FIG 4 Evaluation of qPCR counts rel

FIG 4 Evaluation of qPCR counts relative to cell counts. (A) Sum of separately measured bacterial and archaeal 16S rRNA gene copy numbers versus cell counts colored by core. Gray-shaded region, 95% prediction interval for the data in aggregate (i.e., 95% of future measurements are predicted to be within this interval); green-shaded areas, known variation in the range of 16S rRNA gene copy numbers per genome (dark green 3.04 per genome; light green 24 per genome). Each sediment core is coded by color and has its own fit line; data source citations are in Fig. S4 and Table S1 in the supplemental material. (B) Standard deviation (Std. dev.) of qPCR counts (open blue circles) or yields by CARD-FISH with proteinase K archaeal permeabilization (closed red circles) versus standard deviation for cell counts for each core. (C) Sum of separately measured 16S rRNA gene copy numbers of archaea and bacteria versus a single measurement obtained with universal primers, with the 95% confidence interval shown in gray. In all panels, solid black lines are the 1:1 line and dashed black lines are linear regressions of the data.



exception of these sandy intertidal zones, proper archaeal permea- bilization procedures appear to be necessary to achieve both high fractions of archaea and high yields.
Evaluating archaeal and bacterial qPCR measurements rela- tive to total cell counts. High CARD-FISH yields relative to total cell counts do not necessarily mean that CARD-FISH is the most accurate method because CARD-FISH and total cell counts are both based on the visual counting of cells in microscopic images and may therefore suffer from similar biases. Therefore, we com- pared the measurements obtained by cell counting methods to the measurements obtained by qPCR, which is the only other com- monly used quantification method.
In the 10 studies (352 samples) that included cell counts in addition to archaeal and bacterial qPCR measurements, 16S rRNA gene copy numbers were not closely related to total cell counts (Fig. 4A; see Fig. S4 in the supplemental material). The correlation was positive and significant (log-log, P 0.001, R2 0.41), but the large 95% prediction interval showed that qPCR measure-

ments are poorly predicted by total cell counts. For a given cell count, the narrowest interval that contained 95% of qPCR copy numbers spanned 4 orders of magnitude (Fig. 4A, gray band). This variability is too large to be explained by different 16S rRNA gene copy numbers per cell (mean 3.04, maximum 24, ex- cluding the results for Streptococcus agalactiae at 85 gene copies per cell, based on the findings obtained with 5,669 published ge- nomes [39]). In fact, many of the data points lie under the 1:1 line, which indicates either highly variable undercounting by qPCR or highly variable overcounting of total cells. To test which of the two methods drove the observed variability, we compared the stan- dard deviations of all log-transformed qPCR measurements within a sediment core with the standard deviations of all log- transformed cell counts within the same core. For the majority of sediment cores (15/25), qPCR measurements were more variable than cell counts (Fig. 4B), showing that qPCR and not cell counts drove the high variability seen in Fig. 4A. Overall, the variance in qPCR counts was weakly correlated (P 0.03, R2 0.19, n 26)

Kết quả (Việt) 1:

HÌNH 4 đánh giá của qPCR tính tương đối so với số lượng tế bào. (A) tổng số đo được một cách riêng biệt vi khuẩn và vi khuẩn cổ 16S rRNA gene bản sao so với số lượng tế bào màu bằng cốt lõi. Vùng màu xám bóng mờ, 95% dự đoán khoảng thời gian cho các dữ liệu trong tổng hợp (tức là, 95% của các phép đo trong tương lai dự đoán được trong khoảng thời gian này); bóng mờ màu xanh lá cây khu vực, được biết đến các biến thể trong phạm vi của 16S rRNA gene bản sao con số cho mỗi bộ gen (màu xanh đậm 3,04 một gen; ánh sáng xanh 24 một gen). Mỗi lõi trầm tích mã hoá bởi màu sắc và có dòng phù hợp riêng của mình; dữ liệu nguồn trích dẫn trong hình. S4 và bảng S1 trong các vật liệu bổ sung. (B) tiêu chuẩn độ lệch (Std. dev.) là qPCR đếm (mở vòng tròn màu xanh) hoặc sản lượng bằng thẻ-cá với proteinase K vi khuẩn cổ permeabilization (đóng vòng tròn màu đỏ) so với độ lệch chuẩn cho di động số lần cho mỗi lõi. (C) số đo được một cách riêng biệt 16S rRNA gene bản sao số của vi khuẩn cổ và vi khuẩn so với một thước đo duy nhất thu được với lớp lót phổ quát, với khoảng tin cậy 95% Hiển thị trong màu xám. Trong tất cả các bảng, rắn màu đen dòng là dòng 1:1 và tiêu tan đen dòng là tuyến tính regressions của dữ liệu. ngoại lệ của các khu vực cận đầy cát, thích hợp vi khuẩn cổ permea bilization thủ tục xuất hiện để được cần thiết để đạt được cả hai phân số cao của vi khuẩn cổ và cao sản lượng.Đánh giá các vi khuẩn cổ và vi khuẩn qPCR đo đạc rela-hoạt động cùng để đếm tất cả các tế bào. Cao sản lượng thẻ cá tương đối so với tất cả các tế bào đếm không nhất thiết có nghĩa rằng thẻ-cá là phương pháp chính xác nhất vì thẻ cá và di động tất cả số lần được cả hai dựa trên tính trực quan của các tế bào trong vi hình ảnh và do đó có thể bị tương tự thành kiến. Vì vậy, chúng tôi com - pared các phép đo được di động đếm các phương pháp để đo lường thu được bằng qPCR, đó là chỉ com-monly sử dụng định lượng phương pháp khác.Trong các 10 nghiên cứu (352 mẫu) bao gồm số lượng tế bào ngoài vi khuẩn cổ và vi khuẩn qPCR đo lường, 16S rRNA gene bản sao số đã không chặt chẽ liên quan đến số lượng tổng số di động (hình 4A; xem hình. S4 trong các vật liệu bổ sung). Các mối tương quan là tích cực và đáng kể (đăng nhập-đăng nhập, P 0,001, R2 0,41), nhưng khoảng 95% dự đoán lớn cho thấy rằng qPCR biện pháp - ments kém được dự đoán bởi di động tất cả đếm. Cho một số tế bào nhất định, khoảng thời gian hẹp bao gồm 95% của qPCR bản sao số kéo dài 4 đơn đặt hàng của các cường độ (hình ban nhạc 4A, màu xám). Sự biến đổi này là quá lớn để được giải thích bởi khác nhau 16S rRNA gene bản sao số mỗi tế bào (có nghĩa là 3,04, tối đa 24, ex-cluding kết quả cho Streptococcus agalactiae tại 85 gen bản mỗi tế bào, dựa trên các kết quả thu được với công bố 5,669 ge-nomes [39]). Trong thực tế, nhiều người trong số các điểm dữ liệu nằm dưới dòng 1:1 cho biết một trong hai undercounting hay thay đổi bởi qPCR hoặc overcounting hay thay đổi của tất cả các tế bào. Để kiểm tra mà lái xe hai phương pháp biến đổi quan sát, chúng tôi so sánh các độ lệch stan Sở NN & PTNT của tất cả các phép đo chuyển đổi đăng nhập qPCR trong vòng một lõi trầm tích với độ lệch chuẩn của tất cả Nhật ký-chuyển đổi tế bào đếm trong cốt lõi cùng. Đối với phần lớn trầm tích lõi (15/25), qPCR đo là thêm biến hơn số lần di động (hình 4B), Đang hiển thị rằng qPCR và không di động đếm đã lái xe biến đổi cao nhìn thấy trong hình 4A. Nhìn chung, phương sai trong qPCR đếm là yếu tương quan (P 0,03, R2 0.19, n 26)

Kết quả (Việt) 2:

FIG 4 Đánh giá qPCR tính tương đối so với số lượng tế bào. (A) Sum của riêng đo 16S rRNA số bản sao gen của vi khuẩn và archaea so với số lượng tế bào màu của lõi. Gray-tô khu vực, 95% khoảng thời gian dự đoán cho các dữ liệu trong tổng hợp (ví dụ, 95% của các phép đo tương lai được dự báo là trong khoảng thời gian này); cây xanh rợp bóng, biến thể được biết đến trong phạm vi của 16S rRNA số bản sao gen mỗi gen (màu xanh đậm 3.04 mỗi bộ gen, ánh sáng màu xanh lá cây 24 mỗi bộ gen). Mỗi lõi trầm tích được mã hóa bằng màu sắc và có dòng phù hợp riêng của mình; trích dẫn nguồn dữ liệu trong hình. S4 và Bảng S1 trong vật liệu bổ sung. (B) Tiêu chuẩn độ lệch (Std dev..) Của qPCR đếm (vòng tròn màu xanh mở) hoặc sản lượng bằng CARD-FISH với proteinase K permeabilization archaea (vòng tròn màu đỏ đóng) so với độ lệch chuẩn cho số lượng tế bào cho mỗi lõi. (C) của Sum tính riêng 16S rRNA số bản sao gene của vi khuẩn cổ và vi khuẩn so với một phép đo đơn thu được với mồi phổ quát, với khoảng tin cậy 95% hiện trong màu xám. Trong tất cả các bảng, dòng rắn màu đen là đường 1: 1 và các đường đứt nét màu đen đang hồi quy tuyến tính của dữ liệu. Ngoại trừ những vùng triều cát, thủ tục bilization permea- archaeal thích hợp xuất hiện là cần thiết để đạt được cả hai phân số cao của vi khuẩn cổ và cao sản lượng. Đánh giá các phép đo qPCR archaea và vi khuẩn quan hệ chính kịp thời để tổng số lượng tế bào. Sản lượng cao CARD-FISH so với tổng số lượng tế bào không nhất thiết có nghĩa rằng CARD-FISH là phương pháp chính xác nhất vì CARD-FISH và tổng số lượng tế bào đều dựa trên tính trực quan của các tế bào trong các hình ảnh vi và do đó có thể bị những thành kiến tương tự . Do đó, chúng tôi com- sánh các số đo thu được bằng phương pháp đếm tế bào để các phép đo thu được bằng qPCR, đó là monly đồng chỉ sử dụng phương pháp định lượng khác. Trong 10 nghiên cứu (352 mẫu) bao gồm số lượng tế bào trong ngoài archaea và vi khuẩn đo qPCR, 16S rRNA số bản sao gene không liên quan chặt chẽ với tổng số lượng tế bào (Hình 4A;. xem hình S4 trong vật liệu bổ sung.). Các mối tương quan là tích cực và đáng kể (log-log, P 0,001, R2 0,41), nhưng khoảng 95% dự đoán lớn cho thấy qPCR lường sở đang kém dự đoán của tổng số lượng tế bào. Đối với một số tế bào nhất định, khoảng cách hẹp nhất có chứa 95% số bản sao qPCR kéo dài 4 đơn đặt hàng của các cường độ (4A hình., Ban nhạc màu xám). Biến đổi này là quá lớn để được giải thích bởi 16S rRNA số bản sao gen khác nhau trên mỗi cell (có nghĩa là 3.04, tối đa 24, Thí gồm cả các kết quả cho Streptococcus agalactiae ở 85 bản sao của gen trong mỗi tế bào, dựa trên những kết quả thu được với 5669 mẫu gen được công bố [39]). Trong thực tế, nhiều người trong số các điểm dữ liệu nằm dưới 1: 1 dòng, mà chỉ ra một trong hai biến đổi cao undercounting bởi qPCR hoặc overcounting cao biến của tổng số tế bào. Để kiểm tra trong hai phương pháp lái xe các biến quan sát, chúng tôi so sánh các độ lệch chuẩn của tất cả các Sở NN & PTNT qPCR đo log-chuyển trong một lõi trầm tích với độ lệch chuẩn của tất cả các log- số lượng tế bào biến đổi trong lõi. Đối với phần lớn các lõi trầm tích (15/25), các phép đo qPCR có nhiều biến đổi hơn số lượng tế bào (Hình. 4B), cho thấy rằng qPCR và không đếm tế bào lái biến thiên cao nhìn thấy trong hình. 4A. Nhìn chung, sự khác biệt trong tính qPCR đã yếu ớt tương quan (P 0.03, 0.19 R2, n 26)