EXPERIMENTAL AND THERAPEUTIC MEDICI

EXPERIMENTAL AND THERAPEUTIC MEDICINE 8: 1501-1507, 2014
Abstract. The aim of this study was to compare quantitative
polymerase chain reaction (qPCR) with immunohistochemistry (IHC) for the detection of Her-2 in gastric cancer, and
to investigate the correlation between the expression levels of
human epidermal growth factor receptor 2 (Her-2) and clinical
features. Clinical data from 426 cases of gastric cancer were
collected. Her-2 expression levels in cancerous tissue were
detected using IHC, and the Her-2/neu gene expression levels
were determined by qPCR. The correlation between the expression level of Her-2 and clinical features was investigated. The
positive expression rate of Her-2 in cancerous tissue detected
using qPCR and IHC was 11.17% (46/412) and 13.38% (57/426),
respectively. The positive expression of the Her-2 protein/gene
was significantly correlated with the depth of invasion and
lymphatic metastasis, as well as the TNM stage (P0.05). The
diagnostic consistency was good between the two methods
(κ=0.828). The results indicate that the expression of Her-2/neu
is closely associated with the development of gastric cancer.
qPCR is a convenient, objective and efficient method, which
may be used as an alternative to IHC or fluorescence in situ
hybridization for the detection of Her-2/neu gene.
Introduction
Gastric cancer is the most common malignant tumor of the
digestive system and it is the second most lethal cancer worldwide (1). The prevalence of gastric cancer differs regionally, and
~70% of cases occur in developing countries (2-4). The human
epidermal growth factor receptor 2 (Her-2) is a member of the
epithelial growth factor receptor (EGFR) family, the amplification of which may induce the overexpression of EGFR. Once it
is bound to its ligand, Her-2 is phosphorylated and its function
as a tyrosine kinase is activated, thus promoting cell proliferation (5). Park et al (6) demonstrated that Her-2 is an independent
prognostic factor of gastric cancer. Her-2 is usually detected
using immunohistochemistry (IHC) and fluorescence in situ
hybridization (FISH), which each have advantages but also
disadvantages. Therefore, the investigation of novel methods
is necessary. In the present study, 426 cases of gastric cancer,
all pathogenically confirmed, were collected. The clinical data
were retrospectively reviewed. Her-2 expression in tumor tissue
was examined using IHC, and the Her-2/neu gene expression
was examined by quantitative polymerase chain reaction
(qPCR). The aim of this study was to provide a novel method for
the detection of Her-2/neu gene in gastric cancer tissues.
Materials and methods
Samples. Data was collected from patients admitted to the
General Military Hospital of Beijing PLA (124 cases), the 281st
Hospital of the PLA (107 cases), Zhejiang Cancer Hospital
(99 cases) and Weifang People's Hospital (96 cases) between
2011 and 2013. Written informed consent was obtained from
all patients prior to their participation in the study. All patients
were pathologically diagnosed with gastric cancer and Her-2
protein expression was detected using IHC. None of the patients
received preoperative treatment with chemotherapy, radiotherapy or immunotherapy. Samples consisted of 424 cases of
adenocarcinoma (including papillary adenocarcinoma, tubular
adenocarcinoma, mucous adenocarcinoma and signet ring cell
carcinoma), one case of gland scale cancer and one case of squamous carcinoma. The patients included 149 cases of intestinal
type, 244 cases of diffuse type and 33 cases of mixed/unknown.
Detection of Her‑2/neu expression in gastric cancer:
Quantitative PCR versus immunohistochemistry
GUANG-JUN ZHU
1
, CHUN-WEI XU2
, MEI-YU FANG
3
, YU-PING ZHANG
4
andYANG LI
5
1
Department of Central Laboratory, The 281st Hospital of the PLA, Qinhuangdao, Hebei 066105;
2
Department of Pathology, The General Military Hospital of Beijing PLA, Beijing 100700;
3
Department of Integrated Chinese Traditional Medicine and Western Medicine, Zhejiang Cancer Hospital,
Hangzhou, Zhejiang 310021;
4
Department of Pathology, Weifang People's Hospital, Weifang, Shandong 261041;
5
Department of Oncology, The General Military Hospital of Beijing PLA, Beijing 100700, P.R. China
Received February 19, 2014; Accepted July 22, 2014
DOI: 10.3892/etm.2014.1982
Correspondence to:Dr Yang Li, Department of Oncology, The
General Military Hospital of Beijing PLA, Nanmen Warehouse,
5 Dongsishitiao Street, Beijing 100700, P.R. China
E-mail: [e-mail]
Abbreviations: Her-2, human epidermal growth fact or receptor 2;
EGFR, epithelial growth factor receptor; PCR, polymerase chain
reaction; FISH, fluorescence in situ hybridization.
