SSCP is the simplest and most used

SSCP is the simplest and most used method of mutation detection. PCR is used to amplify the region of interest and the resultant DNA is separated as single-stranded molecules by electrophoresis in a non-denaturing polyacrylamide gel (Orita et al, 1989). A strand of single-stranded DNA folds differently from another if it differs by a single base, and it is believed that mutation-induced changes of tertiary structure of the DNA results in different mobilities for the two strands. These mutations are detected as the appearance of new bands on autoradiograms (radioactive detection), by silver staining of bands or the use of fluorescent PCR primers which are subsequently detected by an automated DNA sequencer (non-radioactive detection).

The tertiary structure of single stranded DNA changes under different physical conditions e.g. temperature and ionic environment. Hence the sensitivity of SSCP depends on these (and many other) conditions (see below). Whilst some empirical rules have emerged for the choice of separation conditions for sequence variants in particular sequence contexts, it is not possible to predict whether a certain mutation can be detected under given conditions, especially when the mutation is in a new sequence context. Mutation detection for PCR-SSCP is generally high, >80% in a single run for fragments shorter than 300bp (Hayashi and Yandell, 1993). As sensitivity is not 100%, the absence of a new band does not prove that there is no mutation in the analysed molecule.

The sensitivity of PCR-SSCP decreases with increasing fragment length, 300bp and whole cDNAs) overlapping short primer sets can be used, or long PCR products digested with appropriate restriction enzymes prior to SSCP (however, reamplification of individual new bands with the original primer set is now no longer possible).



Advantages

SSCP screening has two primary advantages as a mutation-screening technique:

You can screen for mutations in a specified DNA region by choosing PCR primers that span that region.
You can screen a large number of samples because the technique is simple and fast.
The only step necessary after PCR amplification is a heat denaturation in formamide and NaOH.



Limitations

SSCP screening only tells you that a mutation exists. You must perform subsequent DNA sequencing to determine the nature of the mutation that caused an electrophoretic mobility shift in a given sample.

Moreover, not all point mutations in a given sequence will cause a detectable change in electrophoretic mobility. However, by optimizing PCR reactions and run conditions before attempting a large-scale screening you can increase the sensitivity.

Variations and modifications of SSCP:

Multiple gel running conditions
temperature (~ room temperature, ~ 4oC)
addition of additives e.g. glycerol (5-10%); sucrose (10%)
Different gel matrices
Low polyacrylamide cross linker ratios (49:1 acrylamide: bis-acrylamide) (5-10% gels)
MDE, GeneAmp, Hydrolink gels
Agarose gels (resolution of minisatellite isoalleles (same length , but a few base pair substitutions within the minisatellite repeat) as long as 6.3kb; Monkton and Jeffreys, 1995).
High throughput SSCP: use of sharkstooth combs, multichannel pipettes, microtitre plates, staggered repetitive loadings on two gels poured between three plates resulted in 1000 PCR reactions prepared and analysed in 24 man hours using five 40cm x 30cm gel tanks. Used for the analysis of exon 3 of the LDLR in patients with familial hypercholesterolaemia (Whittall et al, 1995).
rSSCP: RNA-SSCP: single stranded RNA should have a larger repertoire of secondary structure, since RNA basepairing is more stable than RNA-DNA basepairing, and might be expected to adopt more conformational structure and hence be more sensitive to sequence changes. Efficiency of detection: 70% for rSSCP in comparison to 35% for SSCP (for 2.6kb of Factor IX gene). However, it is more inconvenient to make RNA strands (involving introducing RNA polymerase promoters etc.) and although the abundance of transcript allows for ethidium bromide detection of the rSSCPs, the added complexity and expense has precluded widespread use (Sarkar et al, 1992a).
REF-SSCP: Restriction endonuclease fingerprinting. A modification of SSCP where a 1-kb segment is digested with 5 restriction enzymes designed to produce fragments of ~150bp (Factor IX gene). After digestion the products are mixed, end-labelled with 32P, denatured and electrophoresed under non-denaturing conditions. Two 'components' are evident; the gain or loss of restriction site 'informative restriction component' or abnormal mobility of the 5 restriction fragments (10 strands) called the 'SSCP component'. Efficiency of detection: 96% detection (5.6%polyacrylamide/23oC) or 100% (7.5%GeneAmp/23oC or 8oC) of 24 test mutations (Liu and Sommer, 1995).





