Plasmid minipreparationswere accord

Plasmid minipreparations
were according to Birnboim and Doly (1979). The libraries were
screened for copy number by probing total DNA onto Southern
blots of the probes. A wheat rDNA unit repeat clone (Gerlach
and Bedbrook 1979) and pea Adh clone (Llewellyn et al. 1987)
were used as intensity controls. The probes were classified into
two categories based on the relative intensity of the detected
signal. Clones were named pMaCIR#. Numbers greater than
1000 corresponded to the EcoRI library probes. Insert size was
determined relative to a Raoul (Appligene) molecular weight
marker using a computer-driven autoradiograph digitizer
(Hoisington and Gonzfilez de Ledn, in preparation).
For Southern and PCR analyses, total DNA was extracted
according to Dellaporta et al. (1983), with modifications by
Cordesse et al. (1990). The DNAs of nine banana clones (SF265,
Banksii, and seven individuals representative of M. acuminata
diversity) cut with one of ten restriction enzymes, were surveyed
for restriction polymorphism using 13 genomic probes (data not
shown). EcoRV and DraI were selected for the mapping work.
Digestions were performed according to supplier's recommendations
(BRL), but with 2.5 units/gg DNA of restriction enzyme.
Restricted DNA (10gg/lane) was separated in 0.8~-TAE
agarose gels at 1.04 V/cm for 9 h. The gels were depurinated in
0.25 N HC1 for 10 min, denatured in 0.4 N NaOH for 30 min, and
then blotted onto Hybond N + membranes (Amersham).
Probes were labeled with a2p-c~dCTP using the random
primer labelling method of Feinberg and Vogelstein (1983).
Incorporation of radioactive nucleotides was checked by
chromatography on PEI-cellulose F. Prehybridization, hybridization
and washes were performed in a hybridization oven
(Applig6ne). One or two membranes were placed in a glass tube
and the following buffer was added: 6 x SSPE, 0.5~SDS,
5 x Denhart, and 25 gg/ml of sheared herring sperm DNA. For
hybridization, this buffer was supplemented with dextran sulphate
to a final concentration of 8~o (w/v). Membranes were
washed at 68 ~ for 30 min in each of the following buffers:
2 x SSPE, 2 x SSPE-0.1~'SDS, 0.1 x SSPE-0.1 SDS. They were
then exposed to X-ray film (Kodak X-OMAT) at -80 ~ for 4
days with one intensifying screen. Blots were stripped in 1~o SDS
at 68 ~ for 30min and could be re-used up to 12 times.
Clones of known 9enes
The origin and source of the clones of known genes used in this
study are given in Table 2.
Isozyme analysis
The F 2 population was assessed for allozymic segregation in the
following enzyme systems: malate dehydrogenase (MDH, E.C.
1.l.1.37), cathodic peroxidase (POX, E.C. 1.11.17), phosphoglucomutase
(PGM, E.C. 2.7.5.1), phosphoglucoisomerase (PGI,
519
E.C. 5.3.1.9), shikimate dehydrogenase (SKDH, E.C. 1.1.1.25),
acid phosphatase (ACP, E.C. 3.1.3.2), and esterase (EST,
E.C. 3.1.1.2). Extraction buffer, electrophoresis and staining were
according to Horry (1989).
RAPD analysis
A modified version of the protocol of Williams et al. (1990) was
applied. Amplification reaction were performed in 25 gl volumes
containing magnesium-free 1 x Taq DNA buffer (Promega),
0.2 mM dNTP mix (Pharmacia), 0.2 gM primer (Operon Technologies,
Inc.; kits D, K, L, M, O, P and S), two units of Taq DNA
polymerase (Promega), 2raM MgC12 and 115ng of genomic
DNA, overlaid with one drop of pure mineral oil. Amplification
were carried out in a Perkin Elmer- Cetus DNA thermal cycler
programmed for one predenaturation cycle of 1 min at 94 ~ and
40 cycles of 1 rain denaturation at 94 ~ 1 min annealing at 36 ~
and 2rain elongation at 72~ Amplification products were
analyzed by electrophoresis in 2~-TBE agarose gels at 3.12 V/
cm for 3 h. RAPD loci were named rOPX#, where X is the primer
kit letter and # the number of the primer in the kit. When more
than one band could be scored for a particular primer, a number
was added to identify each locus.
Linkage analysis
Segregation was studied in 82 individuals for RFLP markers, 92
individuals for isozymes, and 89 individuals for RAPD markers.
These discrepancies were due to the loss of some individuals
during the period of study. All data were scored at least twice by
two people.
The segregation of each marker was tested first for goodnessof-
fit to expected Mendelian segregation ratios with a Z ~ test.
