granulomas were characterised by multiple coalescing caseo-necrotic granulomas with multicentric necrosis and mineralisation. When no granulomas were observed, the tissue section was scored as Stage 0. The histopathological score was based on the most severe lesion observed in each pulmonary lymph node section with scores ranging from 0 to 4, corresponding to Stages 0 to IV. A total histopathological score was compiled by pooling scores for each of the four pulmonary lymph nodes. Scoring of gross and histopathological lesions was undertaken blinded without knowledge of the vaccine groups.

Kết quả (Việt) 1:

Chuẩn bị của vắc xin và tiêm chủngBCG vắc xin đã được chuẩn bị bởi reconstituting chai thuốc tiêm trong 1ml Sauton phương tiện truyền thông (Staten Serum Institute) và 1∶4 pha loãng trong dung dịch muối đệm phosphat (PBS). Cách 0.5ml liều vắc-xin pha loãng chứa 2 để 8 × 105 CFU BCG và đại diện cho 1/10 của BCG trong lọ vắc xin. Biobead protein vắc xin ngừa lao (Biobeads) bao gồm biopolyester hạt nano (50-300nm đường kính) Hiển thị mycobacterial kháng nguyên, Ag85A và ESAT-6 là một phản ứng tổng hợp protein, trên bề mặt của họ và đã được sản xuất trong Escherichia coli [19]. 2ml liều vắc-xin chứa 200 μg của phản ứng tổng hợp protein (40% trong số đó là mycobacterial protein), 250 μg Pam3CSK4 (EMC Microcollections, Tuebingen, Đức) và pha trộn trong Emulsigen bổ (30% khối lượng cuối cùng; MVP phòng thí nghiệm, Omaha, NE, Mỹ). M. bovis văn hóa tinh chất đạm tiêm (CFP) đã được chuẩn bị từ một nền văn hóa của M. bovis AN5 như mô tả trước đó [21]. 2ml liều vắc xin này chứa 400 μg M. bovis văn hóa tinh protein, 250 μg Pam3CSK4 và pha trộn trong dimethyldioctadecyl amoni bromua (DDA; Sigma hóa chất, St. Louis, MO, Mỹ). DDA đã được chuẩn bị bằng cách đốt một giải pháp 10mg/ml ở 80° C cho đến khi micelles được thành lập, làm mát bằng nước đến nhiệt độ phòng và thêm vào 1∶1 để phần còn lại của các thành phần vắc xin.Cho tiêm phòng ban đầu với BCG, các bắp chân được chia thành hai nhóm bằng cách sử dụng một hệ thống lấy mẫu phân tầng ngẫu nhiên như vậy mà cả hai nhóm có một phân phối tương tự như của giống. Một nhóm chứa con bê 62 và 17 loài động vật khác. Khi các con bê từ 2 – 4 tuần tuổi, nhóm lớn hơn của con bê đã được tiêm phòng subcutaneously trong vùng giữa cổ bên trái của cổ với một liều lượng cách 0.5ml của vắc xin BCG pha loãng. Nhóm 17 con bê làm tiêm phòng không điều khiển (kiểm soát tiêu cực). Khoảng 2 năm sau đó (106 tuần sau khi tiêm phòng vắc xin đầu tiên), 62 BCG tiêm phòng gia súc được chia thành bốn nhóm, một lần nữa bằng cách sử dụng một hệ thống lấy mẫu phân tầng ngẫu nhiên để phân phối giống, với mỗi nhóm có chứa 15 đến 16 động vật. Một nhóm các BCG tiêm phòng gia súc (n = 16) là không revaccinated (BCG một nhóm), trong khi một nhóm thứ hai (n = 15) revaccinated với BCG vắc xin một cách tương tự như thực hiện trước đó (BCG/BCG nhóm). Gia súc từ nhóm thứ ba (n = 15) đã được tiêm phòng subcutaneously ở cổ với một liều lượng 2ml của TB Biobead vắc xin (BCG/Biobeads nhóm) và gia