Microsatellites

Introduction to Microsatellite Analysis



What is Microsatellite Analysis?



Microsatellite loci are PCR amplified and the PCR products are then analyzed by electrophoresis to separate the alleles according to size. PCR-amplified microsatellite alleles can be detected using various methods, such as fluorescent dye labeling, silver staining, or fluorescent dye staining.



Background

The number of repeat units at a microsatellite locus may differ, so alleles of many different lengths are possible. Microsatellite loci occur throughout the genome of most organisms and therefore have been used as markers to establish linkage groups in crosses and to map genetically identified mutations to chromosomal positions.
If allele frequencies are known, highly polymorphic microsatellite loci are very useful for identifying individuals in a population and for determining the probability that two individuals are related. In addition, the even distribution of microsatellites in the genome makes them good markers for constructing genetic maps.

The lengths of microsatellite sequences tend to be highly variable among individuals due to relatively high mutation rates. When the DNA is replicated in meiosis the DNA polymerase enzyme can slip forward or backwards on the repeat units, deleting or adding repeat units to the daughter strand. This means that daughter strands may have slightly fewer or slightly more repeat units than the parent strand.

Geneticists can measure the number of repeat units for a given microsatellite. If several microsatellites are measured on an individual this results in a unique genetic fingerprint.

Microsatellite profiles can be used in many biological applications including:

To identify unique individuals in a population: people, animals or plants
In forensic science, to compare suspects to crime scene stains
To determine the paternity or maternity of individuals
To estimate population size for wild populations
To determine if populations have suffered genetic bottlenecks
For phylogenetic studies in applications involving very closely related subspecies
For genetic mapping
To determine if there is population subdivision (ie local inbreeding) in wild populations
Forensic applications

Each microsatellite gives a small bit of information about an individual but alone cannot identify the individual uniquely. In order to establish unique identity a number of microsatellites must be used on the same tissue and the information from a number of these combined to identify someone at the individual level. For forensic purposes it is possible in principle to exclude two individuals from being a match regardless of how closely they are related by the mismatch of alleles at any locus however it is never possible say two individuals are identical beyond some statistical probability.

Pedigree determination

For the determination of pedigree information it is possible to match individual offspring to a set of parents assuming genetic information exists for the putative parents and to use this plus other information such as growth performance to determine optimum breeding strategies. This is valuable in cases where physical identification of the parents and offspring are not feasible such as the case with intensive aquaculture. If sufficient numbers of offspring are available even in a mixed group it is possible with a very high degree of certainty to reconstruct parent genotypes solely from the genotype information obtained from the offspring. This can be used to indirectly determine the size of a breeding population in cases where breeding strategies of the species in question is unknown or the parents are not available or readily identifiable.

Comparison of wild populations

For population discrimination rather than looking at individuals allele frequencies, or some other measure of genotypic frequency in one population are compared to the same measures in a second population, again it is a case that rarely a single locus will discriminate clearly between the populations in question but rather they are separated by combining the information from several loci.

In cases where there is either geographic or reproductive isolation of populations it is in some cases possible to visually distinguish two populations as is the case above, the left panel is an inshore population of cod the right panel an offshore population. The dominance of one or two allele types in the left panel shows a clear distinction between the two groups.

Assay of microsatellites

The assay of microsatellite is carried out by polymerase chain reaction (PCR) amplification of a specific microsatellite as defined by the unique primers for the microsatellite. Each microsatellite represents only a tiny portion of the whole genome and as such cannot practically be directly isolated and measured. The use of targeted PCR primers based on the unique sequences around the microsatellite makes it possible to amplify the target microsatellite millions of times and to produce sufficient co

Kết quả (Việt) 1:

SSCP là đơn giản nhất và hầu hết sử dụng các phương pháp phát hiện đột biến. Đảng Cộng sản Romania được sử dụng để khuyếch đại vùng ưa thích và kết quả DNA tách ra thành phân tử đơn-stranded bởi điện trong một phòng không biến tính polyacrylamide gel (Orita và ctv., 1989). Một chuỗi đơn-stranded DNA nếp gấp một cách khác nhau từ khác nếu nó khác với bởi một cơ sở duy nhất, và người ta tin rằng đột biến gây ra những thay đổi của đại học cấu trúc của DNA kết quả trong mobilities khác nhau cho hai sợi. Những đột biến được phát hiện như sự xuất hiện của các ban nhạc mới trên autoradiograms (phát hiện phóng xạ), bởi bạc nhuộm của ban nhạc hoặc sử dụng lớp lót PCR huỳnh quang mà sau đó được phát hiện bởi một tự động DNA sequencer (phòng không phóng xạ phát hiện).Cấu trúc đại học duy nhất đang bị kẹt lại ADN thay đổi dưới điều kiện vật lý khác nhau ví dụ như nhiệt độ và ion môi trường. Do đó sự nhạy cảm của SSCP phụ thuộc vào đây (và nhiều khác) điều kiện (xem bên dưới). Trong khi một số quy tắc thực nghiệm đã nổi lên cho sự lựa chọn của ly thân điều kiện cho chuỗi Phiên bản đặc biệt bối cảnh trình tự, nó là không thể dự đoán liệu một đột biến nào đó có thể được phát hiện theo cho điều kiện, đặc biệt là khi các đột biến là trong một bối cảnh trình tự mới. Đột biến phát hiện cho Đảng Cộng sản Romania-SSCP là nói chung cao, > 80% trong một đơn chạy cho đoạn ngắn hơn 300bp (Hayashi và Yandell, 1993). Là nhạy cảm không phải là 100%, sự vắng mặt của một ban nhạc mới không chứng minh là không có đột biến trong phân tử phân tích.Độ nhạy của Đảng Cộng sản Romania-SSCP giảm theo chiều dài mảnh ngày càng tăng, < 300bp đang là tối ưu. Để phát hiện sự đột biến trong mảnh dài (exon > 300bp và toàn bộ cDNAs) chồng chéo ngắn mồi bộ có thể được sử dụng, hoặc lâu PCR sản phẩm tiêu hóa với enzyme giới hạn thích hợp trước khi SSCP (Tuy nhiên, reamplification của ban nhạc mới cá nhân với các thiết lập ban đầu của mồi bây giờ không còn có thể). Lợi thếSSCP kiểm tra có hai lợi thế chính là một kỹ thuật kiểm tra đột biến:Bạn có thể màn hình cho các đột biến trong một khu vực DNA được chỉ định bằng cách chọn lớp lót PCR khoảng khu vực đó.Bạn có thể màn hình một số lớn các mẫu vì kỹ thuật là đơn giản và nhanh chóng.Bước duy nhất cần thiết sau khi Đảng Cộng sản Romania khuếch đại là một denaturation nhiệt ở formamide và NaOH. Hạn chếSSCP chiếu chỉ nói với bạn rằng một đột biến tồn tại. Bạn phải thực hiện tiếp theo trình tự DNA để xác định bản chất của sự đột biến gây ra một thay đổi electrophoretic di động trong một mẫu nhất định.Hơn nữa, không phải tất cả các đột biến điểm theo một thứ tự nhất định sẽ gây ra một sự thay đổi phát hiện trong electrophoretic di. Tuy nhiên, bằng cách tối ưu PCR phản ứng và các điều kiện chạy trước khi thử một kiểm tra quy mô lớn bạn có thể làm tăng sự nhạy cảm.Biến thể và sửa đổi của SSCP:Nhiều gel chạy điều kiệnnhiệt độ (~ nhiệt độ phòng, ~ 4oC)bổ sung các chất phụ gia ví dụ glycerol (5-10%); Sucroza (10%)Khác nhau gel ma trậnThấp polyacrylamide qua linker tỷ lệ (49: 1 acrylamide: bis-acrylamide) (5-10% gel)MDE, GeneAmp, Hydrolink gelAgarose gel (độ phân giải của minisatellite isoalleles (chiều dài tương tự, nhưng một vài cặp cơ sở thay thế trong vòng lặp lại minisatellite) miễn là 10.1 kb; Monkton và Jeffreys, 1995).Thông lượng cao SSCP: sử