Our data show that the CRISPR/Cas9

Our data show that the CRISPR/Cas9 system can efficiently target latent EBV, but not quiescent HSV-1 in the model used. Although we did identify minor CRISPR/Cas9-mediated editing of quiescent HSV-1 in MRC5 cells in 2 out of 5 sequencing samples, it remains unknown whether this activity was directed towards the quiescent genome or towards new progeny virus that derived from an early spontaneous reactivation event. The MRC5 quiescence model can display spontaneous reactivation of HSV-1, which results in rapid virus replication and spread. Although we did not detect any signs of spontaneous reactivation in the experiments as presented in Fig 7C, it is conceivable that an early reactivation event occurred, which was subsequently targeted by the expressed gRNA and identified in the deep-sequencing studies. The minor HSV-1 editing that is observed cannot explain the efficient abrogation observed in HSV-1 replication upon HCMV-induced HSV-1 reactivation (Fig 7A). Hence, anti-HSV-1 gRNAs are efficient in targeting actively replicating virus, whereas quiescent HSV-1 genomes are inefficient substrates for the gRNAs used in the model we studied. The mechanisms underlying latency differ for various herpesviruses. This may result in differences in sensitivity to CRISPR/Cas9-mediated editing of latent genomes. EBV resides as an episome in the nucleus of actively dividing cells, where EBNA1 mediates replication of the viral genome via the host replication machinery without the formation of progeny virus [7]. HSV-1 latency on the other hand, occurs in non-dividing cells in sensory neurons where no genome replication occurs [75]. During latency, the HSV-1 genome is heavily methylated and viral gene expression is restricted [75]. It is suggestive that the CRISPR/Cas9 system is inefficient in accessing the tightly repressed state of the HSV-1 quiescent genome, whereas the open structure of the EBV genome during replication is accessible. Indeed, studies using models in human fibroblasts show that the quiescent HSV-1 genome is present in a tightly repressed state which is not responsive to most reactivation stimuli that normally de-repress latent genomes in neuronal cells [76, 77]. Hence, the low activity of CRISPR/Cas9 towards quiescent HSV-1 as observed in our model may not recapitulate the effect of anti-HSV-1 gRNAs in vivo. Additional in vitro andin vivo model systems are needed to assess whether CRISPR/Cas9 can target HSV-1 latency.

Kết quả (Việt) 1:

Dữ liệu của chúng tôi thấy hệ thống CRISPR/Cas9 hiệu quả có thể nhắm mục tiêu tiềm ẩn EBV, nhưng không quiescent HSV-1 trong các mô hình được sử dụng. Mặc dù chúng tôi đã xác định tiểu CRISPR/Cas9-trung gian hiệu chỉnh quiescent HSV-1 MRC5 các tế bào trong 2 trong số 5 mẫu trình tự, nó vẫn chưa được biết liệu hoạt động này được đạo diễn hướng tới bộ gen quiescent hoặc đối với virus con cháu mới bắt nguồn từ một sự kiện kích hoạt tự phát sớm. Mô hình radiao MRC5 có thể hiển thị các kích hoạt tự phát của HSV-1, kết quả trong virus nhanh chóng nhân rộng và lây lan. Mặc dù chúng tôi không thể phát hiện bất kỳ dấu hiệu tự phát kích hoạt trong các thí nghiệm như trình bày trong hình 7C, nó là conceivable rằng một sự kiện kích hoạt đầu xảy ra, mà sau đó được nhắm mục tiêu theo gRNA bày tỏ và được xác định trong các nghiên cứu sâu-trình tự. Các tiểu HSV-1 chỉnh sửa mà là quan sát không thể giải thích thủ tiêu hiệu quả quan sát thấy trong nhân rộng HSV-1 sau khi kích hoạt gây ra HCMV HSV-1 (hình 7A). Do đó, anti-HSV-1 gRNAs có hiệu quả trong nhắm mục tiêu theo nhân bản tích cực virus, trong khi quiescent HSV-1 bộ gen không hiệu quả chất nền cho gRNAs được sử dụng trong các mô hình mà chúng tôi nghiên cứu. Các cơ chế tiềm ẩn của độ trễ khác nhau cho các herpesviruses. Điều này có thể dẫn đến sự khác biệt trong độ nhạy CRISPR/Cas9-mediated soạn thảo của bộ gen tiềm ẩn. EBV sống như là một episome trong nhân tích cực phân chia tế bào, nơi EBNA1 hàm sao chép của virus gen thông qua các máy móc sao chép máy chủ mà không có sự hình thành của con cháu virus [7]. HSV-1 trễ trên mặt khác, xảy ra trong phòng không phân chia tế bào trong tế bào thần kinh cảm giác nơi không có sao chép bộ gen xảy ra [75]. Trong thời gian trễ, gen HSV-1 nặng nề xitôzin và biểu hiện gen virus là bị hạn chế [75]. Nó là gợi rằng hệ thống CRISPR/Cas9 là không hiệu quả trong truy cập vào nhà nước chặt chẽ repressed của HSV-1 quiescent gen, trong khi các cấu trúc mở của EBV gen trong nhân rộng có thể truy cập. Thật vậy, nghiên cứu sử dụng mô hình trong con người fibroblasts Hiển thị quiescent HSV-1 gen là hiện diện trong một nhà nước chặt chẽ repressed mà không đáp ứng với sự kích thích nhất kích hoạt thường bỏ repress tiềm ẩn bộ gen trong tế bào thần kinh [76, 77]. Do đó, các hoạt động thấp của CRISPR/Cas9 hướng tới quiescent HSV-1 như quan sát trong mô hình của chúng tôi có thể không recapitulate có hiệu lực của chống-HSV-1 gRNAs tại vivo. Hệ thống mô hình vivo andin trong ống nghiệm bổ sung là cần thiết để đánh giá liệu CRISPR/Cas9 có thể nhắm mục tiêu các độ trễ HSV-1.