súc từ nhóm thứ tư (n = 16) nhận được M. bovis CFP vắc xin quản lý trong một khối lượng tương tự và cách (BCG/CFP nhóm). Con bê ở BCG/Biobeads và BCG/CFP nhóm đã được reinoculated với protein cùng một vắc xin ngừa lao 3 tuần sau đó.M. bovis thách thức và necropsy thủ tụcCác con bê đã thách thức endotracheally với 5 × 103 CFU độc M. bovis lúc 2½ tuổi (23 tuần sau khi revaccination) như đã mô tả [20]. Tất cả các gia súc thiệt mạng 13 tuần sau khi thách thức. Các thủ tục cho việc xác định tổn thương tuberculous vĩ mô và xử lý cho tổ chức học đã được mô tả trước đó [20]. Một số điểm tổn thương phổi đã được tính toán bằng đếm tổng số tổn thương và áp dụng một số điểm như sau: 0, không có tổn thương; 1, 1-9 tổn thương; 2, 10-29 tổn thương; 3, 30-99 tổn thương; 4, 100-199 tổn thương; 5, ≥200 tổn thương. Một hạch bạch huyết tất cả tổn thương điểm mỗi động vật đã được tính toán bằng cách tổng hợp phổ nhạc cho bốn hạch bạch huyết phổi (trái và phải phế quản và trước và sau mediastinal). Phổ nhạc cho hạch bạch huyết cá nhân đã: 0, không có tổn thương; 1, tổn thương nhỏ 1-19 (đường kính 1-4mm); 2, ≥20 tổn thương nhỏ (1-4mm đường kính) hoặc kích thước trung bình lesion(s) (đường kính 5-9 mm); 3, lớn lesion(s) (≥10mm đường kính). Mẫu từ các hạch bạch huyết phổi bốn được thu thập từ tất cả các loài động vật cho nền văn hóa vi khuẩn để xác nhận M. bovis nhiễm trùng và các xét nghiệm mô học. Thêm mẫu đã được thu thập từ bất kỳ tổn thương tuberculous giống như quan sát thấy trong phổi. Cho văn hóa vi khuẩn, mẫu mô được homogenized trong một Tenbroeck máy xay (Wheaton, Millville NJ, Hoa Kỳ), decontaminated ở 0,75% cetylpyridium clorua trong 1 giờ, ly 3500 × g cho 20minutes và xử lý sự cách điện của mycobacteria như mô tả trước đó [20]. Để kiểm tra mô học, phần đã được nhuộm màu với hematoxylin và eosin. Ghi histopathological tổn thương trong các hạch bạch huyết phổi dựa trên quy mô mô tả bởi Wangoo et al. [22]. Một thời gian ngắn, giai đoạn I granulomas đã được bao gồm accumulations của đại thực bào epitheloid với số lượng thấp của tế bào lympho, bạch cầu trung tính và Langhans multinucleated tế bào khổng lồ và có là một sự vắng mặt của hoại tử. Giai đoạn II granulomas đã được tương tự như giai đoạn I granulomas, nhưng cũng có trung tâm xâm nhập của bạch cầu trung tính và tế bào lympho và hoại tử có thể có mặt. Giai đoạn III granulomas trưng bày hoàn toàn đóng gói xơ và hoại tử đáng kể và mineralisation có thể có mặt. Giai đoạn IV granulomas đã được đặc trưng bởi nhiều coalescing hoại tử caseo granulomas với multicentric hoại tử và mineralisation. Khi không có granulomas đã được quan sát, phần mô sẽ được ghi là giai đoạn 0. Điểm histopathological dựa trên tổn thương nghiêm trọng nhất quan sát thấy trong mỗi phần hạch bạch huyết phổi với điểm số từ 0 tới 4, tương ứng với giai đoạn 0 đến IV. Tổng số histopathological điểm được soạn thảo bằng cách tổng hợp các điểm cho mỗi của các hạch bạch huyết phổi bốn. Ghi tổng và histopathological tổn thương đã được tiến hành mù mà không có kiến thức về các nhóm vắc xin.