dụng sharkstooth lược, ống lấy đa kênh, microtitre tấm, Le khi lặp đi lặp lại trên hai gel đổ giữa ba tấm kết quả trong 1000 PCR phản ứng chuẩn bị và phân tích trong 24 giờ làm việc bằng cách sử dụng năm 40cm x 30cm gel xe tăng. Được sử dụng để phân tích của exon 3 của LDLR ở những bệnh nhân với gia đình hypercholesterolaemia (Whittall và ctv., 1995).rSSCP: RNA-SSCP: RNA đang bị kẹt lại duy nhất cần phải có một tiết mục lớn hơn của cấu trúc bậc hai, kể từ khi RNA basepairing là ổn định hơn RNA-DNA basepairing, và có thể được dự kiến để áp dụng hơn cấu trúc conformational và do đó nhạy cảm với thay đổi trình tự. Hiệu quả của phát hiện: 70% cho rSSCP so với 35% cho SSCP (cho 2,6 kb của gen yếu tố IX). Tuy nhiên, nó là bất tiện cho RNA sợi (liên quan đến giới thiệu RNA-polymerase quảng bá vv) và mặc dù sự phong phú của bảng điểm cho phép để phát hiện bromua ethidium các rSSCPs, thêm phức tạp và chi phí đã loại trừ sử dụng rộng rãi (Sarkar và ctv., 1992a).REF-SSCP: hạn chế endonuclease fingerprinting. Một sửa đổi của SSCP nơi một phân đoạn 1-kb tiêu hóa với 5 enzyme giới hạn được thiết kế để sản xuất những mảnh vỡ của ~ 150bp (yếu tố IX gen). Sau khi tiêu hóa các sản phẩm là hỗn hợp, kết thúc với nhãn hiệu với 32P, denatured và electrophoresed dưới phòng không biến tính điều kiện. Hai 'thành phần' được hiển nhiên; đạt được hoặc mất mát của hạn chế trang web 'thông tin hạn chế thành phần' hoặc bất thường di động hạn chế 5 mảnh (10 sợi) được gọi là 'SSCP thành phần'. Hiệu quả của phát hiện: 96% phát hiện (5.6%polyacrylamide/23oC) hoặc 100% (7.5%GeneAmp/23oC hay 8oC) của thử nghiệm 24 đột biến (lưu và Sommer, 1995). MicrosatellitesGiới thiệu về phân tích Microsatellite Microsatellite phân tích là gì? Microsatellite loci là Đảng Cộng sản Romania khuếch đại và các sản phẩm PCR sau đó được phân tích bằng điện để tách alen theo kích cỡ. Đảng Cộng sản Romania khuếch đại microsatellite alen có thể được phát hiện bằng cách sử dụng phương pháp khác nhau, chẳng hạn như thuốc nhuộm huỳnh quang ghi nhãn, bạc nhuộm hoặc thuốc nhuộm huỳnh quang nhuộm. NềnSố lượng các đơn vị lặp lại tại một locus microsatellite có thể khác nhau, vì vậy alen nhiều độ dài khác nhau là có thể. Microsatellite loci xảy ra trong suốt gen của hầu hết sinh vật và do đó đã được sử dụng như đánh dấu để thiết lập liên kết nhóm trong đi qua và để ánh xạ di truyền được xác định đột biến để vị trí nhiễm sắc thể.Nếu tần số alen được biết đến, rất bướu microsatellite loci là rất hữu ích để xác định cá nhân trong dân và để xác định khả năng rằng hai cá nhân có liên quan. Ngoài ra, ngay cả phân phối của microsatellites trong bộ gen làm cho họ các dấu hiệu tốt để xây dựng bản đồ di truyền.Chiều dài của chuỗi microsatellite có xu hướng là đánh giá cao biến trong số các cá nhân do tỷ lệ tương đối cao đột biến. Khi DNA nhân rộng trong giảm DNA polymerase enzym có thể trượt về phía trước hoặc ngược trở lại trên các đơn vị lặp lại, xoá hoặc thêm các đơn vị lặp lại để con gái strand. Điều này có nghĩa là con gái sợi có thể có đơn vị lặp lại một chút ít hơn hoặc nhẹ hơn so với phụ huynh strand.Nhà di truyền học có thể đo lường số lượng các đơn vị lặp lại cho một microsatellite nhất định. Nếu một số microsatellites được đo trên một cá nhân, điều này dẫn đến một dấu vân tay duy nhất di truyền.Microsatellite