Key words: quantitative polymerase chain reaction, gastric cancer,
Her-2/neu
ZHU et al: DETECTION OF hER-2/NEU EXPRESSION IN GASTRIC CANCER 1502
The ages of the patients ranged between 27 and 84 years (median
age, 59.2 years) and included 322 males and 104 females.
According to the World Health Organizationcriteria (7), there
were 192 poorly differentiated, 161 moderately differentiated
and 73 highly differentiated cases. A total of 310 cases were
observed with lymph node metastasis and 116 cases without
lymph node metastasis. There were 93 cases in the cardia,
180 cases in the antrum and 153 cases in the stomach body. The
cancer was classified as stage I in 40 cases, stage II in 108 cases,
stage III in 248 cases and stage IV in 30 cases, respectively,
according to the TNM Cancer Staging System of the American
Joint Committee of Cancer (8).
Materials and reagents. The DNA extraction kit was purchased
from Qiagen (Hilden, Germany) and a Her-2/neu FISH testing
kit was obtained from Beijing ACCB Biotech Ltd.(Beijing,
China). The Mx3000P qPCR system was obtained from
Stratagene (La Jolla, CA, USA).
DNA extraction. DNA extraction was performed using the
QIAamp DNA FFPE Tissue kit (Qiagen). The tissue was
sectioned into slices (10 µm). The concentration and purity of
the DNA was then measured in accordance with the manufacturer's instructions.
qPCR. The PCR reaction volume (20 µl) included 0.3 µl Taq
DNA polymerase, 0.4 µl substrate dNTP, 2.4 µl Mg
2+
, 2.0 µl
buffer and 3.0 µlDNA. The primers were obtained from the
real-time PCR kit usedand their catalogue numbers were
Q/HDYKB007. The cycling conditions were as follows: 95˚C
for 5 min, followed by 45 cycles of 95˚C for 30 sec, 60˚C for
30 sec and 72˚C for 45 sec, for a total of 40 cycles.
3 analysis. Her‑2 gene was amplified with dual‑color FISH
(Her-2 gene real-time PCR kit, Guangzhou LBP Medical
Science Technology Co., Ltd., Guangzhou, China) in
accordance with the manufacturer's instructions. Briefly,
hybridization buffer, a DNA probe and purified water were
centrifuged and then heated to 65˚C overnight in a water bath.
Tissue sections (4 µm) were placed on slides and immersed
in a denaturing bath (2X SSC) for 5 min at 73˚C, followed
by dehydration in increasing ethanol concentrations and then
dried. The slides were incubated with the probe at 42˚C for
30 min. The slides were then washed with 0.4X SSC/0.3%
NP-40 for 2 min, air-dried in the dark, counterstained with
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)and covered with a
cover-slip. The slides were observed under an Olympus BX51
fluorescence microscope (Shanghai Pooher Photoelectric
Technology Co., Ltd., Shanghai, China)equipped with a
digital camera. A cell was considered to be amplified when
a definite cluster of >10 signals for Her-2 was found. Known
positive and negative cells were used as controls for each
FISH assay. Gene amplification was scored when ≥20 cancer
cell nuclei exhibited a Her-2/CEP17 ratio ≥2, or when a Her‑2
signal cluster was observed (9).
IHC scoring. The 4 µm thicktissue sections of malignant
tumor cells on the slides were stained with brown staining
Figure 1. Results of quantitative polymerase chain reaction. (A) Internal control response curve. Red dots represent the internal control (Ct=26.8), blue dots
represent positive control (Ct=25.3), green dots represent negative control (Ct=0). (B) Detection of Her-2, negative response curve. Red dots represent sample
(Ct=29.0), blue dots represent positive control (Ct=25.5), green dots represent negative control (Ct=0). (C) Detection of Her-2, positive response curve. Red
dots represent sample (Ct=29.0), blue dots represent positive control (Ct=25.5), green dots represent negative control (Ct=0). Her-2, human epidermal growth
factor receptor 2.
A B
C
EXPERIMENTAL AND THERAPEUTIC MEDICINE 8: 1501-1507, 2014 1503
(Zymed Corporation, Inc., San Francisco, CA, USA). Br iefly,
sections were deparaffinized in xylene and rehydrated in
grade alcohols. The antigen retrieval was performed using
the wet autoclaving method in the presence of citrate buffer
pH 6.0. The sections were incubated overnight in primary
antibody at a dilution of 1:100 in blocking buffer at 4˚C. The
sections were stained using a Polin-2 plus Polymer HRP
Detection System(ZSBIO, Beijing, China). Strong brown
staining in the cell membrane of malignant tumor cells indicates positivity in this staining method. The HercepTest™
Interpretation Guide (10) was used to grade the membrane
staining. The staining was scored as negative (0) when no
membrane staining was observed or when membranes were
stained in ≤10% of tumor cells, weakly positive (+) if the focal
membrane was stained in ≥10% of tumor cells, intermediately
positive (++) if complete membranes were weakly-moderately
stained in ≥10% of tumor cells and strongly positive (+++) if
complete membranes were intensely stained in ≥10% of tumor
cells.
