2.3. Total phenolics determinationT

2.3. Total phenolics determination

The concentration of total phenolic compounds was determined spectrophotometrically, using the Folin–Ciocalteu total phenol procedure, described by Spanos and Wrolstad (1990), with modifications. Gallic acid standard solutions were prepared at 0.0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 and 0.5 mg/ml. The extracts (0.1 ml) and the gallic acid standards (0.1 ml) were transferred to 15 ml test tubes. 3.0 ml of 0.2 N Folin–Ciocalteu reagent (Sigma–Aldrich Co., St. Louis, MO) were added to each test tube and mixed using a vortex mixer. After 1 min, 2.0 ml of 9.0% (w/v) Na2CO3 in water were added and mixed. Absorbance at 765 nm was determined using a Spectronic 21 spectrophotometer (Bausch and Lomb, USA) after 2 h at room temperature. The concentration of total phenolic compounds in the extracts was determined by comparing the absorbance of the extract samples to that of the gallic acid standard solutions. All samples were determined in duplicate. Total phenolic content (TPC) was expressed as mg gallic acid equivalents (GAE) per g dry peanut skins.

2.4. Oxygen radical absorbance capacity (ORAC) assay

Antioxidant activity (AOA) was determined using an ORAC procedure described by Zhou et al. (2007). Trolox standard solutions were prepared at 20, 40, 80, 200 and 400 μM. The trolox standards (40 μl), PSE (40 μl) and blanks containing only extraction solvent (40 μl) were added to appropriate wells of a 96-well plate. Two hundred microlitre of a 100 nM FL solution were added to each well and the plates were covered and incubated for 20 min in a Victor 3 multilabel plate reader (Perkin–Elmer, Turku, Finland) preheated to 37 °C. A solution of 0.36 M AAPH (35 μl) was added to each of the wells to generate the peroxyl radicals. Fluorescence readings of the plate were taken every minute using an excitation wavelength of 485 nm and an emission wavelength of 535 nm until all fluorescence readings declined to less than 5% of the initial values. Samples and standards were determined in duplicate.

2.5. HPLC analysis

Preliminary identification of resveratrol was carried out using an Agilent 1200 Series HPLC (Santa Clara, CA) system. The column used was a Phenomenex Luna C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm particle size) with a guard column. The binary mobile phase consisted of solvent (A) (0.5% aqueous acetic acid) and solvent (B) (0.5% acetic acid in methanol). The flow rate of the mobile phase was 0.8 ml/min. The elution gradient started with 100% A and 0% B. A decreased to 95.3% and B increased to 4.7% in 4 min. Over the next 38 min, solvent A was decreased to 25.3% whilst solvent B was increased to 74.7%. A was decreased to 5% at 54.5 min before increasing to 100% from 55 to 65 min. The absorbance was measured by a UV–Vis diode array detector at a wavelength of 280 nm. Resveratrol in the peanut skin extracts (PSE) was initially identified by comparing the retention times and UV-spectra of the PSE samples to a t-resveratrol standard analysed under the same chromatographic conditions. The resveratrol peak was then collected 12 times to obtain a concentrated sample for further identification, using LC–MS–MS. After collection, the eluted fraction was dried under nitrogen gas and reconstituted in 100 μl of MeOH.

2.6. LC–MS–MS identification

Identification of the concentrated sample was performed using an Agilent 1050 quaternary HPLC pump and multiwavelength UV detector. The HPLC was interfaced with a MicroMass Platform spectrometer (Milford, MA) equipped with an APCI-ES ionization chamber. The HPLC column output was split 1:10 with one part going to the MS and nine parts going to the UV detector. The column used was an Agilent Eclipse C18 column (250 × 4.6 mm, 5 μm particle size). The binary mobile phase consisted of solvents (A) 1% aqueous formic acid and (B) CH3CN in 1% formic acid. The flow rate of the mobile phase was 0.2 ml/min. The elution gradient started with 100% of A and 0% of B. Mobile phases A and B remained at 0% and 100%, respectively, for 25 min. Afterwards, A was reduced to 0% whilst B was increased to 100% from 25 to 35 min. Mobile phase A was then increased to 100% and B decreased to 0% until the end of the run time, which was 36 min. All ramps were linear. Data were collected using both a UV detector at 280 nm and a MS. The MS analysis was conducted in negative ion mode. A scan time of 1.4 s and interscan delay of 0.05 s were used (m/z 200–700 and 500–1200 amu).

