For the construction of nuclear gen

For the construction of nuclear genomic libraries, nuclear-en-riched DNA was isolated from 40 g of young fresh leaf tissue.
This was cut in small pieces, soaked for 2 rain in cold diethyl ether, and ground with a Waring blender homogenizer (5 x 3 s, low speed) in 100 ml of extraction buffer [0.4 M sucrose, 0.05 M Tris-HC1 pH 8, 2mM CaC12, 0.03% ~ mercaptoethanol (v/v)l.
The resulting suspension was filtered through a 150-pm-mesh nylon net, then through a 48 gm~mesh nylon net, and finally
centrifuged for 10min at 400g. The pellet was gently resuspended in 10 ml of buffer A (0.25 M sucrose, 0.05 M Tris-HClpH 8, 2 mM CaC12). The solution was carefully layered over 3 vol of a sucrose buffer (2 M sucrose, 0.05 M Tris-HC1 pH 8, 2 mM CaCla) contained in a soft Teflon tube. Ultracentrifugation was performed in a swing rotor for 45 rain at 30,000 g. The resulting pellet was dispersed in 10 ml of buffer A with a smooth brush, and the suspension was centrifuged for 10rain at 1,600 g.
All the previous steps were performed at 4 ~ Nucleus enrichment was checked by microscopic examination after DAPI (4',6-diami-dino-2-phenyl-indole) staining. For nuclear lysis, the pellet was resuspended in 10ml of buffer B (150raM NaCI, 10raM EDTA, 50raM Tris-HC1 pH 7.5,2% SDS) and incubated for 30 min at 65 ~ Nuclear debris was pelleted by centrifugation for 30 min at 4000 g. NaC1 was added to the supernatant to a final concentration of 1.4M. A 1/10 vol of CTAB (mixed alkyl-trimethylammonium bromide) solution (10% CTAB, 500mM Tris-HC1 pH 8, 100 mM EDTA) was then added and the mixture was incubated with gentle stirring for 10rain at 65 ~ One volume of chloroform:isoamylalcohot (24:1) was added and, after mixing, the solution was centrifuged for 5 min at 3,500 g at 20 ~ The supernatant was mixed with 2.5 vol of ethanol to
precipitate high-molecular-weight DNA which was then washed in 76% ethanol-0.2 M NaOAc and resuspended in TE (10 mM Tris-HC1 pH 8, 1 mM EDTA pH 8). RNase digestion was performed for 45min at 37~ A final standard phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1) extraction was carried out to further purify the DNA. Nuclear DNA was digested with either
EcoRI or PstI and was then size-separated on a 10 40% sucrose gradient (Sambrook et al. 1989). Two ligation reactions were performed according to insert size range (0.7-2 kb, 2.5-5kb). Fragments were ligated into pBluescript or pUC18 plasmids (insert 3 : plasmid 1) following the manufacturer's instructions for T4 DNA ligase (BRL). DH5~ bacterial cells were then transformed with ligated plasmids (Chung and Miller 1988) and selection of transformed colonies was performed following X-
Gal and IPTG screening procedures. Plasmid minipreparations
were according to Birnboim and Doly (1979). The libraries were
screened for copy number by probing total DNA onto Southern
blots of the probes. A wheat rDNA unit repeat clone (Gerlach
and Bedbrook 1979) and pea Adh clone (Llewellyn et al. 1987)
were used as intensity controls. The probes were classified into
two categories based on the relative intensity of the detected
signal. Clones were named pMaCIR#. Numbers greater than
1000 corresponded to the EcoRI library probes. Insert size was
determined relative to a Raoul (Appligene) molecular weight
marker using a computer-driven autoradiograph digitizer
(Hoisington and Gonzfilez de Ledn, in preparation).
For Southern and PCR analyses, total DNA was extracted
according to Dellaporta et al. (1983), with modifications by
Cordesse et al. (1990). The DNAs of nine banana clones (SF265,
Banksii, and seven individuals representative of M. acuminata
diversity) cut with one of ten restriction enzymes, were surveyed
for restriction polymorphism using 13 genomic probes (data not
shown). EcoRV and DraI were selected for the mapping work.
Digestions were performed according to supplier's recommenda-
tions (BRL), but with 2.5 units/gg DNA of restriction enzyme.