Kết quả (Việt) 2:

Chuẩn bị các loại vắc-xin và tiêm phòng vắc xin Thuốc chủng ngừa BCG đã được chuẩn bị bằng cách tái lập các lọ vắc-xin trong 1ml Sauton trung bình (Viện Statens Serum) và pha loãng 1:04 trong phosphate mặn đệm (PBS). Các liều 0,5ml vaccine pha loãng chứa 2-8 × 105 CFU của BCG và đại diện 1/10 BCG trong lọ vắc xin. Thuốc chủng ngừa protein TB biobead (Biobeads) bao gồm các hạt nano biopolyester (50-300nm đường kính) hiển thị kháng nguyên mycobacteria, Ag85A và ESAT-6 như là một protein phản ứng tổng hợp, trên bề mặt của họ và đã được sản xuất trong Escherichia coli [19]. Các liều 2ml vaccine chứa 200 mg protein phản ứng tổng hợp (40% trong số đó là các protein mycobacteria), 250 mg Pam3CSK4 (EMC Microcollections, Tuebingen, Đức) và trộn lẫn trong Emulsigen tá dược (30% khối lượng thức; MVP Laboratories, Omaha, NE , HOA KỲ). Các M. bovis protein lọc văn hóa vaccine (CFP) đã được chuẩn bị từ một nền văn hóa của M. bovis AN5 như mô tả [21] trước đó. Các liều 2ml của vắc-xin này có chứa 400 mg M. bovis protein lọc văn hóa, 250 mg Pam3CSK4 và hỗn hợp trong dimethyldioctadecyl bromide amoni (DDA; Sigma Hóa chất, St. Louis, MO, USA). DDA đã được chuẩn bị bằng cách đun nóng dung dịch 10mg / ml ở 80 ° C cho đến khi hình thành các mixen, làm lạnh đến nhiệt độ phòng và thêm vào 01:01 để phần còn lại của các thành phần vắc-xin. Đối với việc tiêm phòng ban đầu với BCG, các con bê được chia thành hai nhóm theo sử dụng một hệ thống lấy mẫu ngẫu nhiên phân tầng như vậy mà cả nhóm đã có một phân phối tương tự giống. Một nhóm gồm 62 con bê và 17 loài động vật khác. Khi các con bê con từ 2-4 tuần tuổi, các nhóm lớn hơn của bê được tiêm dưới da ở vùng giữa cổ tử cung ở phía bên trái của cổ với một liều 0,5ml vaccine BCG pha loãng. Các nhóm 17 bê phục vụ như kiểm soát không được tiêm (điều khiển âm). Khoảng 2 năm sau (106 tuần sau khi chủng ngừa đầu tiên), 62 gia súc BCG-chủng ngừa được chia thành bốn nhóm, một lần nữa bằng cách sử dụng một hệ thống lấy mẫu ngẫu nhiên phân tầng để phân phối giống, với mỗi nhóm có chứa 15-16 loài động vật. Một nhóm gia súc BCG-tiêm chủng (n = 16) đã không revaccinated (BCG khi cả nhóm), trong khi nhóm thứ hai (n = 15) được revaccinated với vaccine BCG trong một cách tương tự như đã cam kết trước đó (BCG / BCG nhóm). Gia súc từ các nhóm thứ ba (n = 15) được tiêm dưới da ở cổ với một liều 2ml thuốc chủng lao Biobead (nhóm BCG / Biobeads) và gia súc từ nhóm IV (n = 16) nhận vaccine M. bovis CFP quản lý trong một khối lượng tương tự và cách thức (nhóm BCG / CFP). Các bê trong BCG / Biobeads và BCG / CFP nhóm đã reinoculated với cùng TB protein vaccine 3 tuần sau đó. M. bovis thách thức và thủ tục khám tử The bê