Statistical analysis. Data were calculated using SPSS softwa

Kết quả (Việt) 1:

THỬ NGHIỆM VÀ ĐIỀU TRỊ Y HỌC 8:1501-1507, 2014Tóm tắt. Mục đích của nghiên cứu này là để so sánh định lượng phản ứng chuỗi trùng hợp (qPCR) với immunohistochemistry (công ty IHC) để phát hiện các Her-2 trong ung thư dạ dày, và để điều tra các mối tương quan giữa mức độ biểu hiện của thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì của con người 2 (Her-2) và lâm sàng tính năng. Các dữ liệu lâm sàng từ 426 trường hợp ung thư dạ dày thu thập. Biểu hiện của cô-2 mực trong mô ung thưphát hiện bằng cách sử dụng công ty IHC, và mức độ biểu hiện gen Her-2/neu đã được xác định bởi qPCR. Sự tương quan giữa mức độ biểu hiện của tính năng của cô-2 và lâm sàng được điều tra. Các tích cực biểu hiện tỷ lệ của cô-2 trong mô ung thư phát hiện bằng cách sử dụng qPCR và công ty IHC là 11.17% (46/412) và 13.38% (57/426), tương ứng. Biểu thức tích cực của các protein Her-2/gen là đáng kể tương quan với chiều sâu của cuộc xâm lược và bạch huyết di căn, cũng như các giai đoạn TNM (P < 0,05). Không tương quan đáng kể đã được xác định giữa các biểu hiện tích cực của vị trí protein/gen và khối u của cô-2, tuổi, giới tính, mức độ sự khác biệt và Lauren phân loại (P > 0,05). Các chẩn đoán nhất quán là tốt giữa hai phương pháp (Κ = 0,828). Kết quả chỉ ra rằng sự biểu hiện của cô-2/neu là liên kết chặt chẽ với sự phát triển của ung thư dạ dày. qPCR là một phương pháp thuận tiện, khách quan và hiệu quả, mà có thể được sử dụng như là một thay thế cho IHC hoặc huỳnh quang tại chỗlai ghép cho phát hiện của cô-2/neu gen.Giới thiệuUng thư dạ dày là khối u ác tính phổ biến nhất của các Hệ thống tiêu hóa và nó là ung thư nguy hiểm nhất thứ hai trên toàn thế giới (1). Sự phổ biến của ung thư dạ dày khác với khu vực, và ~ 70% các trường hợp xảy ra ở các nước đang phát triển (2-4). Con người thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì 2 (Her-2) là một thành viên của các biểu mô yếu tố tăng trưởng gia đình thụ thể (EGFR), khuếch đại trong đó có thể gây ra tế EGFR. Một lần nó là ràng buộc để phối tử, 2 của cô phosphorylated và chức năng của nó như một tyrosine kinase được kích hoạt, do đó thúc đẩy sự gia tăng di động (5). Park et al (6) đã chứng minh rằng Her-2 là một độc lập Prognostic yếu tố của ung thư dạ dày. Her 2 thường được phát hiện bằng cách sử dụng immunohistochemistry (công ty IHC) và sự phát huỳnh quang tại chỗlai ghép (cá), mà mỗi có lợi thế mà còn bất lợi. Do đó, việc điều tra của cuốn tiểu thuyết phương pháp là cần thiết. Trong nghiên cứu hiện nay, các trường hợp 426 ung thư dạ dày, Tất cả pathogenically xác nhận, được thu thập. Dữ liệu lâm sàng Trang đã được xem xét. Biểu hiện của cô-2 trong khối u mô được kiểm tra bằng cách sử dụng công ty IHC, và biểu hiện gen Her-2/neu được kiểm tra bởi phản ứng chuỗi trùng hợp định lượng (qPCR). Mục đích của nghiên cứu này là để cung cấp một phương pháp mới lạ cho phát hiện của cô-2/neu gen trong các mô ung thư dạ dày.Vật liệu và phương phápMẫu. Dữ liệu được thu thập từ bệnh nhân nhận vào các Tướng quân sự bệnh viện của Bắc Kinh PLA (124 vụ), các 281st Bệnh viện của PLA (107 vụ), Chiết Giang ung thư bệnh viện (trường hợp 99) và bệnh viện nhân dân duy phường (96 vụ) giữa 2011 và năm 2013. Ý bằng văn bản thông báo nhận được từ Tất cả bệnh nhân trước khi họ tham gia vào nghiên cứu. Tất cả bệnh nhân pathologically được chẩn đoán mắc bệnh ung thư dạ dày và Her-2 biểu hiện protein được phát hiện bằng cách sử dụng công ty IHC. Không ai trong số các bệnh nhân nhận được preoperative điều trị bằng hóa trị, xạ trị hoặc