Restricted DNA (10gg/lane) was separated in 0.8~-TAE
agarose gels at 1.04 V/cm for 9 h. The gels were depurinated in 0.25 N HC1 for 10 min, denatured in 0.4 N NaOH for 30 min, and then blotted onto Hybond N + membranes (Amersham).
Probes were labeled with a2p-c~dCTP using the random primer labelling method of Feinberg and Vogelstein (1983).
Incorporation of radioactive nucleotides was checked by chromatography on PEI-cellulose F. Prehybridization, hybridization and washes were performed in a hybridization o

Kết quả (Việt) 1:

Xây dựng thư viện hạt nhân gen, ADN hạt nhân-en-riched là bị cô lập từ 40 g lá tươi trẻ mô. Điều này đã được cắt miếng nhỏ, ngâm cho 2 mưa lạnh dietyl ete và mặt đất với một homogenizer máy xay sinh tố Waring (5 x 3 s, tốc độ thấp) trong 100 ml của khai thác đệm [0.4 M sucrose, 0,05 M Tris-HC1 pH 8, 2mM CaC12, 0,03% ~ l mercaptoethanol (v/v). Đình chỉ kết quả đã được lọc qua một 150-am-lưới nylon net, sau đó thông qua một gm 48 ~ lưới nylon net, và cuối cùng ly cho 10 phút 400 g. Miếng được nhẹ nhàng resuspended trong 10 ml đệm A (0,25 M sucrose, 0,05 M Tris-HClpH 8, 2 mM CaC12). Các giải pháp đã được cẩn thận tầng trên vol 3 một Sucroza đệm (2 M sucrose, 0,05 M Tris-HC1 pH 8, 2 mM CaCla) chứa đựng trong một ống Teflon mềm. Ultracentrifugation được thực hiện trong một rotor swing cho 45 mưa 30.000 g. Kết quả hạt được phân tán trong 10 ml đệm A với một bàn chải mịn, và hệ thống treo được ly cho 10rain tại 1.600 g. Tất cả các bước trước đó đã được thực hiện tại 4 ~ làm giàu hạt nhân đã được kiểm tra bởi vi kiểm tra sau khi nhuộm DAPI (4',6-diami-dino-2-phenyl-indole). Cho hạt nhân lysis, miếng đã được resuspended trong 10ml đệm B (150raM NaCI, 10raM EDTA, 50raM Tris-HC1 pH 7.5,2% SDS) và ủ trong 30 phút tại 65 ~ mảnh vỡ hạt nhân đã được pelleted bởi số cho 30 phút tại 4000 g. NaC1 đã được thêm vào supernatant để cuối cùng nồng độ 1.4M. Một vol 1/10 của giải pháp CTAB (hỗn hợp alkyl-trimethylammonium bromua) (10% CTAB, 500mM Tris-HC1 pH 8, 100 mM EDTA) sau đó đã được bổ sung và hỗn hợp được ủ với nhẹ nhàng khuấy cho 10rain tại 65 ~ một khối lượng cloroform: isoamylalcohot (24:1) đã được thêm vào, và sau khi trộn, các giải pháp được ly trong 5 phút tại 3.500 g tại 20 ~ supernatant được trộn với 2.5 vol ethanol để kết tủa cao trọng phân tử DNA được sau đó được rửa trong 76% ethanol-0,2 M NaOAc và resuspended ở TE (10 mM Tris-HC1 pH 8, 1 mM EDTA pH 8). RNase tiêu hóa được thực hiện cho 45 phút tại 37 ~ khai thác cuối cùng tiêu chuẩn phenol: cloroform: isoamylalcohol (25:24:1) được thực hiện để tiếp tục làm sạch các DNA. DNA hạt nhân được tiêu hóa với một trong hai EcoRI hoặc PstI và sau đó tách ra kích thước trên một gradient 10 40% sucrose (Sambrook et al. 1989). Hai ligation phản ứng đã được thực hiện theo phạm vi kích thước chèn (0,7-2 kb, 2,5-5 kb). Mảnh vỡ đã được ligated vào pBluescript hoặc pUC18 plasmid (chèn 3: plasmid 1) theo hướng dẫn của nhà sản xuất cho T4 DNA ligase (BRL). DH5 ~ tế bào vi khuẩn sau đó đã được chuyển đổi với ligated plasmid (Chung và Miller 1988) và lựa chọn chuyển thuộc địa đã được biểu diễn theo X - Gal và IPTG kiểm tra thủ tục. Plasmid minipreparations đã theo Birnboim và Doly (1979). Các thư viện chiếu cho bản sao số của thăm dò tất cả DNA lên miền Nam Blots của các đầu dò. Lặp lại một đơn vị lúa mì rDNA clone (Gerlach và Bedbrook năm 1979) và hạt đậu Adh clone (Llewellyn et al. 1987) được sử dụng như điều khiển cường độ. Các thăm dò đã được phân loại thành hai loại dựa trên cường độ tương đối của các phát hiện tín hiệu. Nhái đã được đặt tên là pMaCIR #. Con số lớn hơn 1000 tương ứng với EcoRI thư viện thăm dò. Chèn thước xác định tương ứng với một trọng lượng phân tử Raoul (Appligene) đánh dấu bằng cách sử dụng một máy tính điều khiển autoradiograph digitizer Hoisington và Gonzfilez de Ledn, để chuẩn bị. Đối với Nam và các phân tích PCR tất cả DNA được chiết xuất theo để Dellaporta et al. (1983), với các sửa đổi bởi Cordesse et al. (1990). DNAs chín chuối nhái (SF265, Banksii, và bảy cá nhân đại diện của M. acuminata sự đa dạng) cắt với một trong số mười enzyme giới hạn, đã được khảo sát để hạn chế đa hình bằng cách sử dụng 13 gen đầu dò (dữ liệu không Hiển thị). EcoRV và DraI đã được chọn cho công việc lập bản đồ. Digestions đã được thực hiện theo nhà cung cấp của recommenda- tions (BRL), nhưng với 2.5 đơn vị/gg DNA của hạn chế enzyme. Hạn chế DNA (10gg/lane) được tách ra trong 0,8 ~-TAE gel agarose tại 1,04 V/cm cho 9 h. Các gel là depurinated trong 0,25 N HC1 cho 10 phút, denatured trong cách 0.4 N NaOH trong 30 phút, và sau đó blotted lên Hybond N + màng (Amersham). Đầu dò được gắn nhãn với a2p-c ~ dCTP bằng cách sử dụng mồi ngẫu nhiên nhãn mác các phương pháp của Feinberg và Vogelstein (1983). Kết hợp phóng xạ nucleotide đã được kiểm tra bằng sắc kí trên PEI-cellulose F. Prehybridization, lai ghép và rửa được thực hiện trong một o lai

Kết quả (Việt) 2:

Đối với việc xây dựng thư viện gen hạt nhân, DNA hạt nhân-en-riched được phân lập từ 40 g mô lá tươi trẻ.
Điều này đã được cắt ra từng mảnh nhỏ, ngâm trong 2 mưa trong ête diethyl lạnh, và mặt đất với một máy xay sinh tố đồng hóa Waring (5 x 3 s, tốc độ thấp) trong 100 ml dung dịch đệm chiết [0,4 M sucrose, 0,05 M Tris-HC1 pH 8, 2mm CaC12, 0,03% ~ mercaptoethanol (v / v) l.
Việc đình chỉ kết quả được lọc qua một 150-am -mesh nylon net, sau đó thông qua một 48 gm ~ lưới nylon ròng, và cuối cùng là
ly tâm cho 10min tại 400g. Các viên đã nhẹ nhàng lơ lửng trong 10 ml dung dịch đệm A (0,25 M sucrose, 0,05 M Tris-HClpH 8, 2 mM CaC12). Giải pháp đã được lớp cẩn thận hơn 3 vol của một bộ đệm sucrose (2 M sucrose, 0,05 M Tris-HC1 pH 8, 2 mM CaCla) chứa trong một ống Teflon mềm. Siêu ly tâm đã được thực hiện trong một cánh quạt xoay 45 mưa ở 30.000 g. Các viên kết quả đã được phân tán trong 10 ml dung dịch đệm A với một bàn chải mịn, và hệ thống treo được ly tâm cho 10rain tại 1.600 g.
