This paper describes meth­ods to pr

This paper describes meth­ods to pro­duce an iso­to­pi­cally labeled 23kDa viral mem­brane pro­tein with
puri­fied yield of 20mg/L of Esch­e­richia coli shake flask cul­ture. This yield is suf­fi­cient for NMR struc­tural
stud­ies and the pro­tein pro­duc­tion meth­ods are sim­ple, straight­for­ward, and rapid and likely appli­ca­ble
to other recombinant mem­brane pro­teins expressed in E. coli. The tar­get FHA2 pro­tein is the full ecto­domain
con­struct of the influ­enza virus hem­ag­glu­ti­nin pro­tein which cat­a­lyzes fusion between the viral and
the cel­lu­lar endo­somal mem­branes dur­ing infec­tion. The high yield of FHA2 was achieved by: (1) ini­tial
growth in rich medium to A600»8 fol­lowed by a switch to min­i­mal medium and induc­tion of pro­tein
expres­sion; and (2) obtain­ing pro­tein both from puri­fi­ca­tion of the deter­gent-sol­u­ble lysate and from
sol­u­bi­li­za­tion, puri­fi­ca­tion, and refold­ing of inclu­sion bodies. The high cell den­sity was achieved after
opti­mi­za­tion of pH, oxy­gen­a­tion, and car­bon source and con­cen­tra­tion, and the refold­ing pro­to­col was
opti­mized using cir­cu­lar dichro­ism spec­tros­copy. For a sin­gle res­i­due of mem­brane-asso­ci­ated FHA2 that
was obtained from puri­fi­ca­tion and refold­ing of inclu­sion bodies, native con­for­ma­tion was ver­i­fied by the 13CO chem­i­cal shifts mea­sured using solid-state nuclear mag­netic res­o­nance spec­tros­copy

Kết quả (Việt) 1:

Bài báo này mô tả các phương pháp để sản xuất một protein màng virus có nhãn isotopically 23kDa vớitinh khiết sản lượng của 20mg/L Escherichia coli lắc bình văn hóa. Sản lượng này là đủ cho NMR cấu trúcnghiên cứu và phương pháp sản xuất protein rất đơn giản, đơn giản, và nhanh chóng và có khả năng áp dụngkhác với protein tái tổ hợp màng bày tỏ trong E. coli. Mục tiêu FHA2 protein là ectodomain đầy đủxây dựng của cúm virus hemagglutinin protein catalyzes hợp giữa các virus vàCác màng tế bào endosomal trong nhiễm trùng. Năng suất cao của FHA2 đã được thực hiện bởi: ban đầu (1)tăng trưởng trong các phương tiện phong phú để A600» 8 theo một chuyển đổi phương tiện truyền thông tối thiểu và cảm ứng của proteinbiểu hiện; và (2) có được protein từ thanh lọc của tan chất tẩy rửa lysate và từsolubilization, làm sạch, và refolding của các cơ quan bao gồm. Mật độ cao di động đã được thực hiện sau khitối ưu hóa nguồn pH, oxy hóa, và carbon, tập trung và các giao thức refolding làtối ưu hóa bằng cách sử dụng dichroism tròn phổ học. Cho một dư lượng duy nhất của FHA2 liên quan đến màng mànhận được từ làm sạch và refolding của các cơ quan bao gồm, conformation bản xứ đã được xác minh bởi những thay đổi hóa học 13CO được đo bằng cách sử dụng phổ học cộng hưởng từ hạt nhân trạng thái rắn

Kết quả (Việt) 2:

Bài viết này mô tả các phương pháp để sản xuất một protein 23kDa màng virus isotopically nhãn với
sản lượng tinh khiết 20mg / L của Escherichia coli lắc văn hóa bình. Sản lượng này đủ để cấu NMR
nghiên cứu và các phương pháp sản xuất protein đơn giản, dễ dàng, và nhanh chóng và khả năng áp dụng
vào các protein tái tổ hợp màng khác được thể hiện trong E. coli. Các protein mục tiêu FHA2 là ectodomain đầy đủ
cấu trúc của protein hemagglutinin vi rút cúm này xúc tác phản ứng tổng hợp giữa virus và
màng tế bào nội mô trong quá trình nhiễm. Năng suất cao FHA2 đã đạt được bằng cách: (1) ban đầu
tăng trưởng trong môi trường giàu A600 »8 theo sau là một switch để môi trường tối thiểu và cảm ứng của protein
biểu hiện; và (2) có được từ cả hai protein tinh sạch của lysate chất tẩy rửa-tan và từ
hòa tan, lọc, và refolding các thể vùi. Mật độ tế bào cao đã đạt được sau khi
tối ưu hóa của pH, oxy hóa, và nguồn carbon và nồng độ, và các giao thức refolding đã được
tối ưu hóa bằng cách sử dụng hình tròn lưỡng sắc quang phổ. Đối với một dư lượng duy nhất của FHA2 màng gắn liền với nó
được thu thập từ thanh lọc và refolding các thể vùi, cấu tạo bản địa đã được xác nhận qua sự dịch chuyển hóa học 13CO đo sử dụng SSD phổ cộng hưởng từ hạt nhân