immunotherapy. Mẫu bao gồm các trường hợp 424 của adenocarcinoma (bao gồm cả nhú adenocarcinoma, hình ống adenocarcinoma, chất nhầy adenocarcinoma và tế bào signet ring ung thư biểu mô), một trường hợp của tuyến quy mô ung thư và một trường hợp ung thư biểu mô vảy. Các bệnh nhân bao gồm các trường hợp 149 của đường ruột loại, các trường hợp 244 khuếch tán loại và 33 trường hợp của hỗn hợp/không rõ. Phát hiện của Her‑2/neu biểu hiện trong bệnh ung thư dạ dày: Đảng Cộng sản Romania định lượng so với immunohistochemistryGUANG-JUN ZHU1, CHUN-WEI XU2, MEI-YU FANG3, YU-PING ZHANG4andYANG LI51Vùng Trung tâm phòng thí nghiệm, bệnh viện 281st của PLA, Tần Hoàng đảo, Hà Bắc 066105; 2Vùng bệnh lý, các tướng quân sự bệnh viện của Bắc Kinh PLA, Beijing 100700; 3Trong số các vùng tích hợp Trung Quốc truyền thống y học và y học phương Tây, Chiết Giang ung thư bệnh viện, Hàng Châu, Zhejiang 310021; 4Vùng bệnh học, bệnh viện nhân dân duy phường, Duy Phường, Shandong 261041; 5Vùng ung thư, các tướng quân sự bệnh viện của Bắc Kinh PLA, Beijing 100700, PR Trung QuốcNhận được 19 tháng 2 năm 2014; Được chấp nhận ngày 22, 2014DOI: 10.3892/etm.2014.1982Thư từ đến: tiến sĩ Yang Li, vùng ung thư, các Tướng quân sự bệnh viện của Bắc Kinh PLA, Nanmen kho, 5 Dongsishitiao Street, Beijing 100700, PR Trung QuốcThư điện tử: [e-mail]ữ viết tắt: Her 2, sự phát triển biểu bì của con người thực tế hoặc thụ thể 2; EGFR, thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu mô; Đảng Cộng sản Romania, trùng hợp Chuỗi phản ứng; CÁ, huỳnh quang trong situ lai ghép.Từ khóa: phản ứng chuỗi trùng hợp định lượng, ung thư dạ dày, Her-2/neuZHU et al: phát hiện của cô-2/NEU biểu hiện trong bệnh ung thư dạ dày 1502Lứa tuổi của bệnh nhân trải dài giữa 27 và 84 năm (trung bình tuổi, tuổi 59,2) và bao gồm 322 phái nam và phái nữ chiếm 104. Theo để thế giới sức khỏe Organizationcriteria (7), có là 192 kém phân biệt, 161 vừa phải phân biệt và 73 rất khác nhau là trường hợp. Tổng cộng có 310 trường hợp quan sát với di căn của hạch và 116 trường hợp mà không có hạch di căn. Đã có 93 trường hợp trong cardia, 180 trường hợp ở vùng hang vị và 153 trường hợp trong cơ thể dạ dày. Các ung thư được phân loại là giai đoạn I trong trường hợp 40, giai đoạn II trong trường hợp 108, giai đoạn III trong trường hợp 248 và giai đoạn IV trong 30 trường hợp, tương ứng, theo hệ thống dàn ung thư trên TNM người Mỹ Ủy ban hỗn ung thư (8).Vật liệu và thuốc thử. Bộ công cụ khai thác DNA đã được mua từ Qiagen (Hilden, Đức) và một thử nghiệm của cô-2/neu cá bộ nhận được từ Bắc Kinh ACCB công nghệ sinh học Ltd.(Beijing, Trung Quốc). Hệ thống qPCR Mx3000P nhận được từ Stratagene (La Jolla, California, Hoa Kỳ).Khai thác DNA. DNA khai thác được thực hiện bằng cách sử dụng các QIAamp DNA FFPE mô kit (Qiagen). Các tế bào sectioned thành lát (10 μm). Nồng độ và độ tinh khiết của DNA sau đó đã được đo theo hướng dẫn của nhà sản xuất.qPCR. Khối lượng phản ứng Đảng Cộng sản Romania (20 ml) bao gồm cách 0.3 ml Taq DNA polymerase, cách 0.4 ml bề mặt dNTP, 2.4 ml Mg2 +, 2.0 ml bộ đệm và 3.0 µlDNA. Các chất nền, mồi được thu được từ các thời gian thực Đảng Cộng sản Romania kit usedand số danh mục của họ đã Q/HDYKB007. Các điều kiện đi xe đạp như sau: 95˚C trong 5 phút, sau đó là 45 chu kỳ của 95˚C cho 30 giây, 60˚C cho 30 giây và 72˚C trong 45 giây, cho một tổng số là 40 chu kỳ. 3 phân tích. Her‑2 gen được khuếch đại với dual‑color cá (Her 2 gen thời gian thực Đảng Cộng sản Romania kit, Quảng Châu LBP y tế Khoa học công nghệ Co., Ltd, Quảng Châu, Trung Quốc) trong phù hợp với hướng dẫn của nhà sản xuất. Một