RESULTSWhole-genome shotgun sequenc

RESULTS
Whole-genome shotgun sequencing of two clinical USA300
strains reveals multiple insertion and deletion mutations incurred in the transition from VSSA to VISA.Hageman et al. described a USA300 MRSA strain that developed intermediate resistance to vancomycin and nonsusceptibility to daptomycin in a
patient with endocarditis after exposure to both antibiotics (32).
The isolates were collected sequentially, exhibited different antibiotic susceptibility patterns, and were typed as USA300 by
pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). We obtained two of these
isolates, designatedS. aureusA1-VSSA andS. aureusA2-VISA, for
genetic analysis. The first strain isolated from the patient, A1-VSSA, was susceptible to vancomycin, daptomycin, and linezolid,
whereas the subsequently isolated strain, A2-VISA, was intermediate resistant to vancomycin, not susceptible to daptomycin, and
resistant to linezolid as measured by reference broth microdilution (Table 1). Additionally, A1-VSSA was beta-lactamase positive
and A2-VISA was beta-lactamase negative by the cefinase-lactamase detection disc assay. The vancomycin phenotypes of both
strains were confirmed by PAP-AUC (Fig. 1). A2-VISA had an
AUC ratio of 0.92 to Mu50, the prototypical VISA, indicating the
full VISA phenotype and no heteroresistance (AUC ratio of the
isolate to hVISA strain MU3 of
0.90) was observed in A1-VSSA
(Fig. 1).
A1-VSSA and A2-VISA were sequenced using the Roche/454
Junior instrument and the raw data were trimmed to remove the
terminal 30 nucleotides from both the 5=and 3=ends, low quality
and ambiguous nucleotides, and any reads under 250 nucleotides
long. The average read size was used in analysis for each strain was
400 nt.De novoassembly yielded 77 and 113 contigs for A1-VSSA and A2-VISA, respectively, composed of over 40 million
total bases, with average read lengths of over 350 bp and a GC
content of 32%. BLAST analysis of the 7 MLST alleles (http://www
.mlst.net/)(25) andsparepeat pattern alignment (Ridom SpaServer;
www.spaserver.ridom.de) confirmed that both isolates were sequence type 8 (ST8) andspat008 (33).
In order to determine the best reference, the 454 data were
remapped against finished genomes of two vancomycin-susceptible USA300 strains, TCH1516 (NC_010079) and FPR3757
(NC_007793) (21, 35). The sequencing data for A1-VSSA and
A2-VISA (experimental strains) covered the entire genomes of
both USA300 reference sequences (average genome-wide nucleotide coverage of 14and 13, respectively). Both experimental
strains contained the entire sequences of the two plasmids from
TCH1516 (pUSA01HOU and pUSA300HOUMR) (35, 44). Sequencing coverage for the smaller plasmid was between 200 and
1,000, while the larger plasmid was covered about 90for A1-VSSA and200for A2-VISA.
There were at least 70 putative SNPs and one indel that A1-VSSA and A2-VISA shared in common compared to either reference strain. Because our strains were more related to TCH1516,
this genome was used as the reference strain for further comparative analysis. The complete list of variants discovered in the experimental strains and TCH1516 are listed in Table S1 in the supplemental material. Additionally, we noted that two particular
regions were divergent in the experimental strains and strain
TCH1516. First, an approximately 600-bp region of the chromosome overlapping two tandem lipoproteins (USA300HOU_0109
and USA300HOU_0110) was missing in both experimental
strains. Second, a putative noncoding RNA region annotated as

Kết quả (Việt) 1:

KẾT QUẢToàn bộ bộ gen shotgun trình tự của hai lâm sàng USA300các chủng tiết lộ nhiều tính năng chèn và xóa các đột biến phát sinh trong quá trình chuyển đổi từ VSSA VISA. Mô tả Hageman et al. một chủng USA300 MRSA phát triển trung bình kháng vancomycin và nonsusceptibility để daptomycin trong mộtbệnh nhân với endocarditis sau khi tiếp xúc với cả hai loại thuốc kháng sinh (32).Các chủng được thu thập theo tuần tự, trưng bày các mẫu khác nhau tính nhạy cảm kháng sinh và đã được đánh máy như là USA300 bởilĩnh vực Pulsed gel electrophoresis (PFGE). Chúng tôi có được hai trong số này««««cô lập, designatedS. aureusA1-VSSA andS. aureusA2-VISA, chophân tích di truyền. Sự căng thẳng đầu tiên bị cô lập từ các bệnh nhân, A1-VSSA, là nhạy cảm với vancomycin, daptomycin và linezolid,trong khi sự căng thẳng sau đó bị cô lập, A2-VISA, Trung cấp khả năng kháng vancomycin, không dễ bị để daptomycin, vàkhả năng kháng linezolid được đo bằng tham chiếu canh microdilution (bảng 1). Ngoài ra, A1-VSSA là phiên bản beta-lactamase tích cựcA2-VISA là phiên bản beta-lactamase tiêu cực bởi cefinase - lactamase phát hiện đĩa khảo nghiệm. Phenotypes tiêm của cả haicăng thẳng đã được xác nhận bởi PAP-AUC (hình 1). A2-VISA có mộtTỉ lệ AUC 0,92 Mu50, nguyên mẫu xin VISA, chỉ ra cácđầy đủ kiểu hình thị thực và không có heteroresistance (tỉ lệ AUC của cácisolate để hVISA chủng MU3 0,90) được quan sát thấy ở A1-VSSA(Hình 1).A1 VSSA và A2-VISA được trình tự bằng cách sử dụng Roche/454Dụng cụ học cơ sở và các dữ liệu thô đã được tỉa để loại bỏ cácthiết bị đầu cuối nucleotide 30 5 = và 3 = kết thúc, chất lượng thấpvà mơ hồ nucleotide, và bất kỳ đọc dưới 250 nucleotidedài. Đọc cỡ trung bình được sử dụng trong phân tích cho mỗi chủng400 nt. De novoassembly mang 77 và 113 contigs A1 VSSA và A2-VISA, tương ứng, bao gồm hơn 40 triệuTổng số cơ sở, với trung bình đọc các độ dài của hơn 350 bp và một GCnội dung của 32%. Vụ nổ phân tích 7 MLST alen (http://www.MLST.net/)(25) andsparepeat mô hình liên kết (Ridom SpaServer;www.spaserver.ridom.de) khẳng định rằng cả hai chủng là tự loại 8 (ST8) andspat008 (33).Để xác định tài liệu tham khảo tốt nhất, các dữ liệu 454remapped chống lại các bộ gen đã hoàn thành hai dễ bị tiêm chủng USA300, TCH1516 (NC_010079) và FPR3757(NC_007793) (21, 35). Các trình tự dữ liệu cho A1-VSSA vàA2-VISA (các chủng thử nghiệm) bao phủ toàn bộ bộ gen củacả hai USA300 tham khảo trình tự (bình quân toàn bộ gen nucleotide vùng phủ sóng của 14 và 13, tương ứng). Cả hai thử nghiệmchủng chứa các chuỗi toàn bộ một plasmid hai từTCH1516 (pUSA01HOU và pUSA300HOUMR) (35, 44). Xác định trình tự bảo hiểm cho plasmid nhỏ hơn là giữa 200 và1.000, trong khi plasmid lớn hơn đã được che phủ khoảng 90 A1-VSSA và 200 cho thị thực A2.Đã có ít nhất 70 giả định SNPs và một trong những indel rằng VSSA A1 và A2-VISA chia sẻ chung so với căng thẳng hoặc là tài liệu tham khảo. Bởi vì chúng tôi giống nhiều hơn có liên quan đến TCH1516,gen này được sử dụng như là sự căng thẳng tài liệu tham khảo tiếp tục phân tích so sánh. Hoàn thành danh sách các biến thể được phát hiện ở các chủng thử nghiệm và TCH1516 được liệt kê trong bảng S1 trong các tài liệu bổ sung. Ngoài ra, chúng tôi ghi nhận rằng hai cụ thểkhu vực là khác nhau trong thử nghiệm căng thẳng và căng thẳngTCH1516. Đầu tiên, một khu vực khoảng 600-bp của nhiễm sắc thể chồng chéo hai song song lipoprotein (USA300HOU_0109và USA300HOU_0110) đã mất tích trong cả hai thử nghiệmchủng. Thứ hai, một giả định DNA RNA vùng chú thích như

Kết quả (Việt) 2:

KẾT QUẢ
Tổng-shotgun sequencing của hai USA300 lâm sàng
chủng tiết lộ nhiều chèn và xóa các đột biến phát sinh trong quá trình chuyển đổi từ VSSA để VISA.Hageman et al. mô tả một chủng USA300 MRSA đã phát triển kháng trung gian với vancomycin và nonsusceptibility để daptomycin trong một
bệnh nhân với viêm nội tâm mạc sau khi tiếp xúc với cả hai loại thuốc kháng sinh (32).
Các chủng phân lập được thu thập theo trình tự, trưng bày mô hình nhạy cảm kháng sinh khác nhau, và được gõ là USA300 bởi
trường xung gel điện (PFGE). Chúng tôi thu được hai trong số các
mẫu phân lập, designatedS. aureusA1-VSSA ands. aureusA2-VISA, cho
phân tích di truyền. Sự căng thẳng đầu tiên được phân lập từ bệnh nhân, A1-VSSA, là nhạy cảm với vancomycin, daptomycin, và linezolid,
trong khi căng thẳng sau đó bị cô lập, A2-VISA, là trung gian kháng vancomycin, không dễ bị daptomycin, và
đề kháng với linezolid được đo bằng loãng tham khảo nước dùng (Bảng 1). Ngoài ra, A1-VSSA là beta-lactamase dương
và A2-VISA là beta-lactamase âm của cefinase? Phát hiện -lactamase đĩa khảo nghiệm. Các kiểu hình vancomycin của cả hai
chủng này được xác nhận bởi PAP-AUC (Hình. 1). A2-VISA đã có một
tỷ lệ AUC 0,92 đến Mu50, VISA nguyên mẫu, chỉ ra các
kiểu hình VISA đầy đủ và không heteroresistance (tỷ lệ AUC của
cô lập để hVISA căng MU3 của? 0,90) đã được quan sát thấy ở A1-VSSA
(Hình. 1).
A1-VSSA và A2-VISA đã được lập trình tự bằng cách sử dụng Roche / 454
cụ Junior và các dữ liệu thô được cắt tỉa để loại bỏ các
thiết bị đầu cuối 30 nucleotide từ cả 5 = 3 = kết thúc, chất lượng thấp
và nucleotide mơ hồ, và bất kỳ lần đọc dưới 250 nucleotide
Dài. Kích thước đọc trung bình được sử dụng trong phân tích cho từng dòng là
? 400 nt.De novoassembly mang lại 77 và 113 contigs cho A1-VSSA và A2-VISA, tương ứng, bao gồm hơn 40 triệu
tổng số các căn cứ, với độ dài đọc trung bình của hơn 350 bp và một GC
nội dung của 32%. Phân tích BLAST của 7 alen MLST (http: // www
.mlst.net /) (25) andsparepeat chỉnh mô hình (Ridom SpaServer;
www.spaserver.ridom.de) khẳng định rằng cả hai mẫu phân lập đều tự loại 8 (ST8) andspat008 ( 33).
để xác định các tài liệu tham khảo tốt nhất, các dữ liệu 454 đã được
ánh xạ với bộ gen hoàn thành hai chủng USA300 vancomycin mẫn cảm, TCH1516 (NC_010079) và FPR3757
(NC_007793) (21, 35). Các dữ liệu trình tự cho A1-VSSA và
A2-VISA (chủng thử nghiệm) bao phủ toàn bộ hệ gen của
cả hai trình tự tham khảo USA300 (bảo hiểm nucleotide genome trung bình của 14? Và 13 ?, tương ứng). Cả hai thí nghiệm
chủng chứa toàn bộ trình tự của hai plasmid từ
TCH1516 (pUSA01HOU và pUSA300HOUMR) (35, 44). Bảo trình tự cho các plasmid nhỏ hơn là giữa 200 và
1000 ?, trong khi các plasmid lớn được bao phủ khoảng 90? Cho A1-VSSA và 200? Cho A2-VISA.
Có ít nhất 70 SNPs protein và một indel mà A1-VSSA và A2-VISA chia sẻ chung so với hoặc căng thẳng tài liệu tham khảo. Bởi vì chủng của chúng tôi là có liên quan đến TCH1516,
gen này đã được sử dụng như là sự căng thẳng tài liệu tham khảo để phân tích so sánh thêm. Danh sách đầy đủ của các biến thể được phát hiện ở các chủng thử nghiệm và TCH1516 được liệt kê trong Bảng S1 trong vật liệu bổ sung. Ngoài ra, chúng tôi nhận thấy hai đặc biệt là
các khu vực là khác nhau ở các chủng thử nghiệm và căng
TCH1516. Đầu tiên, một khu vực khoảng 600 bp của nhiễm sắc thể chồng chéo hai lipoprotein song song (USA300HOU_0109
và USA300HOU_0110) đã mất tích trong cả thực nghiệm
chủng. Thứ hai, một vùng RNA không mã hoá giả định như chú thích