cấu hình có thể được sử dụng trong nhiều ứng dụng sinh học bao gồm:Để xác định các cá nhân duy nhất trong dân: người, động vật hoặc thực vậtTrong khoa học pháp y, để so sánh các nghi phạm để tội phạm cảnh vết ốĐể xác định tư cách làm cha hoặc thai sản của cá nhânƯớc tính dân số kích thước cho quần thể hoang dãĐể xác định nếu quần thể đã bị tắc nghẽn di truyềnCác nghiên cứu phát sinh loài trong các ứng dụng liên quan đến phân loài rất chặt chẽ liên quanĐể ánh xạ di truyềnĐể xác định nếu có dân số phân ngành (tức là địa phương lai) trong quần thể hoang dãỨng dụng pháp yMỗi microsatellite cung cấp cho một chút nhỏ các thông tin về một cá nhân nhưng một mình không thể xác định cá nhân duy nhất. Để thiết lập bản sắc độc đáo này có một số microsatellites phải được sử dụng trên các mô tương tự và các thông tin từ một số các kết hợp để xác định một người nào đó ở cấp độ cá nhân. Cho các mục đích pháp y có thể về nguyên tắc để loại trừ hai cá nhân có một trận đấu bất kể chặt chẽ như thế nào họ có liên quan bởi không phù hợp của alen tại bất kỳ locus Tuy nhiên nó không bao giờ có thể nói hai cá nhân là giống hệt nhau vượt quá một số xác suất thống kê.Phả hệ xác địnhXác định thông tin phả hệ có thể phù hợp với cá nhân con cái để một tập hợp các giả định thông tin di truyền tồn tại cho các bậc cha mẹ giả định cha mẹ và sử dụng điều này cộng với các thông tin khác chẳng hạn như tăng trưởng hiệu suất để xác định chiến lược sinh sản tối ưu. Điều này là có giá trị trong trường hợp nơi nhận dạng vật lý của cha mẹ và con cái là không khả thi chẳng hạn như trường hợp với nuôi trồng thủy sản chuyên sâu. Nếu đủ số con cái có sẵn ngay cả trong một nhóm hỗn hợp có thể với một mức độ rất cao của sự chắc chắn để tái tạo lại cha mẹ kiểu gen chỉ từ kiểu gen thông tin thu được từ các con cái. Điều này có thể được sử dụng để gián tiếp xác định kích thước của dân chăn nuôi trong trường hợp sinh sản chiến lược của các loài trong câu hỏi là không rõ hoặc cha mẹ không có sẵn hoặc dễ dàng nhận dạng.So sánh các quần thể hoang dãĐể phân biệt đối xử dân chứ không phải là nhìn cá nhân allele tần số, hoặc một số biện pháp khác của các tần số genotypic trong một dân số được so sánh với các biện pháp tương tự trong một dân số thứ hai, một lần nữa nó là một trường hợp mà hiếm khi một locus duy nhất sẽ phân biệt rõ ràng giữa các quần thể trong câu hỏi nhưng thay vào đó họ được tách ra bằng cách kết hợp các thông tin từ một số loci.Trong trường hợp trường hợp có sự cô lập địa lý hoặc sinh sản của nó là trong một số trường hợp có thể trực quan phân biệt hai quần thể như trường hợp ở trên, cửa sổ là một dân số inshore COD bảng bên phải một dân ra nước ngoài. Sự thống trị của một hoặc hai loại allele trong cửa sổ cho thấy một sự phân biệt rõ ràng giữa hai nhóm.Các khảo nghiệm của microsatellitesCác khảo nghiệm của microsatellite được thực hiện bởi polymerase phản ứng dây chuyền (PCR) khuếch đại của một microsatellite cụ thể theo định nghĩa của các lớp lót duy nhất cho microsatellite. Mỗi microsatellite đại diện cho chỉ một phần nhỏ của toàn bộ gen và như vậy không thực tế được trực tiếp bị cô lập và đo. Việc sử dụng các lớp lót PCR được nhắm mục tiêu dựa trên các chuỗi độc đáo xung quanh microsatellite làm cho nó có thể khuyếch đại microsatellite mục tiêu hàng triệu lần và sản xuất đủ co