Kết quả (Việt) 1:

2.3. tất cả phenolics quyết tâmNồng độ của tất cả các hợp chất phenolic được xác định spectrophotometrically, bằng cách sử dụng các thủ tục phenol tất cả Folin-Ciocalteu, được mô tả bởi Spanos và Wrolstad (1990), với sửa đổi. Gallic acid giải pháp tiêu chuẩn đã được chuẩn bị tại 0.0, 0.1, 0.2, 0,3, 0.4 và 0,5 mg/ml. Các chất chiết xuất (cách 0.1 ml) và tiêu chuẩn gallic acid (cách 0.1 ml) được chuyển cho ống nghiệm 15 ml. 3.0 ml cách 0.2 tinh khiết N Folin-Ciocalteu (công ty Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) đã được thêm vào mỗi ống nghiệm và pha trộn bằng cách sử dụng một máy trộn xoáy. Sau đợt 1 min, 2.0 ml 9,0% (w/v) Na2CO3 trong nước đã được thêm vào và trộn. Hấp thu tại 765 nm đã được xác định bằng cách sử dụng một phối Spectronic 21 (Bausch và Lomb, Hoa Kỳ) sau khi 2 h ở nhiệt độ phòng. Sự tập trung của các hợp chất phenolic tất cả trong các chất chiết xuất đã được xác định bằng cách so sánh hấp thu các mẫu chiết xuất của các giải pháp tiêu chuẩn gallic acid. Tất cả mẫu đã được xác định trong bản sao. Tất cả nội dung phenolic (TPC) được thể hiện như tương đương gallic acid mg (GAE) trên g khô da đậu phộng.2.4. oxygen radical hấp thu năng lực (ORAC) khảo nghiệmChất chống oxy hóa hoạt động (AOA) đã được xác định bằng cách sử dụng một thủ tục ORAC được mô tả bởi chu et al. (2007). Trolox giải pháp tiêu chuẩn đã được chuẩn bị tại 20, 40, 80, 200 và 400 μM. Các tiêu chuẩn trolox (40 μl), PSE (40 μl) và khoảng trống có chỉ chiết xuất dung môi (40 μl) đã được thêm vào thích hợp wells một tấm 96-Vâng. Hai trăm microlitre của một giải pháp nM FL 100 đã được bổ sung tốt đến mỗi và các tấm được bao phủ và ủ cho 20 phút trong một 3 Victor multilabel tấm đọc (Perkin-Elmer, Turku, Phần Lan) preheated đến 37 ° C. Một giải pháp 0,36 m AAPH (35 μl) đã được bổ sung cho mỗi giếng để tạo ra các gốc tự do peroxyl. Huỳnh quang đọc của mảng được thực hiện mỗi phút bằng cách sử dụng một bước sóng kích thích số 485 nm và một bước sóng phát thải của 535 nm cho đến khi tất cả các bài đọc huỳnh quang từ chối ít hơn 5% giá trị ban đầu. Mẫu và các tiêu chuẩn đã được xác định trong bản sao.2.5. HPLC phân tíchSơ bộ nhận dạng của resveratrol được thực hiện bằng cách sử dụng một hệ thống Agilent 1200 Series HPLC (Santa Clara, CA). Cột được sử dụng là một Phenomenex