thời gian ngắn, lai ghép đệm, thăm dò DNA và nước tinh khiết ly và sau đó đun nóng đến 65˚C qua đêm trong một bồn tắm nước. Mô phần (4 μm) đã được đặt trên trang trình bày và đắm mình trong một bồn tắm denaturing (2 X SSC) trong 5 phút tại 73˚C, theo sau bởi mất nước tăng nồng độ cồn và sau đó khô. Các trang trình bày đã được ủ với thăm dò tại 42˚C cho 30 phút. Các trang trình bày sau đó đã được rửa sạch với cách 0.4 X SSC/0.3% NP-40 cho 2 phút, air-dried trong bóng tối, counterstained với 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) và được bảo hiểm với một nắp trượt. Các trang trình bày đã được quan sát dưới một BX51 Olympus huỳnh quang kính hiển vi (Thượng Hải Pooher quang điện Công nghệ Co., Ltd, Thượng Hải, Trung Quốc) được trang bị với một máy ảnh kỹ thuật số. Một tế bào được coi là khuếch đại khi một cụm nhất định > 10 tín hiệu cho Her-2 đã được tìm thấy. Được biết đến tích cực và tiêu cực tế bào đã được sử dụng như điều khiển cho mỗi CÁ khảo nghiệm. Gene khuếch đại được ghi bàn khi ung thư ≥20 nhân tế bào trưng bày một tỷ lệ của cô-2/CEP17 ≥2, hoặc khi một Her‑2 tín hiệu cụm sao đã được quan sát (9).IHC ghi. 4 μm thicktissue phần của ác tính khối u tế bào trên các trang trình bày đã được nhuộm màu với màu nâu nhuộm Hình 1. Kết quả của phản ứng chuỗi trùng hợp định lượng. (A) nội bộ kiểm soát phản ứng đường cong. Dấu chấm đỏ đại diện cho sự kiểm soát nội bộ (Ct = 43.2), màu xanh dấu chấm đại diện tích cực kiểm soát (Ct = 40.7), dấu chấm màu xanh lá cây đại diện cho tiêu cực điều khiển (Ct = 0). (B) phát hiện Her-2, tiêu cực phản ứng đường cong. Dấu chấm đỏ đại diện cho mẫu (Ct = 46.6), dấu chấm màu xanh đại diện tích cực kiểm soát (Ct = 41.1), dấu chấm màu xanh lá cây đại diện cho tiêu cực điều khiển (Ct = 0). (C) phát hiện của đường cong của cô-2, tích cực phản ứng. Red dấu chấm đại diện cho mẫu (Ct = 46.6), dấu chấm màu xanh đại diện tích cực kiểm soát (Ct = 41.1), dấu chấm màu xanh lá cây đại diện cho tiêu cực điều khiển (Ct = 0). Tốc độ tăng trưởng biểu bì của cô-2, con người yếu tố các thụ thể 2.MỘT BCTHỬ NGHIỆM VÀ ĐIỀU TRỊ Y HỌC 8:1501-1507, 2014 1503(Zymed Tổng công ty, Inc., San Francisco, CA, Hoa Kỳ). BR iefly, phần deparaffinized trong Xylen và hydrat trong lớp rượu. Tra cứu kháng nguyên được thực hiện bằng cách sử dụng phương pháp khử trùng ướt sự hiện diện của bộ đệm citrate pH 6.0. Các phần được ủ qua đêm trong tiểu kháng thể tại một pha loãng của 1: 100 trong chặn đệm tại 4˚C. Các phần đã được nhuộm màu bằng cách sử dụng một Polin-2 cộng với Polymer HRP Hệ thống phát hiện (ZSBIO, Bắc Kinh, Trung Quốc). Mạnh mẽ brown nhuộm trong màng tế bào của các tế bào khối u ác tính chỉ ra dương tính trong phương pháp này staining. HercepTest ™ Giải thích hướng dẫn (10) được sử dụng để lớp màng tế bào nhuộm. Các nhuộm được ghi là tiêu cực (0) khi không có màng nhuộm được quan sát thấy hoặc khi màng màu trong ≤10% của các tế bào khối u, yếu giữa cực dương (+) nếu các đầu mối màng được nhuộm màu trong ≥10% của các tế bào khối u, intermediately tích cực (++) nếu hoàn thành màng yếu vừa màu trong ≥10% của các tế bào khối u và mạnh mẽ tích cực (+ + +) nếu hoàn thành màng được mạnh mẽ màu trong ≥10% của khối u tế bào.Phân tích thống kê. Dữ liệu đã được tính toán bằng cách sử dụng SPSS softwa

Kết quả (Việt) 2:

THỰC NGHIỆM VÀ ĐIỀU TRỊ THUỐC 8: 1501-1507, 2014
Tóm tắt. Mục đích của nghiên cứu này là so sánh định lượng
phản ứng chuỗi polymerase (qPCR) với mô miễn dịch (IHC) để phát hiện của 2 cô trong ung thư dạ dày, và
để điều tra sự tương quan giữa mức độ biểu hiện của
yếu tố tăng trưởng biểu bì của con người thụ 2 (Her- 2) và lâm sàng