Kết quả (Việt) 2:

SSCP là phương pháp đơn giản nhất và được sử dụng hầu hết các phát hiện đột biến. PCR được dùng để khuếch đại các khu vực quan tâm và kết quả DNA được tách như các phân tử sợi đơn bằng điện trong một polyacrylamide gel không biến tính (Orita et al, 1989). Một sợi DNA sợi đơn nếp gấp khác nhau từ khác nếu nó khác nhau bởi một cơ sở duy nhất, và người ta tin rằng những thay đổi đột biến gây ra các cấu trúc đại học của các kết quả DNA trong độ linh động khác nhau cho hai mạch. Những đột biến này được phát hiện như là sự xuất hiện của các ban nhạc mới trên autoradiograms (phát hiện phóng xạ), bằng cách nhuộm bạc của các ban nhạc hay việc sử dụng các mồi PCR huỳnh quang mà sau đó được phát hiện bởi một chuỗi DNA tự động (phát hiện không phóng xạ). Cấu trúc bậc ba của đơn thay đổi DNA bị mắc kẹt dưới các điều kiện vật lý khác nhau ví dụ như nhiệt độ và môi trường ion. Do đó độ nhạy của SSCP phụ thuộc vào những điều này (và nhiều người khác) điều kiện (xem bên dưới). Trong khi một số quy tắc thực nghiệm đã nổi lên cho sự lựa chọn của điều kiện tách cho chuỗi các biến thể trong bối cảnh trình tự cụ thể, nó không phải là có thể dự đoán liệu một đột biến nhất định có thể được phát hiện trong những điều kiện nhất định, đặc biệt là khi các đột biến là trong một bối cảnh chuỗi mới. Phát hiện đột biến cho PCR-SSCP nói chung là cao,> 80% trong một hoạt động duy nhất cho mảnh ngắn hơn 300bp (Hayashi và Yandell, 1993). Như độ nhạy cảm không phải là 100%, sự vắng mặt của một ban nhạc mới này không chứng minh rằng không có đột biến trong phân tử phân tích. Độ nhạy của PCR-SSCP giảm khi tăng chiều dài mảnh, <300bp là tối ưu. Để phát hiện đột biến trong còn mảnh (exon> 300bp và toàn bộ các cDNA) chồng chéo cặp mồi ngắn có thể được sử dụng, hoặc các sản phẩm PCR dài tiêu hóa bằng cách hạn chế thích hợp enzyme trước khi SSCP (tuy nhiên, reamplification của các ban nhạc mới với các thiết lập cá nhân mồi đầu là bây giờ không có . còn có thể) Ưu điểm sàng lọc SSCP có hai ưu điểm chính là một kỹ thuật đột biến sàng lọc: Bạn có thể sàng lọc các đột biến ở một vùng DNA quy định bằng cách chọn mồi PCR mà span rằng khu vực này. Bạn có thể chiếu một số lượng lớn các mẫu vì kỹ thuật này là đơn giản và nhanh chóng. Các bước chỉ cần thiết sau khi khuếch đại PCR là một biến tính nhiệt trong formamid và NaOH. Hạn chế SSCP sàng lọc chỉ cho bạn biết rằng một đột biến tồn tại. Bạn phải thực hiện trình tự DNA tiếp theo để xác định bản chất của đột biến gây ra một sự thay đổi tính di động điện di trong một mẫu nhất định. Hơn nữa, không phải tất cả các đột biến điểm trong một trình tự nhất định sẽ gây ra một sự thay đổi được phát hiện ở tính di động điện di. Tuy nhiên, bằng cách tối ưu phản ứng PCR và điều kiện chạy trước khi thử một quy mô lớn thanh lọc bạn có thể tăng độ nhạy. Variations và sửa đổi của SSCP: Nhiều gel điều kiện chạy nhiệt độ (nhiệt độ phòng ~, ~ 4oC) thêm các phụ gia như glycerol (5-10 %); sucrose (10%) các ma trận gel khác nhau tỷ lệ chéo linker polyacrylamide thấp (49: 1 acrylamide: bis-acrylamide) (5-10% gel) MDE, GeneAmp, HYDROLINK gel gel Agarose (độ phân giải của isoalleles minisatellite (chiều dài tương tự, nhưng một số ít thay thế cặp base trong lặp lại minisatellite) miễn là 6.3kb; Monkton và Jeffreys, 1995). thông cao SSCP: sử dụng lược sharkstooth, pipet đa