RESULTSCarbohydrate-binding ability

RESULTS
Carbohydrate-binding ability of GFP-CBM3 To confirm whether the GFP-CBM3 fused protein was successfully constructed, the purified proteins were analyzed by SDS-PAGE. As shown in Fig. S2, bands appeared at approximately 27, 16 and 43 kDa, the expected molecular weights of GFP, CBM3 and GFP-CBM3
proteins, respectively, indicating that the fused protein was properly expressed and formed a soluble structure in E. coli Rosetta pLysS cells. Subsequently, the carbohydrate-binding capability of GFP-CBM3 was examined in the presence of Avicel, a typical microcrystalline cellulose. As seen in Fig. 1, the Avicel particles clearly fluoresced green, indicating that GFP-CBM3 had bound and was a suitable fluorescent marker protein for cellulosic materials. In contrast, no fluorescent signal was detected on Avicel particles exposed to GFP, indicating that GFP had not bound to Avicel. In previous work, it was reported that CBM3 from P. curdlanolyticushad an affinity to oat spelt xylan or wheat arabinoxylan beside Avicel(13). We detected the binding of the GFP-CBM3 fused protein to the particles of these carbohydrates (data not shown), demonstrating that the
carbohydrate-binding capabilities of CBM3 were preserved in the fused protein.
Next, to determine whether GFP-CBM3 could detect the EPSh produced by E. coli cells, biofilms of BW25113 and MG1655 strains were incubated with GFP-CBM3. As seen in the CLSM images (Fig. 2), GFP-CBM3 fluorescence appeared to be localized to celldense areas in the microcolonies of both BW25113 and MG1655 biofilms.
To better assess the performance of GFP-CBM3 fused protein in E. coli biofilm, we also stained the EPSh with wheat germ agglutinin-Oregon 488 dye, a conventional chemical for staining biofilm matrices(10). In CLSM images, the staining of the core areas of microcolonies was consistent with that of GFP-CBM3 fused protein (data not shown). This finding highlights the efficacy of GFP-CBM3 as a new marker protein for probing EPSh in biofilm. Enhancement of EPSh production To further confirm the availability of GFP-CBM3, we attempted to enhance EPSh production by E. coli cells. The formation of cellflocs in liquid culture is expected to directly indicate EPSh production. For this purpose, we
attempted to introduce some genes implicated in the cellulose biosynthesis into E. coli cells. Cells of E. coli BW25113 and MG1655 parent strains were dispersed, as confirmed by the microscopic observation (Fig. 3A and B). Similarly, noflocs were observed in cultures of E. coli BW25113 or MG1655, which overexpressed the bcsA, bcsCandbcsZgenes (data not shown). In contrast, the flocs in cultures of BW25113/bcsB and MG1655/bcsB cells,
overexpressing the bcsB gene, were well-developed and visible to
the naked eye (Fig. 3A). Interestingly, GFP-CBM3 fluorescence was
evident throughout the flocs of both bcsB recombinants. Incontrast, no fluorescence was detected in the planktonic cells of BW25113, MG1655, BW25113/bcsB or MG1655/bcsB strain suggesting that the dispersed cells contained negligible EPSh (Fig. 3B). Thus, overexpression of the bcsB gene induced cell flocculation via enhanced EPSh formation. Biofilm formation by E. coli cells overexpressing bcsB Because bcsB overexpression induced cell flocculation, we considered that inducing this gene would promote biofilm formation by E. coli cells. To evaluate the influence of bcsB overexpression
on biofilm formation, the biofilm was quantified in a PVC microtiter plate stained with safranin. At 24 h of incubation, bcsB overexpression did not influence cell colonization on the solid surface. The indices of colonized BW25113/bcsB and MG1655/bcsB cells did not significantly differ from those of their parent strains (Fig. 4A). Notably, the BW25113/bcsB strain formed approximately 5 times
more biofilm than the BW25113 strain in the prolonged ncubation of 48 h. Similarly, MG1655/bcsB strain formed considerably more biofilm than its parent strain. The enhancement of biofilm formation by bcsBoverexpression was
supported by SEM imaging. As shown in Fig. 4B, the BW25113/bcsB and MG1655/bcsB cells appeared to be connected with each other through enriched EPSh matrices, while fewer such connections were established by the wild-type cells. Collectively, ourfindings suggest that biofilm formation by E. coli K-12 derived strains was dramatically increased by copious EPSh components
resulting from bcsB overexpression. EPSh localization in biofilm The EPSh location in biofilms producing different levels of EPSh was identified by the GFP-CBM3 marker.Fig. 5A shows representative three-dimensional images of