các tính năng. Dữ liệu lâm sàng từ 426 trường hợp ung thư dạ dày được
thu thập. 2 cô-mức độ biểu hiện trong tế bào ung thư được
phát hiện bằng cách sử dụng IHC, và mức độ biểu hiện gen của cô-2 / neu
được xác định bởi qPCR. Sự tương quan giữa mức độ biểu hiện của tính năng lâm sàng Her-2 và đã được điều tra. Các
tỷ lệ biểu hiện tích cực của 2 cô trong tế bào ung thư được phát hiện
bằng cách sử dụng qPCR và IHC là 11,17% (46/412) và 13,38% (57/426),
tương ứng. Các biểu hiện tích cực của các protein Her-2 / gen
có tương quan đáng kể với độ sâu của cuộc xâm lược và
di căn bạch huyết, cũng như các giai đoạn TNM (P <0,05). Không có
tương quan đáng kể đã được xác định giữa biểu hiện tích cực của các protein Her-2 / gen và vị trí khối u, tuổi tác, giới tính,
mức độ khác biệt và Lauren phân loại (P> 0,05). Việc
thống nhất chẩn đoán là tốt đẹp giữa hai phương pháp
(κ = 0,828). Kết quả cho thấy rằng biểu hiện của Her-2 / neu
có liên quan chặt chẽ với sự phát triển của bệnh ung thư dạ dày.
qPCR là một phương pháp thuận tiện, khách quan và hiệu quả, trong đó
có thể được sử dụng như là một thay thế cho IHC hoặc huỳnh quang tại chỗ
lai để phát hiện Her-2 / neu gen.
Giới thiệu
dạ dày ung thư là các khối u ác tính thường gặp nhất của
hệ thống tiêu hóa và nó là loại ung thư gây tử vong nhiều thứ hai trên thế giới (1). Sự phổ biến của bệnh ung thư dạ dày khác trong khu vực, và
~ 70% các trường hợp xảy ra ở các nước đang phát triển (2-4). Các nhân
tố tăng trưởng biểu bì thụ 2 (Her-2) là một thành viên của các
thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR) trong gia đình, sự khuếch đại mà có thể gây ra các biểu hiện quá mức của EGFR. Một khi nó
được gắn với ligand của nó, Her-2 là phosphoryl hóa và chức năng của nó
như là một tyrosine kinase được kích hoạt, từ đó thúc đẩy sự tăng sinh tế bào (5). Công viên và cộng (6) al chứng minh rằng 2 cô-là một độc lập
yếu tố tiên lượng của bệnh ung thư dạ dày. Her-2 thường được phát hiện
bằng cách sử dụng mô miễn dịch (IHC) và huỳnh quang tại chỗ
lai (FISH), trong đó mỗi người đều có lợi thế nhưng cũng
bất lợi. Do đó, việc điều tra các phương pháp mới
là cần thiết. Trong nghiên cứu này, 426 trường hợp ung thư dạ dày,
tất cả pathogenically xác nhận, đã thu thập được. Các dữ liệu lâm sàng
đã được nghiên cứu hồi cứu. Her-2 biểu hiện trong mô khối u
đã được kiểm tra bằng cách sử dụng IHC, và sự biểu hiện gene Her-2 / neu
đã được kiểm tra bằng phản ứng chuỗi polymerase định lượng
(qPCR). Mục đích của nghiên cứu này là để cung cấp một phương pháp mới cho
việc phát hiện 2 cô / gen neu trong các mô ung thư dạ dày.
Vật liệu và phương pháp
mẫu. Dữ liệu được thu thập từ các bệnh nhân nhập viện
Bệnh viện đa khoa quân sự của Bắc Kinh PLA (124 trường hợp), các 281
Bệnh viện của PLA (107 trường hợp), Bệnh viện Ung thư Chiết Giang
(99 trường hợp) và Bệnh viện nhân dân Duy Phường (96 trường hợp) giữa
năm 2011 và 2013. Văn bản đồng ý được thu thập từ
tất cả các bệnh nhân trước khi họ tham gia vào nghiên cứu. Tất cả bệnh nhân
được chẩn đoán bệnh lý ung thư dạ dày và 2 cô
biểu hiện protein đã được phát hiện bằng cách sử dụng IHC. Không ai trong số các bệnh nhân
được điều trị bằng hóa trị trước phẫu thuật, xạ trị hay liệu pháp miễn dịch. Mẫu gồm 424 trường hợp
ung thư tuyến (bao gồm cả ung thư tuyến nhú, hình ống
ung thư tuyến, ung thư tuyến nhầy và tế bào nhẫn ấn
carcinoma), một trong những trường hợp ung thư tuyến quy mô và một trường hợp ung thư biểu mô vảy. Các bệnh nhân bao gồm 149 trường hợp ruột
loại, 244 trường hợp kiểu khuếch tán và 33 trường hợp hỗn hợp / không rõ.