kênh, tấm vi, so le trội lặp đi lặp lại trên hai gel đổ giữa ba tấm dẫn trong năm 1000 PCR phản ứng chuẩn bị và phân tích trong 24 giờ người đàn ông sử dụng năm 40cm x 30cm thùng gel. Được sử dụng để phân tích các exon 3 của chuột Ldlr ở bệnh nhân hypercholesterolaemia gia đình (Whittall et al, 1995). rSSCP: RNA-SSCP: RNA duy nhất nên có một tiết mục lớn hơn của cấu trúc thứ cấp, kể từ RNA basepairing là ổn định hơn RNA- basepairing DNA, và có thể được dự kiến thông qua cấu trúc cấu hình không nhiều và do đó thể nhạy cảm hơn với những thay đổi liên tục. Hiệu quả của việc phát hiện: 70% cho rSSCP so với 35% cho SSCP (cho 2.6kb của gen yếu tố IX). Tuy nhiên, nó là bất tiện hơn để làm cho sợi RNA (liên quan đến việc giới thiệu quảng bá RNA polymerase vv) và mặc dù sự phong phú của các bảng điểm cho phép phát hiện ethidium bromide của rSSCPs, độ phức tạp và chi phí gia tăng đã cản trở việc sử dụng rộng rãi (Sarkar et al, 1992a) . REF-SSCP: Restriction endonuclease fingerprinting. Một sự thay đổi của SSCP nơi một phân đoạn 1-kb được tiêu hóa với 5 enzim giới hạn được thiết kế để sản xuất mảnh vỡ của ~ 150bp (Yếu tố gen IX). Sau khi tiêu hóa các sản phẩm được trộn lẫn, cuối cùng dán nhãn với 32P, đã biến tính và electrophoresed trong điều kiện không biến tính. Hai 'thành phần' là hiển nhiên; các khoản lãi lỗ của trang web hạn chế 'hạn chế thành phần thông tin' hoặc di chuyển bất thường của các mảnh vỡ giới hạn 5 (10 sợi) gọi là 'SSCP thành phần'. Hiệu quả của việc phát hiện: phát hiện 96% (5,6% polyacrylamide / 23oC) hoặc 100% (7,5% GeneAmp / 23oC hoặc 8oC) của 24 thử nghiệm đột biến (Liu và Sommer, 1995). microsatellites Giới thiệu về microsatellite Phân tích microsatellite phân tích là gì? locus microsatellite PCR được khuếch đại và các sản phẩm PCR sau đó được phân tích bằng điện di để tách các alen theo kích thước. Alen microsatellite PCR-khuếch đại có thể được phát hiện bằng cách sử dụng phương pháp khác nhau, chẳng hạn như ghi nhãn huỳnh quang nhuộm, nhuộm bạc, hoặc huỳnh quang nhuộm nhuộm. Background Số lượng đơn vị lặp lại tại một locus microsatellite có thể khác nhau, do đó alen của nhiều độ dài khác nhau là có thể. Locus microsatellite xảy ra trên toàn bộ gen của hầu hết các sinh và do đó đã được sử dụng như là dấu mốc để thành lập nhóm liên kết trong thập và lập bản đồ xác định biến đổi gen để nhiễm sắc vị trí. Nếu tần số alen được biết, locus microsatellite rất đa hình là rất hữu ích cho việc xác định các cá nhân trong một dân số và xác định xác suất mà hai cá nhân có liên quan. Ngoài ra, sự phân bố đều microsatellites trong hệ gen làm chất chỉ thị để xây dựng bản đồ di truyền. Chiều dài của chuỗi microsatellite có xu hướng rất khác nhau giữa các cá nhân do tỷ lệ đột biến tương đối cao. Khi ADN được nhân rộng trong giảm phân enzyme polymerase DNA có thể trượt về phía trước hay phía sau trên các đơn vị lặp lại, xóa hoặc thêm các đơn vị lặp lại vào các sợi con gái. Điều này có nghĩa rằng các phần con gái có thể có các đơn vị lặp lại ít hơn hoặc nhiều hơn một chút so với các sợi cha mẹ. Các nhà di truyền có thể đo số lượng các đơn vị lặp lại cho một vệ tinh nhỏ nhất định. . Nếu một số microsatellites được đo trên một cá nhân kết quả này trong một dấu vân tay di truyền độc đáo hồ sơ microsatellite có thể được sử dụng trong nhiều ứng dụng sinh học bao gồm: Để