12.3.3.2 Cytokine Production and Pr

12.3.3.2 Cytokine Production and Proliferation
Activated and differentiated cells will produce a characteristic cytokine production
profile. T-cells of allergic individuals will typically produce IL-4, IL-5 and IL-13,
which are signature Th2 type cytokines. Cytokine production can be measured in
several ways. Most often the cytokine production is measured in the supernatant
of the cultured cells. Cytokine enzyme-linked immunoabsorbent assay (ELISA) or
flow cytometric techniques like the multiplexed bead assay (Cytometric Bead
Array Flex sets, BD Biosciences) are commonly used to detect cytokines from cell
supernatant or serum. Real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR)
technique can be implemented to assess mRNA expression of the cytokines in
T-cell fractions. However, these methods do not allow for determining which
proportion of the cells is responsible for the production of specific cytokines.
Multiple staining using combinations of cell surface markers and staining for
intracellular cytokines permit the assessment which type of cell produces what
cytokines. This approach can give valuable extra information at the single-cell
level. Optimizing experiments by assessing the optimal stimulation period for
different cytokines is important as each stimulus results in different kinetics and
these kinetics are crucially different for the individual cytokines. For example, in a
study of Jeurink et al. (2008) monocyte derived cytokines such as TNF- and
IL-1 were present in cell cultures already after 1 day of culture and amounts
decreased significantly over time, while T-cell derived cytokines such as IL-5,
IL-13 and IFN- showed a slower kinetics and were highest on day 7 of the
culture.
This optimization is also important when measuring proliferation of cells.
Proliferation of PBMC can be measured using different methods, such as
incorporation of 3H-thymidine, staining with Ki-67 antibodies, loading with BrdU
(5-bromo-2-deoxyuridine), and CFSE (carboxyfluorescein diacetate succinimidyl
ester) staining, each provide slightly different information. The 3H-thymidine and
BrdU methods determines the S phase of the cell cycle activity by measuring the
thymidine incorporation into newly synthesized DNA of replicating cells. The
Ki-67 antigen however, is expressed in all active stages of the cell cycle (all
phases except the G0 phase) and cells which are still in the G1 phase of the cell
cycle will be detected by a Ki-67 staining and not by a 3H-thymidine incorporation
assay or a BrdU assay. Upon cell division, the CFSE is covalently bound to free
amine groups of intracellular macromolecules in the cell, and is distributed
uniformly between daughter cells. CFSE staining can be the method of choice
especially when the rate of the divisions of the cells is studied and when working
with a uniformly sized cell population (such as resting T-or B-lymphocytes).
However, hPBMC consists of a non-homogeneous population of cells (not
uniformly sized and therefore not uniformly stained) which can make it difficult to
differentiate between undivided and divided cells. As a result, this could decrease
the sensitivity of the test. Furthermore, care should be taken when using CFSE
because of its toxicity for dividing cells and effect on the expression of activation
markers like CD69 and CD25. A disadvantage of 3H-thymidine incorporation is that it does not allow identification of the phenotype of the proliferating cells, as it
can only measure bulk cell divisions, a limitation overcome by flow cytometry
(Ki-67 and CFSE staining), which enables analysis at a single-cell level. The use
of selected CD markers in the same staining will make it possible to specify the
phenotype of proliferating cells. It is difficult to directly compare the methods as
they use different techniques (flowcytometry using fluorochromes versus
scintillation using radio-activity) and furthermore, they also give different types of
information. Therefore, it is advisable to use the same method in all experiments
to be able to compare results.

Kết quả (Việt) 1:

12.3.3.2 Cytokine sản xuất và phát triểnKích hoạt và phân biệt các tế bào sẽ sản xuất một sản xuất đặc trưng cytokineHồ sơ. Tế bào T của dị ứng cá nhân thường sẽ sản xuất IL-4, IL-5 và IL-13,đó là chữ ký Th2 loại phân bào. Cytokine sản xuất có thể được đo bằngmột số cách. Thường xuyên nhất sản xuất cytokine được đo bằng supernatantcủa các tế bào văn hóa. Khảo nghiệm liên kết với enzyme immunoabsorbent cytokine (ELISA) hoặcdòng chảy cytometric kỹ thuật như khảo nghiệm multiplexed hạt (Cytometric hạtMảng Flex bộ, BD Biosciences) thường được sử dụng để phát hiện các phân bào từ di độngsupernatant hoặc huyết thanh. Phản ứng chuỗi polymerase định lượng thời gian thực (RT-qPCR)kỹ thuật có thể được thực hiện để đánh giá mRNA biểu hiện của phân bào trongPhần phân đoạn của tế bào T. Tuy nhiên, những phương pháp này không cho phép cho việc xác định đótỷ lệ của các tế bào chịu trách nhiệm về sản xuất cụ thể phân bào.Nhiều staining bằng cách sử dụng các kết hợp của các dấu hiệu trên bề mặt tế bào và nhuộm chonội bào phân bào cho phép đánh giá loại tế bào sản xuất những gìphân bào. Cách tiếp cận này có thể cung cấp cho thông tin có giá trị đơn bàocấp độ. Các thử nghiệm tối ưu hóa bằng cách đánh giá thời gian kích thích tối ưu chokhác nhau phân bào là quan trọng như kích thích mỗi kết quả trong động học khác nhau vàđộng học là quan trọng trong khác nhau cho cá nhân phân bào. Ví dụ, trong mộtCác nghiên cứu của Jeurink et al. (2008) monocyte bắt nguồn phân bào như TNF - vàIL-1 were present in cell cultures already after 1 day of culture and amountsdecreased significantly over time, while T-cell derived cytokines such as IL-5,IL-13 and IFN- showed a slower kinetics and were highest on day 7 of theculture.This optimization is also important when measuring proliferation of cells.Proliferation of PBMC can be measured using different methods, such asincorporation of 3H-thymidine, staining with Ki-67 antibodies, loading with BrdU(5-bromo-2-deoxyuridine), and CFSE (carboxyfluorescein diacetate succinimidylester) staining, each provide slightly different information. The 3H-thymidine andBrdU methods determines the S phase of the cell cycle activity by measuring thethymidine incorporation into newly synthesized DNA of replicating cells. TheKi-67 antigen however, is expressed in all active stages of the cell cycle (allphases except the G0 phase) and cells which are still in the G1 phase of the cellcycle will be detected by a Ki-67 staining and not by a 3H-thymidine incorporationassay or a BrdU assay. Upon cell division, the CFSE is covalently bound to freeamine groups of intracellular macromolecules in the cell, and is distributeduniformly between daughter cells. CFSE staining can be the method of choiceespecially when the rate of the divisions of the cells is studied and when workingwith a uniformly sized cell population (such as resting T-or B-lymphocytes).However, hPBMC consists of a non-homogeneous population of cells (notuniformly sized and therefore not uniformly stained) which can make it difficult todifferentiate between undivided and divided cells. As a result, this could decreasethe sensitivity of the test. Furthermore, care should be taken when using CFSEbecause of its toxicity for dividing cells and effect on the expression of activationmarkers like CD69 and CD25. A disadvantage of 3H-thymidine incorporation is that it does not allow identification of the phenotype of the proliferating cells, as itcan only measure bulk cell divisions, a limitation overcome by flow cytometry(Ki-67 and CFSE staining), which enables analysis at a single-cell level. The useof selected CD markers in the same staining will make it possible to specify thephenotype of proliferating cells. It is difficult to directly compare the methods asthey use different techniques (flowcytometry using fluorochromes versusscintillation using radio-activity) and furthermore, they also give different types ofinformation. Therefore, it is advisable to use the same method in all experimentsto be able to compare results.

Kết quả (Việt) 2:

12.3.3.2 Cytokine sản xuất và phổ biến vũ khí
hoạt tính và các tế bào biệt hóa sẽ sản xuất một sản xuất cytokine đặc
profile. T-tế bào của cá nhân dị ứng thường sẽ sản xuất IL-4, IL-5 và IL-13,
đó là chữ ký Th2 loại cytokine. Sản xuất cytokine có thể được đo bằng
nhiều cách. Thông thường sản xuất cytokine được đo bằng phần nổi
của các tế bào nuôi cấy. Cytokine liên kết enzyme immunoabsorbent khảo nghiệm (ELISA) hoặc
chảy kỹ thuật cytometric như hạt khảo nghiệm ghép (Cytometric Bead
Mảng Flex bộ, BD Biosciences) thường được sử dụng để phát hiện các cytokine từ tế bào
bề hoặc huyết thanh. Real-time PCR định lượng (RT-qPCR)
kỹ thuật có thể được thực hiện để đánh giá biểu hiện mRNA của các cytokine trong
các phần phân đoạn T-cell. Tuy nhiên, những phương pháp này không cho phép để xác định mà
tỷ lệ các tế bào chịu trách nhiệm sản xuất các cytokine cụ thể.
Nhiều nhuộm sử dụng sự kết hợp của các dấu hiệu bề mặt tế bào và nhuộm màu cho
các cytokine trong tế bào cho phép đánh giá những loại tế bào sản xuất ra những gì
các cytokine. Cách tiếp cận này có thể cung cấp thêm thông tin có giá trị tại các tế bào đơn
cấp. Tối ưu hóa các thí nghiệm bằng cách đánh giá giai đoạn kích thích tối ưu cho
các cytokine khác nhau là rất quan trọng vì mỗi kết quả kích thích trong động học khác nhau và
những động học là một điều quan trọng khác nhau cho các cytokine cá nhân. Ví dụ, trong một
nghiên cứu của Jeurink et al. (2008) monocyte có nguồn gốc cytokines như TNF-? và
IL-1? đã có mặt trong nuôi cấy tế bào đã sau 1 ngày của nền văn hóa và các khoản
giảm đáng kể theo thời gian, trong khi T-tế bào chiết tách các cytokine như IL-5,
IL-13 và IFN-? cho thấy một động học chậm hơn và cao nhất vào ngày thứ 7 của các
nền văn hóa.
tối ưu hóa này cũng rất quan trọng khi đo sự tăng sinh của các tế bào.
Phổ biến PBMC có thể được đo bằng cách sử dụng phương pháp khác nhau, chẳng hạn như
kết hợp của 3H-thymidine, nhuộm bằng Ki-67 kháng thể, tải với BrdU
(5-bromo-2? -deoxyuridine), và CFSE (carboxyfluorescein diacetate succinimidyl
ester) nhuộm, mỗi cung cấp thông tin hơi khác nhau. The 3H-thymidine và
phương pháp xác định BrdU pha S của chu kỳ tế bào hoạt động bằng cách đo lường
kết hợp thymidine vào DNA mới tổng hợp của các tế bào sao chép. Các
Ki-67 kháng nguyên tuy nhiên, được thể hiện trong tất cả các giai đoạn hoạt động của chu kỳ tế bào (tất cả
các giai đoạn, ngoại trừ giai đoạn G0) và các tế bào vẫn còn đang trong giai đoạn G1 của tế bào
chu kỳ sẽ được phát hiện bởi một nhuộm Ki-67 và không phải bởi một 3H-thymidine kết hợp
khảo nghiệm hoặc một khảo nghiệm BrdU. Sau khi phân chia tế bào, các CFSE được đồng hóa trị ràng buộc để giải phóng
các nhóm amin của các đại phân tử trong tế bào trong các tế bào, và được phân phối
đồng đều giữa các tế bào con. CFSE nhuộm có thể là phương pháp tốt
nhất là khi tỷ của các phòng ban của các tế bào được nghiên cứu và khi làm việc
với một quần thể tế bào có kích thước thống nhất (ví dụ như nghỉ ngơi T-hoặc B-lymphocytes).
Tuy nhiên, hPBMC bao gồm một không đồng nhất dân số của các tế bào (không
thống nhất kích thước và do đó không thống nhất màu) mà có thể làm cho nó khó khăn để
phân biệt giữa các tế bào không phân chia và phân chia. Kết quả là, điều này có thể làm giảm
độ nhạy của thử nghiệm. Hơn nữa, cần phải cẩn thận khi sử dụng CFSE
vì độc tính của nó để phân chia tế bào và ảnh hưởng đến sự biểu hiện của hoạt
dấu như CD69 và CD25. Một bất lợi của 3H-thymidine thành lập công ty là nó không cho phép xác định các kiểu hình của các tế bào sinh sản, vì nó
chỉ có thể đo phân chia tế bào số lượng lớn, vượt qua một giới hạn bởi dòng cytometry
(Ki-67 và CFSE nhuộm màu), trong đó cho phép phân tích tại một mức độ đơn bào. Việc sử dụng
các mốc CD chọn trong nhuộm cùng sẽ làm cho nó có thể để xác định các
kiểu hình của các tế bào sinh sản. Thật khó để so sánh trực tiếp các phương pháp như
họ sử dụng các kỹ thuật khác nhau (flowcytometry sử dụng fluorochromes so với
nhấp nháy sử dụng sóng vô tuyến hoạt động) và hơn nữa, họ cũng cung cấp các loại khác nhau của
thông tin. Do đó, nó được khuyến khích để sử dụng cùng một phương pháp trong tất cả các thí nghiệm
để có thể so sánh kết quả.