Linkage analyses were performed on F 2 segregation data using
Mapmaker V 1.0 (Macintosh) (Lander et al. 1987; Tingey personal
communication). Linkage groups were constructed by
two-point analysis using a minimum LOD score of 4.0 and a
maximal recombination fraction of 0.40. Three-point and multipoint
analyses were then performed using a minimum LOD
score of 3.0 and a maximal recombination fraction of 0.40 to
determine the most likely marker orders inside groups. Recombination
fractions were converted to map distances with the
Haldane mapping function (Haldane 1919).
Results
Library charact

Kết quả (Việt) 1:

Plasmid minipreparationsđã theo Birnboim và Doly (1979). Các thư việnchiếu cho bản sao số của thăm dò tất cả DNA lên miền NamBlots của các đầu dò. Lặp lại một đơn vị lúa mì rDNA clone (Gerlachvà Bedbrook năm 1979) và hạt đậu Adh clone (Llewellyn et al. 1987)được sử dụng như điều khiển cường độ. Các thăm dò đã được phân loại thànhhai loại dựa trên cường độ tương đối của các phát hiệntín hiệu. Nhái đã được đặt tên là pMaCIR #. Con số lớn hơn1000 tương ứng với EcoRI thư viện thăm dò. Chèn thướcxác định tương ứng với một trọng lượng phân tử Raoul (Appligene)đánh dấu bằng cách sử dụng một máy tính điều khiển autoradiograph digitizerHoisington và Gonzfilez de Ledn, để chuẩn bị.Đối với Nam và các phân tích PCR tất cả DNA được chiết xuấttheo để Dellaporta et al. (1983), với các sửa đổi bởiCordesse et al. (1990). DNAs chín chuối nhái (SF265,Banksii, và bảy cá nhân đại diện của M. acuminatasự đa dạng) cắt với một trong số mười enzyme giới hạn, đã được khảo sátđể hạn chế đa hình bằng cách sử dụng 13 gen đầu dò (dữ liệu khôngHiển thị). EcoRV và DraI đã được chọn cho công việc lập bản đồ.Digestions đã được thực hiện theo khuyến cáo của nhà cung cấp(BRL), nhưng với 2.5 đơn vị/gg DNA của hạn chế enzyme.Hạn chế DNA (10gg/lane) được tách ra trong 0,8 ~-TAEgel agarose tại 1,04 V/cm cho 9 h. Các gel là depurinated trong0,25 N HC1 cho 10 phút, denatured trong cách 0.4 N NaOH trong 30 phút, vàsau đó, blotted lên Hybond N + màng (Amersham).Đầu dò được gắn nhãn với a2p-c ~ dCTP bằng cách sử dụng các ngẫu nhiênmồi nhãn mác các phương pháp của Feinberg và Vogelstein (1983).Kết hợp phóng xạ nucleotide đã được kiểm tra bởisắc kí trên PEI-cellulose F. Prehybridization, lai ghépvà rửa được thực hiện trong lò lai ghép(Applig6ne). Một hoặc hai màng được đặt trong một ống kínhvà các vùng đệm được thêm vào: 6 x SSPE, 0,5 ~ SDS,5 x Denhart, và 25 gg/ml sheared cá trích tinh trùng DNA. Cholai ghép, bộ đệm này được bổ sung với dextran sulphatemột tập trung cuối cùng của 8 ~ o (w/v). Màngrửa sạch tại 68 ~ trong 30 phút trong mỗi bộ đệm sau đây:2 x SSPE, 2 x SSPE-0.1 ~'SDS, 0,1 x SSPE-0.1 SDS. Họ đãsau đó tiếp xúc với phim x-quang (Kodak X-OMAT) -80 ~ 4ngày với tăng cường một màn hình. Blots đã bị tước trong 1 ~ o SDStại 68 ~ trong 30 phút và có thể được tái sử dụng lên đến 12 lần.Nhái được biết đến 9enesXuất xứ và nguồn gốc của nhái được biết gen được sử dụng trong điều nàynghiên cứu được đưa ra trong bảng 2.Isozyme phân tíchDân số F 2 được đánh giá allozymic phân biệt trong cáctheo hệ thống enzym: malate dehydrogenase (MDH, EC1.l.1.37), cathodic peroxidase (POX, EC 1.11.17), phosphoglucomutase(PGM, EC 2.7.5.1), phosphoglucoisomerase (PGI,519EC 5.3.1.9), shikimate dehydrogenase (SKDH, EC 1.1.1.25),phosphatase acid (ACP, EC 3.1.3.2) và esterase (EST,EC 3.1.1.2). Khai thác bộ đệm, electrophoresis và nhuộmtheo Horry (1989).Phân tích RAPDMột phiên bản sửa đổi của các giao thức của Williams