Luna C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm kích thước hạt) với một cột bảo vệ. Giai đoạn di động nhị phân bao gồm dung môi (A) (0,5% dung dịch axit axetic) và dung môi (B) (0,5% axit axetic trong methanol). Tốc độ dòng chảy của giai đoạn điện thoại di động là cách 0.8 ml/phút. Elution gradient bắt đầu với 100% A và các 0% sinh A giảm xuống 95.3% và B tăng lên 4,7% trong 4 phút. Trên 38 phút tiếp theo, A dung môi được giảm xuống 25,3% trong khi dung môi B được tăng lên 74.7%. A được giảm xuống 5% lúc 54,5 phút trước khi tăng tới 100% từ 55-65 phút. Sự hấp thu được đo bằng một máy dò mảng diode UV-Vis tại bước sóng 280 nm. Resveratrol trong chất chiết xuất từ đậu phộng da (PSE) ban đầu được xác định bằng cách so sánh thời gian lưu giữ và UV-quang phổ của mẫu PSE để một tiêu chuẩn t-resveratrol phân tích theo các điều kiện cùng chromatographic. Resveratrol đỉnh sau đó được thu thập 12 lần để có được một mẫu tập trung để hơn nữa xác định, bằng cách sử dụng LC-MS-MS. Sau khi bộ sưu tập, các phần eluted được khô dưới khí nitơ và được tái lập ở 100 μl của MeOH.2.6. LC-MS-MS nhận dạngXác định các mẫu tập trung được thực hiện bằng cách sử dụng một Agilent 1050 Đệ tứ HPLC bơm và multiwavelength UV máy dò. Hệ HPLC được giao với một nền tảng MicroMass spectrometer (Milford, MA) được trang bị với một buồng ion hóa APCI-ES. Đầu ra cột HPLC là tách 1:10 với một phần phải các MS và chín phần sẽ để các máy dò tia UV. Cột được sử dụng là một cột Agilent Eclipse C18 (250 × 4.6 mm, kích thước hạt μm 5). Giai đoạn di động nhị phân bao gồm dung môi (A) 1% dung dịch axit formic và (B) CH3CN trong axit formic 1%. Tốc độ dòng chảy của giai đoạn điện thoại di động là cách 0.2 ml/phút. Gradient elution bắt đầu với 100% của A và các 0% của điện thoại di động sinh giai đoạn A và B vẫn ở mức 0% và 100%, tương ứng, cho 25 phút sau đó, A đã được giảm xuống 0% trong khi B được tăng lên 100% từ 25 đến 35 phút điện thoại di động giai đoạn A sau đó được tăng lên 100% và B đã giảm xuống 0% cho đến cuối thời gian chạy , đó là 36 phút. Tất cả dốc được tuyến tính. Dữ liệu được thu thập bằng cách sử dụng cả hai một máy dò UV tại 280 nm và một MS. Phân tích MS được thực hiện trong chế độ ion âm. Một thời gian quét của 1.4 s và interscan sự chậm trễ của 0,05 s sử dụng (m/z 200-700 và 500-1200 amu).