đã được thử thách endotracheally với 5 × 103 CFU của độc M. bovis ở 2 năm rưỡi tuổi (23 tuần sau tái chủng ngừa) như mô tả [20] trước đó. Tất cả các gia súc bị chết 13 tuần sau khi chủng. Thủ tục xác định các tổn thương lao vĩ mô và chế biến cho mô học đã được mô tả trước đây [20]. Một số tổn thương phổi đã được tính toán bằng cách đếm tổng số các tổn thương và áp dụng một số điểm như sau: 0, không có tổn thương; 1, 1-9 tổn thương; 2, 10-29 tổn thương; 3, 30-99 tổn thương; 4, 100-199 tổn thương; 5, ≥200 tổn thương. Tổng số điểm hạch tổn thương mỗi con vật đã được tính toán bằng điểm số tổng hợp cho bốn nút bạch huyết phổi (trái và phải phế quản và trung thất trước và sau). Điểm cho các hạch bạch huyết cá nhân là: 0, không có tổn thương; 1, 1-19 tổn thương nhỏ (1-4mm đường kính); 2, ≥20 tổn thương nhỏ (1-4mm đường kính) hoặc vừa thương tổn (s) (đường kính 5-9mm); 3, tổn thương lớn (s) (đường kính ≥10mm). Các mẫu từ bốn hạch bạch huyết phổi đã được thu thập từ tất cả các loài động vật để nuôi cấy vi khuẩn để xác nhận nhiễm M. bovis và kiểm tra mô học. Thêm mẫu được thu thập từ bất kỳ tổn thương lao giống như quan sát thấy trong phổi. Đối với nuôi cấy vi khuẩn, mẫu mô được đồng nhất trong một máy xay Tenbroeck (Wheaton, Millville NJ, USA) và không nhiễm bẩn ở 0,75% cetylpyridium clorua cho 1 giờ, ly tâm ở 3500 × g cho 20minutes và xử lý để phân lập mycobacteria như mô tả trước đây [20] . Để kiểm tra mô học, phần được nhuộm bằng hematoxylin và eosin. Chấm điểm các tổn thương mô bệnh học trong các hạch bạch huyết phổi được dựa trên quy mô được mô tả bởi Wangoo et al. [22]. Một thời gian ngắn, những u hạt Giai đoạn I đã được sáng tác trong những tích lũy của các đại thực bào epitheloid với số lượng thấp của các tế bào lympho, bạch cầu trung tính và các tế bào khổng lồ đa nhân Langhans và đã có một sự vắng mặt của hoại tử. Giai đoạn II u hạt này tương tự Stage I u hạt nhưng cũng đã có thâm nhiễm bạch cầu trung tính và trung tâm của tế bào lympho và hoại tử có thể có mặt. Giai đoạn III u hạt trưng bày hoàn toàn đóng gói dạng sợi và hoại tử có ý nghĩa và khoáng có thể có mặt. Giai đoạn u hạt IV đã được đặc trưng bởi nhiều coalescing caseo-hoại tử u hạt hoại tử multicentric và khoáng. Khi không có u hạt đã được quan sát, phần mô được ghi như Stage 0. Điểm số mô bệnh học được dựa trên những tổn thương nghiêm trọng nhất được quan sát trong mỗi bạch huyết phổi nút phần có điểm khác nhau, 0-4, tương ứng với giai đoạn từ 0 đến IV. Một tổng số điểm mô bệnh học đã được biên soạn bằng cách tổng hợp điểm số cho mỗi một trong bốn hạch bạch huyết phổi. Chấm điểm tổng và mô bệnh học tổn thương đã được thực hiện mà không mù kiến thức về các nhóm thuốc chủng ngừa.