et al. (1990)được áp dụng. Khuếch đại phản ứng đã được thực hiện trong 25 gl khối lượngchứa magiê-miễn phí 1 x Taq DNA đệm (Promega),kết hợp cách 0.2 mM dNTP (Pharmacia), cách 0.2 gM mồi (Operon công nghệ,Inc; bộ dụng cụ D, K, L, M, O, P và S), hai đơn vị Taq ADNpolymerase (Promega), 2raM MgC12 và 115ng của genDNA, che với một giọt dầu khoáng tinh khiết. Khuếch đạiđã được thực hiện trong một người đạp xe máy nhiệt Perkin Elmer - kình ngư ADNlập trình cho predenaturation một chu kỳ của 1 min tại 94 ~ và40 chu kỳ 1 mưa denaturation tại 94 ~ 1 min ủ tại 36 ~và 2rain kéo dài 72 ~ khuếch đại sản phẩmphân tích bởi electrophoresis trong 2 ~-gel agarose TBE tại 3.12 V /cm cho 3 h. RAPD loci được đặt tên rOPX #, X là mồiKit chữ và # số mồi trong bộ. Khi thêmhơn một trong những ban nhạc có thể được ghi cho một mồi đặc biệt, một sốđược thêm vào để xác định quỹ tích mỗi.Phân tích mối liên hệPhân biệt được nghiên cứu trong các cá nhân 82 cho dấu hiệu RFLP, 92cá nhân cho isozymes, và cá nhân 89 RAPD đánh dấu.Những sai lệch này là do sự mất mát của một số cá nhântrong giai đoạn nghiên cứu. Tất cả dữ liệu đã ghi được ít nhất hai lần bởihai người.Sự phân biệt của mỗi điểm đánh dấu được thử nghiệm đầu tiên cho goodnessof-phù hợp với mong đợi Mendelian phân biệt tỷ lệ với một Z ~ kiểm tra.Phân tích mối liên hệ đã được thực hiện trên F 2 tách dữ liệu bằng cách sử dụngMapmaker V 1.0 (Macintosh) (Lander et al. 1987; Tingey cá nhânthông tin liên lạc). Các nhóm liên kết đã được xây dựng bởihai điểm phân tích sử dụng tối thiểu điểm LOD 4.0 và agen tối đa các phần nhỏ của 0,40. Ba điểm và đaphân tích sau đó đã được thực hiện bằng cách sử dụng tối thiểu LODđiểm của 3.0 và một phần tối đa gen của 0,40 đểxác định các đơn đặt hàng nhiều khả năng đánh dấu bên trong nhóm. Genphân số được cải biến để lập bản đồ các khoảng cách với cácChức năng lập bản đồ Haldane (Haldane 1919).Kết quảThư viện charact

Kết quả (Việt) 2:

Minipreparations plasmid
là theo Birnboim và Doly (1979). Các thư viện đã được
chiếu cho số lượng bản sao bằng cách thăm dò DNA tổng số lên miền Nam
blots của đầu dò. Một rDNA mì đơn vị lặp lại clone (Gerlach
và Bedbrook 1979) và hạt đậu ADH clone (Llewellyn et al. 1987)
đã được sử dụng như điều khiển cường độ. Các đầu dò được phân thành
hai loại dựa vào cường độ tương đối của các phát hiện
tín hiệu. Dòng vô tính đã được đặt tên pMaCIR #. Số lớn hơn
1000 tương ứng với các thiết bị thăm dò thư viện EcoRI. Chèn kích thước được
xác định tương đối với một Raoul (Appligene) trọng lượng phân tử
đánh dấu bằng một số hóa autoradiograph máy tính điều khiển
(Hoisington và Gonzfilez de Ledn, để chuẩn bị).
Đối với miền Nam và PCR phân tích, tổng DNA được chiết xuất
theo Dellaporta et al. (1983), với sửa đổi bởi
Cordesse et al. (1990). Các DNA trong chín nhái chuối (SF265,
Banksii, và bảy cá nhân đại diện của M. acuminata
đa dạng) cắt bằng một trong mười enzim giới hạn, đã được khảo sát
để hạn chế tính đa hình sử dụng 13 đầu dò gen (dữ liệu không
hiển thị). EcoRV và Drai đã được lựa chọn cho công việc lập bản đồ.
Phá mẫu được thực hiện theo khuyến cáo của nhà cung cấp
(BRL), nhưng với 2,5 đơn vị / DNA gg của enzyme giới hạn.
Restricted DNA (10gg / làn) được tách ra trong 0,8 ~ -TAE
gel agarose tại 1.04 V / cm cho 9 h. Các gel được depurinated trong
0,25 N HC1 trong 10 phút, biến tính trong 0,4 N NaOH trong 30 phút, và
sau đó xoá nhoà vào Hybond N + màng (Amersham).
Đầu dò được dán nhãn A2P-c ~ dCTP sử dụng ngẫu nhiên
phương pháp ghi nhãn mồi của Feinberg và Vogelstein (1983).