Tất cả các bước trước đó đã được thực hiện tại 4 ~ Nucleus làm giàu được kiểm tra bằng kính hiển vi sau DAPI (4 ', 6 -diami-khủng long-2-phenyl-indol) nhuộm. Đối với ly giải hạt nhân, viên đang lơ lửng trong 10ml đệm B (150raM Naci, 10raM EDTA, 50raM Tris-HC1 pH 7.5,2% SDS) và ủ trong 30 phút ở 65 ~ mảnh vỡ hạt nhân đã được ăn viên bằng cách ly tâm trong 30 phút ở 4000 g. NaC1 đã được thêm vào nổi đến một nồng độ cuối cùng của 1.4M. Một vol 1/10 CTAB (hỗn hợp alkyl-trimethylamoni bromide), giải pháp (10% CTAB, 500mm Tris-HC1 pH 8, 100 mM EDTA) sau đó được thêm vào và hỗn hợp được ủ với khuấy nhẹ nhàng cho 10rain 65 ~ Một khối lượng chloroform: isoamylalcohot (24: 1) đã được bổ sung và, sau khi trộn, các giải pháp được ly tâm trong 5 phút ở 3.500 g ở 20 ~ sự nổi được trộn với 2,5 vol ethanol để
kết tủa DNA trọng lượng phân tử cao sau đó được rửa sạch trong 76% ethanol 0,2 M NaOAc và lơ lửng trong TE (10 mM Tris-HC1 pH 8, 1 mM EDTA pH 8). RNase tiêu hóa đã được thực hiện cho 45min ở 37 ~ Một phenol tiêu chuẩn cuối cùng: chloroform: isoamylalcohol (25: 24: 1) khai thác được thực hiện để làm sạch thêm DNA. DNA hạt nhân đã được tiêu hóa với một trong hai
EcoRI hoặc PstI và sau đó đã được kích thước phân cách trên một gradient sucrose 10 40% (Sambrook và cộng sự. 1989). Hai phản ứng thắt đã được thực hiện theo nhiều kích thước chèn (0,7-2 kb, 2.5-5kb). Những mảnh vỡ được gắn vào pBluescript hoặc pUC18 plasmid (chèn 3: plasmid 1) theo hướng dẫn của nhà sản xuất cho T4 DNA ligase (BRL). DH5 ~ tế bào vi khuẩn này sau đó được chuyển đổi với plasmid ligated (Chung và Miller 1988) và lựa chọn của các thuộc địa biến đổi đã được thực hiện sau đây X-
Gal và thủ tục kiểm tra IPTG. Minipreparations plasmid
là theo Birnboim và Doly (1979). Các thư viện đã được
chiếu cho số lượng bản sao bằng cách thăm dò DNA tổng số lên miền Nam
blots của đầu dò. Một rDNA mì đơn vị lặp lại clone (Gerlach
và Bedbrook 1979) và hạt đậu ADH clone (Llewellyn et al. 1987)
đã được sử dụng như điều khiển cường độ. Các đầu dò được phân thành
hai loại dựa vào cường độ tương đối của các phát hiện
tín hiệu. Dòng vô tính đã được đặt tên pMaCIR #. Số lớn hơn
1000 tương ứng với các thiết bị thăm dò thư viện EcoRI. Chèn kích thước được
xác định tương đối với một Raoul (Appligene) trọng lượng phân tử
đánh dấu bằng một số hóa autoradiograph máy tính điều khiển
(Hoisington và Gonzfilez de Ledn, để chuẩn bị).
Đối với miền Nam và PCR phân tích, tổng DNA được chiết xuất
theo Dellaporta et al. (1983), với sửa đổi bởi
Cordesse et al. (1990). Các DNA trong chín nhái chuối (SF265,
Banksii, và bảy cá nhân đại diện của M. acuminata
đa dạng) cắt bằng một trong mười enzim giới hạn, đã được khảo sát
để hạn chế tính đa hình sử dụng 13 đầu dò gen (dữ liệu không
hiển thị). EcoRV và Drai đã được lựa chọn cho công việc lập bản đồ.
Phá mẫu được thực hiện theo khuyến cáo của nhà cung cấp
tions (BRL), nhưng với 2,5 đơn vị / DNA gg của enzyme giới hạn.
Restricted DNA (10gg / làn) được tách ra trong 0,8 ~ -TAE
gel agarose tại 1.04 V / cm cho 9 h. Các gel được depurinated trong 0,25 N HC1 trong 10 phút, biến tính trong 0,4 N NaOH trong 30 phút, và sau đó xoá nhoà vào Hybond N + màng (Amersham).
Đầu dò được dán nhãn A2P-c ~ dCTP sử dụng phương pháp ghi nhãn mồi ngẫu nhiên của Feinberg và Vogelstein (1983).
Kết hợp nucleotide phóng xạ được kiểm tra bằng phương pháp sắc ký trên PEI-cellulose F. Prehybridization, lai tạo và rửa được thực hiện trong một o lai