3.1.4 Procedure: Phenol: Chloroform

3.1.4 Procedure:

Phenol: Chloroform method can be used for DNA extraction as per the

protocol of Sambrook and Russel (2001). The tissue samples (0.2-1 g) are cut into

very small (

Kết quả (Việt) 1:

3.1.4 thủ tục: Phenol: Cloroform phương pháp có thể được sử dụng cho DNA khai thác theo các giao thức của Sambrook và Russel (2001). Mẫu mô (0.2-1 g) được cắt thành rất nhỏ (< 1 mm) miếng hoặc nghiền trong nitơ lỏng và 10 khối lượng (w/v) DNA lysis đệm (pH 8) chứa Ribonuclease-A @ 100 μg/ml (20 μg/ml) là DỰ THẢOThêm và ủ tại 37° C cho 1 h. Sau đó, đã giải pháp proteinase K (20 mg/ml) Thêm @ 200 μg/ml và một lần nữa ủ lúc 50° C cho không ít hơn 3 h hoặc qua đêm. Trong thời gian ấp trứng, thường xuyên xoáy của các ống được thực hiện nhẹ nhàng từ thời gian để thời gian. Bình đẳng vol. bão hòa Tris phenol (equilibrated với 0,1 M Tris-Cl, pH 8,0) được thêm vào và nội dung của các ống là đối tượng để trộn kết thúc để kết thúc cho 10 tối thiểu và nội dung được sau đó ly tại 6.500 vòng/phút trong 15 phút. Phía trên dung dịch nước pha tập hợp lại thành một ống tươi và các khối lượng bằng nhau của phenol: clorofom: hỗn hợp isoamylalcohol (25:24:1) được thêm vào và ly. Phía trên lớp là thu thập và một lần nữa bằng khối lượng phenol: cloroform: isoamylalcohol (25:24:1) được thêm vào và ly. Cuối cùng, dung dịch nước pha trên được thu thập trong một tươi ống và các khối lượng bằng nhau của cloroform được thêm vào và sau đó ly. Các giai đoạn trên một lần nữa được thu thập trong một ống tươi có cách 0.2 khối lượng 10 M amoni axetat và 2 tập ethanol tuyệt đối và hỗn hợp tốt cho mưa của DNA. Hỗn hợp có hiển thị các chủ đề của DNA ly tại (10.000 vòng/phút cho 10 phút). Miếng DNA được rửa sạch hai lần với 70% rượu bằng số (10.000 vòng/phút cho mỗi 5 phút), khô trong một tắm khô ở 60° C và sau đó giải thể trong 1 X TE (Tris-EDTA) đệm (50-100 μl) hoặc nuclease miễn phí nước một trong hai. Các mẫu DNA được sử dụng cho Đảng Cộng sản Romania hoặc được lưu trữ tại-20 ° C cho đến khi tiếp tục sử dụng.

Kết quả (Việt) 2:

3.1.4 Thủ tục: Phenol: phương pháp Chloroform có thể được sử dụng để tách chiết DNA theo giao thức của Sambrook và Russel (2001). Các mẫu mô (0,2-1 g) được cắt thành rất nhỏ (<1 mm) mảnh hoặc nghiền thành bột trong nitơ lỏng và 10 tập (w / v) của bộ đệm lysis DNA (pH 8) có chứa ribonuclease-A @ 100 microgam / ml (20 mg / ml) là DỰ THẢO thêm vào và ủ ở 37 ° C trong 1 giờ. Sau đó, proteinase-K giải pháp (20 mg / ml) được thêm vào @ 200 mg / ml và một lần nữa ủ ở 50 ° C cho không ít hơn 3 giờ hoặc qua đêm. Trong thời gian ủ, xoáy thường xuyên của các ống được thực hiện nhẹ nhàng theo thời gian . Vol bằng nhau. của phenol Tris-bão hòa (cân bằng với 0,1 M Tris-Cl, pH 8,0) là gia tăng và nội dung của các ống này bị trộn cuối để kết thúc trong 10 phút. và các nội dung sau đó được ly tâm ở 6500 RPM trong 15 phút. Các thượng pha nước được thu vào ống tươi và khối lượng bằng nhau của phenol: chloroform: isoamylalcohol (25: 24: 1) Hỗn hợp được thêm vào và ly tâm. Phía trên layer được thu thập và khối lượng lại tương đương của phenol: chloroform: isoamylalcohol (25: 24: 1) được thêm vào và ly tâm. Cuối cùng, giai đoạn dịch trên được thu thập trong một ống tươi và khối lượng bằng nhau của chloroform đã được bổ sung và sau đó ly tâm. Các giai đoạn trên được thu thập lại trong một ống tươi chứa 0,2 khối lượng của 10 M ammonium acetate và 2 khối lượng ethanol tuyệt đối và được trộn đều cho kết tủa DNA. Hỗn hợp có chứa chủ đề DNA có thể nhìn thấy được ly tâm ở (10.000 RPM cho 10 phút). Các viên DNA được rửa sạch hai lần với 70% rượu bằng ly tâm (10.000 RPM cho 5 phút mỗi lần), sấy khô trên một tắm khô ở 60 ° C và sau đó hòa tan trong 1X TE (Tris-EDTA) đệm (50- 100 ml) hoặc nuclease nước tự do hoặc. Những mẫu DNA được sử dụng cho PCR hoặc được lưu trữ ở -20 ° C cho đến khi sử dụng tiếp.