Kết quả (Việt) 2:

dữ liệu của chúng tôi cho thấy rằng hệ thống CRISPR / Cas9 hiệu quả có thể nhắm mục tiêu EBV tiềm ẩn, nhưng không hoạt động gì HSV-1 trong mô hình được sử dụng. Mặc dù chúng tôi đã xác định được CRISPR nhỏ / Cas9 qua trung gian chỉnh sửa các hoạt động gì HSV-1 trong MRC5 tế bào ở 2 trong số 5 mẫu trình tự, nó chưa biết được liệu hoạt động này đã được hướng về bộ gen hoạt động gì hay hướng rút con cháu mới có nguồn gốc từ một đầu tự phát sự kiện kích hoạt lại. Mô hình tĩnh lặng MRC5 có thể hiển thị kích hoạt tự phát của HSV-1, mà kết quả trong sự sao chép virus nhanh và lây lan. Mặc dù chúng tôi đã không phát hiện bất kỳ dấu hiệu của sự tái hoạt tự phát trong các thí nghiệm được trình bày trong hình 7C, có thể hiểu rằng một sự kiện kích hoạt đầu xảy ra, mà sau đó đã được nhắm mục tiêu bởi các gRNA thể hiện và xác định trong các nghiên cứu sâu trình tự. Trẻ vị thành niên HSV-1 biên tập mà được quan sát không thể giải thích việc huỷ bỏ hiệu quả quan sát trong HSV-1 nhân rộng trên HCMV gây ra HSV-1 kích hoạt (Hình 7A). Do đó, chống HSV-1 gRNAs có hiệu quả trong mục tiêu tích cực sao chép virus, trong khi hoạt động gì HSV-1 hệ gen có chất nền không hiệu quả cho gRNAs được sử dụng trong các mô hình chúng tôi nghiên cứu. Các cơ chế cơ bản độ trễ khác nhau cho các herpesviruses khác nhau. Điều này có thể dẫn đến sự khác biệt về độ nhạy cảm với CRISPR / chỉnh sửa Cas9 qua trung gian của bộ gen tiềm ẩn. EBV cư trú như một episome trong nhân của tế bào chủ động phân chia, nơi EBNA1 trung gian sao chép bộ gen của virus thông qua các máy móc thiết bị sao chép máy chủ mà không có sự hình thành của virus thế hệ con cháu [7]. HSV-1 độ trễ trên Mặt khác, xảy ra trong không phân chia tế bào trong tế bào thần kinh cảm giác, nơi không có sự sao chép gen xảy ra [75]. Trong thời gian trễ, bộ gen HSV-1 là rất nhiều biểu hiện gen methyl hóa và virus bị hạn chế [75]. Đó là gợi ý rằng các hệ thống CRISPR / Cas9 là không hiệu quả trong việc tiếp cận các nhà nước áp chặt của HSV-1 gen hoạt động gì, trong khi cấu trúc mở của bộ gen EBV khi sao chép có thể truy cập. Thật vậy, các nghiên cứu sử dụng mô hình trong nguyên bào sợi người cho thấy hoạt động gì HSV-1 gen có mặt trong trạng thái áp chặt mà không được đáp ứng với hầu hết các kích thích sự tái hoạt thường bỏ áp gen tiềm ẩn trong tế bào thần kinh [76, 77]. Do đó, các hoạt động thấp của CRISPR / Cas9 hướng hoạt động gì HSV-1 như quan sát trong mô hình của chúng tôi có thể không tóm các hiệu ứng chống HSV-1 gRNAs trong cơ thể. Bổ sung trong ống nghiệm andin vivo hệ thống mô hình là cần thiết để đánh giá xem liệu CRISPR / Cas9 thể nhắm mục tiêu HSV-1 độ trễ.