Kết hợp nucleotide phóng xạ được kiểm tra bằng
phương pháp sắc ký trên PEI-cellulose F. Prehybridization, lai tạo
và rửa được thực hiện trong một lò lai
(Applig6ne). Một hoặc hai màng được đặt trong một ống thủy tinh
và các bộ đệm sau đây đã được thêm vào: 6 x SSPE, 0,5 ~ SDS,
5 x Denhart, và 25 gg / ml DNA cá trích tinh trùng xén lông. Đối
lai, đệm này được bổ sung thêm sulphate dextran
đến nồng độ cuối cùng của 8 ~ o (w / v). Màng được
rửa sạch tại 68 ~ 30 phút trong mỗi bộ đệm sau:
2 x SSPE, 2 x SSPE-0,1 ~ 'SDS, 0,1 x SSPE-0.1 SDS. Họ đã được
sau đó tiếp xúc với phim X-ray (Kodak X-OMAT) tại -80 ~ 4
ngày với một màn hình tăng cường. Blots bị tước đoạt trong 1 ~ o SDS
68 ~ 30 phút cho và có thể được tái sử dụng lên đến 12 lần.
Nhái của 9enes gọi
Nguồn gốc và nguồn gốc của các dòng vô tính của gen được biết đến sử dụng trong này
nghiên cứu được đưa ra trong Bảng 2.
Phân tích isozyme
dân số F 2 được đánh giá để phân allozymic trong
hệ thống enzyme sau: dehydrogenase malate (MDH, EC
1.l.1.37), peroxidase catot (POX, EC 1.11.17), phosphoglucomutase
(PGM, EC 2.7.5.1), phosphoglucoisomerase (PGI,
519
E.C. 5.3.1.9), shikimate dehydrogenase (SKDH, EC 1.1.1.25),
phosphatase acid (ACP, EC 3.1.3.2), và esterase (EST,
EC 3.1.1.2-). Đệm chiết, điện di và nhuộm được
theo Horry (1989).
Phân tích RAPD
Một phiên bản sửa đổi của các giao thức của Williams et al. (1990) đã được
áp dụng. Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong 25 gl lượng
có chứa magnesium-free 1 x đệm Taq DNA (Promega),
0,2 mM dNTP sẽ trộn (Pharmacia), 0,2 gm mồi (operon Technologies,
Inc .; bộ D, K, L, M, O, P và S), hai đơn vị Taq DNA
polymerase (Promega), 2raM MgC12 và 115ng của gen
DNA, phủ lên bằng một giọt dầu khoáng tinh khiết. Khuếch đại
được thực hiện trong một chu trình nhiệt Perkin Elmer- Cetus DNA
lập trình cho một chu kỳ predenaturation của 1 phút ở 94 ~ và
40 chu kỳ của 1 cơn mưa biến tính ở 94 ~ 1 phút ủ ở 36 ~
và 2rain kéo dài ở 72 ~ sản phẩm khuếch đại được
phân tích bằng điện trong 2 ~ -TBE gel agarose tại 3.12 V /
cm 3 h. RAPD loci được đặt tên rOPX #, trong đó X là mồi
thư bộ và # số lượng của lớp sơn lót theo bộ. Khi có nhiều
hơn một ban nhạc có thể được ghi bàn cho một mồi riêng, một số
đã được bổ sung để xác định mỗi locus.
Phân tích Linkage
phân biệt được nghiên cứu trong 82 cá nhân cho các dấu RFLP, 92
cá nhân cho isozyme, và 89 cá nhân cho các dấu RAPD.
Những sự khác biệt này là do sự mất mát của một số cá nhân
trong suốt thời gian nghiên cứu. Tất cả các dữ liệu đã ghi được ít nhất hai lần bởi
hai người.
Các phân biệt của mỗi điểm đánh dấu đã được thử nghiệm đầu tiên cho goodnessof-
phù hợp với tỷ lệ phân Mendel dự kiến với một Z ~ thử nghiệm.
Phân tích Linkage được thực hiện trên F 2 dữ liệu phân biệt sử dụng
Map Maker 1.0 V (Macintosh) (Lander et al 1987;. Tingey cá nhân
giao tiếp). Nhóm liên kết được xây dựng bởi
phân tích hai điểm sử dụng một số LOD tối thiểu là 4.0 và một
phần tái tổ hợp tối đa là 0.40. Ba điểm và đa điểm
phân tích sau đó đã được thực hiện sử dụng tối thiểu LOD
điểm 3.0 và một phần tái tổ hợp tối đa của 0,40 để
xác định đơn hàng đánh dấu khả năng nhất trong nhóm. Tái kết hợp
các phần phân đoạn đã được chuyển đổi để bản đồ khoảng cách với các
chức năng lập bản đồ Haldane (Haldane 1919).
Kết quả
Thư viện charact