Phát hiện 2 cô-/ biểu neu trong ung thư dạ dày:
định lượng PCR so với mô miễn dịch
GUANG-JUN ZHU
1
, CHUN-WEI XU2
, MEI -YU FANG
3
, YU-PING ZHANG
4
andYANG LI
5
1
Phòng thí nghiệm Trung ương, Bệnh viện 281 của quân đội Trung Quốc, Tần Hoàng Đảo, Hà Bắc 066.105;
2
cục Pathology, Bệnh viện đa khoa quân sự của Bắc Kinh PLA, Bắc Kinh 100.700;
3
cục Tích hợp Y học cổ truyền Trung Quốc và phương Tây, Bệnh viện Ung thư Chiết Giang,
Hàng Châu, Chiết Giang 310.021;
4
Sở Pathology, Bệnh viện Nhân dân Duy Phường, Duy Phường, Sơn Đông 261.041;
5
Sở Ung thư, Bệnh viện đa khoa quân sự của Bắc Kinh PLA, Bắc Kinh 100.700, PR Trung Quốc
Received 19 tháng 2 năm 2014; Accepted 22 Tháng Bảy 2014
DOI: 10,3892 / etm.2014.1982
Correspondence to: Tiến sĩ Yang Li, Sở Oncology, Các
bệnh viện đa khoa quân sự của Bắc Kinh PLA, Nanmen Warehouse,
5 Dongsishitiao Street, Bắc Kinh 100.700, PR Trung Quốc
E-mail: tharus20 @ qq .com
viết tắt:-2 của cô, thực tế tăng trưởng biểu bì của con người hoặc thụ 2;
EGFR, thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu mô; PCR, chuỗi polymerase
phản ứng; FISH, huỳnh quang lai tạo tại chỗ.
Từ khóa: phản ứng chuỗi polymerase định lượng, ung thư dạ dày,
Her-2 / neu
Chu et al: PHÁT HIỆN HER-2 / NEU EXPRESSION IN ung thư dạ dày 1502
Độ tuổi của các bệnh nhân dao động từ 27 đến 84 năm (trung bình
tuổi, 59,2 tuổi) và bao gồm 322 nam và 104 nữ.
Theo Bộ Y tế Thế giới Organizationcriteria (7), có
192 biệt hóa kém, 161 vừa phải phân biệt
và 73 trường hợp rất khác biệt. Có tổng cộng 310 trường hợp được
quan sát với di căn hạch và 116 trường hợp không có
di căn hạch. Có 93 trường hợp trong Cardia,
180 trường hợp ở hang vị và 153 trường hợp trong cơ thể dạ dày. Các
bệnh ung thư đã được phân loại như giai đoạn I trong 40 trường hợp, giai đoạn II trong 108 trường hợp,
giai đoạn III trong 248 trường hợp và giai đoạn IV trong 30 trường hợp, tương ứng,
theo hệ thống TNM Staging Ung thư của Mỹ
Ủy ban Hỗn hợp về Ung thư (8).
Vật liệu và thuốc thử. Các kit chiết DNA đã được mua
từ Qiagen (Hilden, Đức) và một Her-2 / neu thử nghiệm FISH
bộ thu được từ Bắc Kinh ACCB Biotech Ltd (Bắc Kinh,
Trung Quốc). Hệ thống Mx3000P qPCR được thu thập từ
Stratagene (La Jolla, CA, USA).
chiết DNA. Chiết DNA được thực hiện bằng cách sử dụng
bộ mô QIAamp DNA FFPE (Qiagen). Các mô được
phân thành các lát (10 mm). Nồng độ và độ tinh khiết của
các DNA sau đó được đo lường theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất.
qPCR. Khối lượng phản ứng PCR (20 ml) bao gồm 0,3 ml Taq
DNA polymerase, 0,4 ml chất nền dNTP, 2,4 ml Mg
2+
, 2.0 ml
đệm và 3,0 μlDNA. Các mồi đã thu được từ
thời gian thực kit PCR usedand số cửa hàng của họ là
Q / HDYKB007. Các điều kiện đi xe đạp như sau: 95C
trong 5 phút, tiếp theo là 45 chu kỳ của 95C trong 30 giây, 60c cho
30 giây và 72˚C trong 45 giây, với tổng số 40 chu kỳ.