xác định cá nhân duy nhất trong một dân số: con người, động vật hoặc thực vật Trong khoa học pháp y, để so sánh nghi phạm để cảnh tội phạm vết bẩn Để xác định quan hệ cha con hoặc thai sản của các cá nhân Để ước tính quy mô dân số đối với các quần thể hoang dã Để xác định các quần thể đã bị tắc nghẽn di truyền Đối với các nghiên cứu phát sinh loài trong các ứng dụng liên quan đến phân loài có liên quan rất chặt chẽ Đối lập bản đồ di truyền để xác định xem có phân khu dân cư (giao phối cận huyết tức là địa phương) quần thể hoang dã ứng dụng Forensic Mỗi microsatellite cho một bit thông tin về một cá nhân nhưng một mình không có thể xác định các cá nhân duy nhất. Để thiết lập bản sắc độc đáo một số microsatellites phải được sử dụng trên các tế bào tương tự và các thông tin từ một số các kết hợp để xác định một người nào đó ở cấp độ cá nhân. Đối với mục đích pháp y có thể về nguyên tắc để loại trừ hai cá nhân từ một trận đấu bất kể như thế nào họ có liên quan chặt chẽ bởi không phù hợp của các alen ở bất kỳ locus tuy nhiên nó không bao giờ có thể nói hai người giống hệt nhau ngoài một số xác suất thống kê. quyết Pedigree Đối với các xác định thông tin phả hệ có thể để phù hợp với con người đến một tập các phụ huynh giả định thông tin di truyền tồn tại đối với các bậc phụ huynh giả định và sử dụng điều này cộng với các thông tin khác như hiệu suất tăng trưởng để xác định các chiến lược sinh sản tối ưu. Điều này rất có giá trị trong trường hợp nhận dạng vật lý của các bậc cha mẹ và con cái là không khả thi như trường hợp với nuôi trồng thủy sản thâm canh. Nếu đủ số lượng con cái có sẵn ngay cả trong một nhóm hỗn hợp đó là có thể với một mức độ rất cao của sự chắc chắn để tái tạo lại kiểu gen mẹ chỉ duy nhất từ các thông tin thu được từ kiểu gen con. Điều này có thể được sử dụng để gián tiếp xác định kích thước của quần thể sinh sản trong trường hợp các chiến lược sinh sản của các loài trong câu hỏi là không biết hoặc cha mẹ không có sẵn hoặc dễ nhận biết. So sánh các quần thể hoang dã Để phân biệt đối xử dân chứ không phải nhìn vào cá nhân alen tần số, hoặc một số biện pháp khác của tần số kiểu gen trong một quần thể được so sánh với các biện pháp tương tự trong một dân số thứ hai, một lần nữa nó là một trường hợp đó hiếm khi là một locus đơn sẽ phân biệt rõ ràng giữa các quần thể trong câu hỏi mà chúng được tách ra bằng cách kết hợp thông tin từ nhiều loci. Trong trường hợp có một trong hai cô lập về địa lý hoặc sinh sản của quần thể đó là trong một số trường hợp có thể để trực quan phân biệt hai quần như trường hợp trên, bảng điều khiển bên trái là một dân ven bờ của cá tuyết bảng bên phải một dân ra nước ngoài. Sự thống trị của một hoặc hai loại alen trong bảng điều khiển bên trái cho thấy một sự phân biệt rõ ràng giữa hai nhóm. Khảo nghiệm microsatellites Các khảo nghiệm microsatellite được thực hiện bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) khuếch đại của một vệ tinh nhỏ như được xác định bởi các mồi độc đáo cho các microsatellite. Mỗi microsatellite chỉ chiếm một phần rất nhỏ trong toàn bộ hệ gen và như vậy có thể không thực tế được phân lập trực tiếp và đo. Việc sử dụng các mồi PCR nhắm mục tiêu dựa trên các trình tự duy nhất xung quanh các microsatellite làm cho nó có thể để khuếch đại hàng triệu mục tiêu microsatellite lần và để sản xuất đủ đồng