Kết quả (Việt) 2:

2.3. Tổng số phenolics quyết Nồng độ tổng hợp chất phenolic được xác định spectrophotometrically, sử dụng Folin-Ciocalteu thủ tục tổng phenol, được mô tả bởi Spanos và Wrolstad (1990), với những thay đổi. Dung dịch axit galic tiêu chuẩn đã được chuẩn bị ở mức 0.0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 và 0.5 mg / ml. Các chất chiết xuất (0,1 ml) và các tiêu chuẩn axit gallic (0,1 ml) đã được chuyển đến 15 ml ống nghiệm. 3,0 ml 0,2 N Folin-Ciocalteu thuốc thử (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO) đã được thêm vào mỗi ống nghiệm và trộn bằng máy trộn xoáy. Sau 1 phút, 2,0 ml 9,0% (w / v) Na2CO3 trong nước được thêm vào và hỗn hợp. Hấp thụ ở 765 nm được xác định bằng cách sử dụng một Spectronic 21 quang phổ (Bausch và Lomb, Mỹ) sau 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Sự tập trung của tổng số các hợp chất phenolic trong chiết xuất được xác định bằng cách so sánh độ hấp thụ của các mẫu trích cho rằng các giải pháp chuẩn axit gallic. Tất cả các mẫu đã được xác định trong bản sao. Tổng hàm lượng phenolic (TPC) được thể hiện như mg tương đương axit gallic (GAE) mỗi g đậu phộng da khô. 2.4. Khả năng hấp thu oxy (ORAC) khảo nghiệm triệt để hoạt động chống oxy hóa (AOA) được xác định bằng cách sử dụng một thủ tục ORAC mô tả bởi Zhou et al. (2007). Giải pháp tiêu chuẩn trolox đã được chuẩn bị ở mức 20, 40, 80, 200 và 400 mM. Các tiêu chuẩn trolox (40 ml), PSE (40 ml) và khoảng trống chỉ chứa dung môi chiết (40 ml) được thêm vào các giếng thích hợp của phiến 96 giếng. Hai trăm microlitre của một giải pháp 100 nM FL đã được thêm vào từng giếng và các tấm được bảo hiểm và ủ trong 20 phút trong một Victor 3 multilabel đọc tấm (Perkin-Elmer, Turku, Phần Lan) làm nóng trước đến 37 ° C. Một giải pháp là 0,36 M AAPH (35 ml) được thêm vào mỗi giếng để tạo ra các gốc peroxyl. Đọc huỳnh quang của các tấm được chụp mỗi phút sử dụng một bước sóng kích thích 485 nm và bước sóng phát xạ của 535 nm đến khi tất cả các bài đọc huỳnh quang giảm xuống dưới 5% của giá trị ban đầu. Mẫu và tiêu chuẩn đã được xác định trong bản sao. 2.5. Phân tích HPLC xác định sơ bộ của resveratrol đã được thực hiện bằng cách sử dụng một Agilent 1200 series HPLC (Santa Clara, CA) hệ thống. Các cột được sử dụng là một Phenomenex Luna C18 (250 mm x 4.6 mm, kích thước 5 micron hạt) với một cột bảo vệ. Pha động nhị phân gồm dung môi (A) (0,5% dung dịch axit axetic) và dung môi (B) (0,5% acid acetic trong methanol). Tốc độ dòng chảy của pha động là 0,8 ml / phút. Gradient rửa giải bắt đầu với 100% A và 0% B. A giảm xuống còn 95,3% và B tăng lên đến 4,7% trong 4 phút. Trong 38 phút tiếp theo, dung môi A đã giảm xuống còn 25,3% trong khi dung môi B đã tăng lên đến 74,7%. A đã giảm xuống mức 5% tại 54,5 phút trước khi tăng tới 100% 55-65 phút. Độ hấp thụ được đo bằng một UV-Vis diode array detector ở bước sóng 280 nm. Resveratrol trong chiết xuất đậu phộng da (PSE) ban đầu được xác định bằng cách so sánh thời gian lưu giữ và UV-quang phổ của các mẫu PSE để một tiêu chuẩn t-resveratrol phân tích theo các điều kiện sắc ký như nhau. Đỉnh cao resveratrol sau đó được thu thập 12 lần để có được một mẫu tập trung để xác định thêm, sử dụng LC-MS-MS. Sau khi bộ sưu tập, các phần tách rửa được sấy khô trong khí nitơ và tái tạo trên 100 ml MeOH. 2.6. LC-MS-MS xác định nhận dạng của mẫu tập trung được thực hiện bằng cách sử dụng một Agilent 1050 bơm HPLC bậc bốn và detector UV nhiều bước sóng. Các HPLC được giao tiếp với một quang phổ kế MICROMASS Platform (Milford, MA) được trang bị với một buồng ion hóa APCI-ES. Sản lượng cột HPLC được chia 01:10 với một phần đi đến MS và chín phần sẽ dò UV. Các cột được sử dụng là một cột Agilent Eclipse C18 (250 × 4,6 mm, 5 micron kích thước hạt). Pha động nhị phân gồm các dung môi (A) 1% dung dịch axit formic và (B) CH 3 CN trong 1% axit formic. Tốc độ dòng chảy của pha động là 0,2 ml / phút. Gradient rửa giải bắt đầu với 100% của A và 0% của giai đoạn B. Mobile A và B vẫn ở mức 0% và 100%, tương ứng, trong 25 phút. Sau đó, A đã được giảm xuống 0% trong khi B đã được tăng lên đến 100% 25-35 phút. Pha động A sau đó đã được tăng lên đến 100% và B giảm xuống 0% cho đến khi kết thúc thời gian chạy, mà là 36 phút. Tất cả các đường dốc là tuyến tính. Dữ liệu được thu thập bằng cách sử dụng cả một detector UV ở bước sóng 280 nm và một MS. Các phân tích MS đã được tiến hành ở chế độ ion âm. Một thời gian quét là 1,4 s và chậm trễ InterScan 0,05 s đã được sử dụng (m / z 200-700 500-1200 và amu).