DNA extraction using freeze & thaw

DNA extraction using freeze & thaw method was conducted by placing of 1 mL of each concentrated water sample within 1.5 mL micro tubes and alternating application of freezing the samples in liquid nitrogen and their incubation in water bath in a temperature of 100°C for three or more times. The suspension was then centrifuged again (18000 g, 10 min) and the supernatant was transferred to new micro tubes. Another manual DNA extraction method of phenol-chloroform was done according to Sambrook standard methods [3].
Extracted DNA was stored at -20°C until using PCR. Amplification reactions were preformed according to what has been described earlier by Hsu [14]. The PCR primers LEG 225 (5'-AAGATTAGCCTGCGTCCGAT-3') and LEG 858 (5'-GTCAACTTATCGCGTTTGCT-3') were used to amplify a 650 bp fragment of the 16S rRNA gene of Legionella species. Each 25 μL of reaction contained 20 ng genomic DNA, 1.5 mM MgCl2 (Roche, Germany), 0.2 mM dNTP (Roche, Germany), 20 pM of each primer, and 1u of Tag DNA polymerase (Roche, Germany) in the PCR buffer (Roche, Germany). The cycling conditions were 94ºC for 5 min, followed by 30 cycles at 95ºC (30 sec), 64ºC and 74ºC for 20 sec each, and 1 cycle of 72ºC for 5 min in Thermocycler (Techne, USA). PCR products were loaded onto a 2% agarose gel containing ethidium bromide. Extracted DNA from cultured Legionella was used for positive control. For more confirmation, the PCR products of two Legionella isolates were sequenced at MWG (Ebersberg, Germany; http:// www.mwg-biotech.com).

Kết quả (Việt) 1:

DNA khai thác sử dụng đóng băng và tan băng phương pháp được tiến hành bằng cách đặt 1 ml mỗi mẫu nước tập trung trong 1.5 mL vi ống và xen kẽ các ứng dụng của đóng băng các mẫu trong nitơ lỏng và ấp trứng của họ trong nước tắm trong một nhiệt độ 100° c cho ba hay nhiều lần. Hệ thống treo được sau đó ly một lần nữa (18000 g, 10 phút) và supernatant được chuyển sang mới vi ống. Một hướng dẫn sử dụng ADN phương pháp khai thác của phenol-cloroform đã được thực hiện theo phương pháp tiêu chuẩn Sambrook [3].Chiết xuất DNA đã được lưu trữ tại-20 ° C cho đến khi sử dụng Đảng Cộng sản Romania. Khuếch đại phản ứng được preformed theo những gì đã được mô tả trước đó bởi Hsu [14]. Lớp lót PCR chân 225 (5'-AAGATTAGCCTGCGTCCGAT-3') và chân 858 (5'-GTCAACTTATCGCGTTTGCT-3') được sử dụng để khuyếch đại một mảnh bp 650 của 16S rRNA gene Legionella loài. Mỗi μL 25 của phản ứng có 20 của gen DNA, 1.5 mM MgCl2 (Roche, Đức), cách 0.2 mM dNTP (Roche, Đức), 20 pM mỗi mồi và 1u của thẻ DNA polymerase (Roche, Đức) trong vùng đệm Đảng Cộng sản Romania (Roche, Đức). Các điều kiện đi xe đạp đã là 94ºC cho 5 phút, sau đó là các chu kỳ 30 tại 95ºC (30 giây), 64ºC và 74ºC cho chu kỳ mỗi 20 giây, và 1 của 72ºC cho 5 phút trong Thermocycler (Techne, Hoa Kỳ). Đảng Cộng sản Romania sản phẩm đã được tải lên một gel 2% agarose có ethidium bromua. Chiết xuất DNA từ văn hóa Legionella được sử dụng để kiểm soát tích cực. Thêm xác nhận, sản phẩm PCR của hai Legionella chủng được trình tự tại MWG (Ebersberg, Đức; http:// www.mwg-biotech.com).

Kết quả (Việt) 2:

Chiết DNA bằng phương pháp đông lạnh và rã đông được tiến hành bằng cách đặt 1 ml của mỗi mẫu nước tập trung trong vòng 1,5 mL ống vi và ứng dụng đóng băng các mẫu trong nitơ lỏng và ủ mình trong bồn tắm nước ở nhiệt độ 100 ° C trong ba hoặc xen kẽ nhiều lần. Hệ thống treo sau đó được ly tâm một lần nữa (18000 g, 10 phút) và nổi trên mặt đã được chuyển giao cho các ống vi mới. Một phương pháp tách chiết DNA của nhãn hiệu của phenol-chloroform đã được thực hiện theo phương pháp chuẩn Sambrook [3].
Trích yếu DNA đã được lưu trữ ở -20 ° C cho đến khi sử dụng PCR. Phản ứng khuếch đại được hình thành trước theo những gì đã được mô tả trước đó của Hsu [14]. Các PCR mồi LEG 225 (5'-AAGATTAGCCTGCGTCCGAT-3 ') và LEG 858 (5'-GTCAACTTATCGCGTTTGCT-3') được sử dụng để khuếch đại một đoạn 650 bp của gen 16S rRNA của loài Legionella. Mỗi 25ul phản ứng chứa 20 DNA ng gen, 1,5 mM MgCl2 (Roche, Đức), 0,2 mM dNTP (Roche, Đức), 20 giờ tối mỗi mồi, và 1u polymerase Tag DNA (Roche, Đức) trong đệm PCR (Roche, Đức). Các điều kiện đi xe đạp là 94ºC trong 5 phút, tiếp theo là 30 chu kỳ tại 95ºC (30 giây), 64ºC và 74ºC trong 20 giây mỗi, và 1 chu kỳ của 72ºC 5 phút trong Thermocycler (TECHNE, USA). Sản phẩm PCR được nạp vào một gel agarose 2% có chứa ethidium bromide. DNA chiết xuất từ Legionella nuôi đã được sử dụng để kiểm soát tích cực. Để xác nhận nhiều hơn, các sản phẩm PCR của hai chủng Legionella được tự tại MWG (Ebersberg, Đức; http: // www.mwg-biotech.com).