Cell Culture and Experimental Desig

Cell Culture and Experimental Design
Porcine alveolar macrophages were cultured in 48- or 96-well plastic tissue culture plates at a density of 6 × 104 cells/well in a 48-well plate and 1 × 104 cells/well in a 96-well plate. All plates were incubated overnight at 37°C in a humidified 5% CO2 incubator to allow macrophages to attach to the bottom. The nonadherent cells were washed away with warm Hank’s balanced salt solution (pH of 6.8; 37°C). Adhered macrophages were treated in triplicate with fresh culture medium RPMI-1640 with FBS and antibiotics (pH of 7.0; 37°C) containing different stimulators as described below. After 24 h more of incubation, the supernatants in triplicates were collected, pooled, and stored at −80°C for cytokine analysis.

This experiment contained 7 individual in vitro assays for testing 7 plant extracts with the same experimental design. The experimental design was a 2 (without or with 1 μg of LPS/mL) × 5 (5 different amounts of each plant extract) factorial arrangement in a randomized complete block design. Therefore, there were a total of 10 treatments for each plant extract. The negative control was the treatment without either plant extract or LPS, and the positive control was the treatment without plant extracts but with LPS. The amounts of anethol, capsicum oleoresin, carvacrol, eugenol, and garlicon tested in this experiment were 0, 25, 50, 100, and 200 μg/mL. The doses of cinnamaldehyde used in this experiment were adjusted to 0, 2.5, 5, 10, and 20 μg/mL according to Chao et al. (2008) and a preliminary experiment. The preliminary experiment found that high doses of cinnamaldehyde were toxic to porcine alveolar macrophages, as 50, 100, and 200 μg/mL of cinnamaldehyde reduced cell viability to 16%, 12%, and 4% respectively. In addition, the amounts of turmeric oleoresin used in this assay were reduced to 0, 2.5, 5, 10, and 20 μg/mL because of the difficulty of dissolving turmeric oleoresin in both DMSO and culture medium.

Kết quả (Việt) 1:

Văn hóa tế bào và thử nghiệm thiết kếPorcine phế nang đại thực bào được nuôi cấy trong 48 hay 96 giếng tấm nhựa mô nền văn hóa tại với mật độ là 6 × 104 tế bào/tốt trong một tấm 48-tốt và 1 × 104 tế bào/tốt trong một tấm 96-Vâng. Tất cả các tấm đã được ủ qua đêm ở 37° C trong một lồng ấp 5% CO2 ẩm để cho phép các đại thực bào để đính kèm phía dưới. Nonadherent tế bào đã cuốn trôi với Hank ấm áp của cân bằng dung dịch muối (pH 6.8; 37 ° C). Đại thực bào tuân đã được điều trị trong triplicate với thuốc kích thích khác nhau có chứa tươi văn hóa Trung RPMI-1640 với FBS và thuốc kháng sinh (pH 7,0; 37 ° C) như mô tả dưới đây. Sau 24 h hơn ấp, supernatants trong triplicates được thu thập, tới, và được lưu trữ ở −80 ° C trong cytokine phân tích.Thử nghiệm này bao gồm 7 thử nghiệm cá nhân trong ống nghiệm để thử nghiệm 7 nhà máy chiết xuất với thiết kế thử nghiệm tương tự. Thử nghiệm thiết kế là một 2 (mà không có hoặc với 1 μg LPS/mL) x 5 (5 số tiền khác nhau của mỗi chiết xuất thực vật) giai thừa sắp xếp trong một thiết kế chặn hoàn toàn ngẫu nhiên. Vì vậy, đã có tổng cộng 10 phương pháp điều trị cho mỗi nhà máy chiết xuất. Kiểm soát tiêu cực đã là điều trị mà không có chiết xuất thực vật hoặc LPS, và kiểm soát tích cực là điều trị không có chiết xuất thực vật nhưng với LPS. Số tiền của anethol, capsicum oleoresin, carvacrol, eugenol và garlicon được thử nghiệm trong thử nghiệm này là 0, 25, 50, 100, và 200 μg/mL. Liều cinnamaldehyde được sử dụng trong thử nghiệm này đã được điều chỉnh để 0, 2.5, 5, 10 và 20 μg/mL theo một thử nghiệm sơ bộ và Chao et al. (năm 2008). Các thử nghiệm sơ bộ thấy rằng liều cao cinnamaldehyde độc hại đến phế nang porcine đại thực bào, như 50, 100, và 200 μg/mL cinnamaldehyde giảm khả năng di động đến 16%, 12% và 4% tương ứng. Ngoài ra, một lượng nghệ oleoresin được sử dụng trong khảo nghiệm này đã được giảm xuống còn 0, 2.5, 5, 10 và 20 μg/mL vì những khó khăn của hòa tan nghệ oleoresin trong văn hóa vừa và DMSO.

Kết quả (Việt) 2:

Di động văn hóa và thực nghiệm Thiết kế
lợn đại thực bào phế nang được nuôi cấy trong 48- hoặc 96-cũng tấm nhựa nuôi cấy mô với mật độ 6 × 104 tế bào / trong một tấm 48 giếng và 1 × 104 tế bào / trong một tấm 96 giếng . Tất cả các tấm được ủ qua đêm ở 37 ° C trong CO2 5% ấp ẩm để cho phép các đại thực bào để gắn vào phía dưới. Các tế bào nonadherent bị cuốn trôi với dung dịch muối cân bằng ấm của Hank (pH 6,8; 37 ° C). Đại thực bào tôn được điều trị trong ba lần với môi trường nuôi cấy tươi RPMI-1640 với FBS và thuốc kháng sinh (pH 7,0; 37 ° C) có chứa chất kích thích khác nhau như mô tả dưới đây. Sau 24 h nhiều ấp, nước nổi ở triplicates được thu thập, gộp lại, và lưu trữ ở -80 ° C để phân tích cytokine. Thí nghiệm này chứa 7 cá nhân trong các thử nghiệm in vitro để thử nghiệm 7 nhà máy chiết xuất với thiết kế thí nghiệm như nhau. Các thiết kế thí nghiệm là 2 (không có hoặc có 1 mg LPS / mL) x 5 (5 số tiền khác nhau của mỗi chiết xuất thực vật) sắp xếp thừa trong một khối hoàn toàn ngẫu nhiên. Vì vậy, đã có tổng cộng 10 phương pháp điều trị cho từng chiết xuất thực vật. Việc kiểm soát tiêu cực là điều trị mà không hoặc chiết xuất thực vật hoặc LPS, và kiểm soát tích cực là điều trị mà không chiết xuất thực vật, nhưng với LPS. Số tiền của anethol, ớt nhựa dầu, carvacrol, eugenol, và garlicon thử nghiệm trong thí nghiệm này là 0, 25, 50, 100, và 200 mg / ml. Các liều cinnamaldehyde sử dụng trong thí nghiệm này đã được điều chỉnh về 0, 2,5, 5, 10, và 20 mg / mL theo Chao et al. (2008) và một thí nghiệm sơ bộ. Thí nghiệm sơ bộ thấy rằng liều cao cinnamaldehyde là độc hại đối với các đại thực bào phế nang lợn, 50, 100, và 200 mg / mL cinnamaldehyde giảm khả năng di động đến 16%, 12%, và 4%. Ngoài ra, số tiền của nghệ nhựa dầu được sử dụng trong thí nghiệm này đã được giảm xuống 0, 2,5, 5, 10, và 20 mg / mL vì những khó khăn của hòa tan bột nghệ nhựa dầu trong cả hai DMSO và môi trường nuôi cấy.