3 phân tích. Gen Her-2 đã được khuếch đại với FISH kép màu
(gen kit 2 cô-real-time PCR, Quảng Châu LBP Medical
Science Technology Co., Ltd., Quảng Châu, Trung Quốc)
theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Một thời gian ngắn,
lai đệm, một tàu thăm dò DNA và nước tinh khiết được
ly tâm và sau đó đun nóng đến 65˚C qua đêm trong một cốc nước.
phần Tissue (4 micron) được đặt trên slide và đắm mình
trong một bồn tắm biến tính (2X SSC) trong 5 phút ở 73C, tiếp
do mất nước trong việc tăng nồng độ ethanol và sau đó
sấy khô. Các slide được ủ với các thăm dò tại 42c cho
30 phút. Sau đó các slide đã được rửa sạch với 0.4X SSC / 0.3%
NP-40 trong 2 phút, không khí khô trong bóng tối, counterstained với
4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) và được phủ bằng một
nắp trượt. Các trang trình bày đã được quan sát dưới một Olympus BX51
huỳnh quang kính hiển vi (Shanghai Pooher quang
Technology Co., Ltd., Thượng Hải, Trung Quốc) được trang bị một
máy ảnh kỹ thuật số. Một tế bào được coi là được khuếch đại khi
một cụm định của> 10 tín hiệu cho Her-2 đã được tìm thấy. Được biết đến
các tế bào tích cực và tiêu cực đã được sử dụng như điều khiển cho mỗi
xét nghiệm FISH. Khuếch đại gen đã được ghi khi ≥20 ung thư
nhân tế bào trưng bày một cô 2 / CEP17 tỷ lệ ≥2, hoặc khi một-2 cô
chùm tín hiệu đã được quan sát (9).
IHC điểm. 4 micromet thicktissue đoạn ác tính
tế bào khối u trên các slide được nhuộm với nhuộm nâu
Hình 1. Kết quả của phản ứng chuỗi polymerase định lượng. (A) Internal đường cong đáp ứng điều khiển. Chấm đỏ đại diện cho sự kiểm soát nội bộ (Ct = 26,8), dấu chấm màu xanh
đại diện cho chứng dương (Ct = 25,3), dấu chấm màu xanh lá cây đại diện cho chứng âm (Ct = 0). (B) Phát hiện-2 của cô, đường cong phản ứng tiêu cực. Chấm đỏ đại diện cho mẫu
(Ct = 29,0), dấu chấm màu xanh đại diện chứng dương (Ct = 25,5), dấu chấm màu xanh lá cây đại diện cho chứng âm (Ct = 0). (C) Phát hiện-2 của cô, đường cong phản ứng tích cực. Red
chấm đại diện cho mẫu (Ct = 29,0), dấu chấm màu xanh đại diện chứng dương (Ct = 25,5), dấu chấm màu xanh lá cây đại diện cho chứng âm (Ct = 0). Her-2, tăng trưởng biểu bì nhân
tố thụ 2.
AB
C
NGHIỆM VÀ THUỐC ĐIỀU TRỊ 8: 1501-1507, 2014 1503
(Zymed Corporation, Inc., San Francisco, CA, USA). Br iefly,
phần đã được deparaffinized trong xylene và hydrat trong
rượu cấp. Việc thu hồi kháng nguyên đã được thực hiện bằng cách sử dụng
phương pháp hấp ướt trong sự hiện diện của bộ đệm citrate
pH 6.0. Các phần được ủ qua đêm ở tiểu học
kháng thể ở độ pha loãng 1: 100 trong việc ngăn chặn đệm tại 4C. Các
phần đã được nhuộm màu bằng cách sử dụng một Polin-2 cộng với Polymer HRP
Detection System (ZSBIO, Bắc Kinh, Trung Quốc). Nâu mạnh
nhuộm trong màng tế bào của các tế bào khối u ác tính chỉ tích cực trong phương pháp nhuộm này. Các HercepTest ™
Hướng dẫn Giải thích (10) đã được sử dụng để lớp màng
nhuộm. Các nhuộm được ghi là âm tính (0) khi không
nhuộm màng đã được quan sát thấy hoặc khi màng được
nhuộm màu trong ≤10% của các tế bào khối u, yếu dương (+) nếu tiêu cự
màng được nhuộm trong ≥10% của các tế bào khối u, intermediately
dương ( ++) nếu màng hoàn chỉnh được một cách yếu ớt, vừa
nhuộm màu trong ≥10% của các tế bào khối u và (+++) nếu mạnh mẽ tích cực
màng hoàn chỉnh đã được đậm màu trong ≥10% các khối u
tế bào.
phân tích thống kê. Dữ liệu được tính toán bằng cách sử dụng SPSS Softwa