E. colicells stained by SYTO 60 dye (redfluorescence) and EPSh stained by GFP-CBM3 (greenfluorescence) in biofilms of BW25113 and MG1655 strains with and without bcsB introduction. All biofilms were established on glass surfaces. Green fluorescence was concentrated in the central regions of BW25113 and MG1655 microcolonies, indicating that EPSh was localized there (Fig. 5A). Larger amounts of GFP-CBM3-associated EPSh were detected in
the BW25113/bcs Band MG1655/bcsB strains than in their parent strains. The extra EPSh produced by bcsB overexpression filled the spaces between the microcolonies, bridging them to form condensed cell areas (Fig. 5A). The biofilms of the BW25113/bcsB and MG1655/bcsB strains were approximately 3 times thicker than those of their parent strains (Fig. 5B). Moreover, EPSh
probing confirmed that the transformed cells covered a greater proportion of the surface than their parent strains.
DISCUSSION
The CBM3 protein fromP. curdlanolyticusB-6 is a member of family 3b that strongly binds to carbohydrates such as cellulose and xylan derivatives (13). In the current study, we constructed a functional fused protein of CBM3 and GFP, and confirmed its binding affinity to carbohydrates; especially, to the EPSh inE. coli microcolonies. Though the specific carbohydrates targeted by CBM in E. coli microcolonies were not elucidated, we confirmed that, besides cellulose, GFP-CBM3 binds with strong affinity to chitosan (data not shown). Morag et al. reported the binding of CBM3a to chitin(18). Chitin and chitosan (poly-D-glucosamine derivatives) are chemically similar to PGA, a main constituent of EPSh in E. coli biofilms. Mika et al.(19)reported cellulose, PGA and colanic acid as the dominant matrix components ofE. colibiofilm. In this context,
our constructed GFP-CBM3 protein may target cellulose and PGA in
the EPSh formed by E. coliK-12 derived strains. Therefore, GFPCBM3 presents as a novel tool for probing EPSh formation in the biofilms and flocs of E. coli cells. In the present study, we also reported a putative gene,bcsB, that
enhances biofilm formation and EPSh production by E. coli. BcsB is a
large periplasmic protein that anchors to the inner membrane. The role of bcsBin EPSh synthesis by E. coliis incompletely understood. According to our results, the expressions of genes involved in cellulose, PGA and colanic acid synthesis were statistically higher in the BW25113/bcsB cells than in their BW25113 parent cells (Fig. S3). Thus, it appears that EPSh production, and consequently cellflocculation in liquid cultures, was enhanced by introducing bcsB into E. coliK-12 derived strains (Fig. 3). In the detection assays, the
matrix connecting the flocculent bacterial cells was determined as
EPSh, with strong binding to GFP-CBM3. Dorken et al. (20) demonstrated a role of EPSh in aggregatingE. coliK-12 cells and forming biofilm-like structures on a surface. Thus, we consider that the enrichment of EPSh by bcsB overexpression was responsible for the cellular aggregation in liquid cultures of both BW25113/bcsB and MG1655/bcsB strains. The role of EPSh in biofilm formation on solid surfaces has been clarified in recent studies(2e4). Xiao et al. (21) described the polysaccharide-mediated development of biofilm
through the stages of cell clustering, microcolony formation and
multi-microcolony aggregation. In the present study of BW25113 and MG1655 biofilms, EPSh formed scaffolds that facilitated the establishment of single microcolonies. Strains overexpressing bcsB sufficiently increased their EPSh synthesis to coagulate individual microcolonies into multi-microcolony aggregates.
In conclusion, we constructed a GFP-CBM3 fused protein as a
novel probe for detecting EPSh produced by E. coliK-12 derived strains. GFP-CBM3 probing confirmed that bcsB overexpression encouraged flocculation and biofilm development of E. coli cells by promoting EPSh production.
Supplementary data related to this article can be found athttp://dx.doi.org/10.1016/j.jbiosc.2014.03.005.
ACKNOWLEDGMENTS
This work was supported by Grant-in-Aid for Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Fellows Number 23-2425. We thank Dr. Muranaka at the Research Center for Ultra-High Voltage Electron Microscopy, Osaka University, for assistance in SEM imaging. We also thank Mr. Ashida of the Division of Chemical Engineering, Graduate School of Engineering Science, Osaka University, for technical assistance in preparing the GFP-CBM3 fused protein.

Kết quả (Việt) 2:

KẾT QUẢ
Carbohydrate-ràng buộc khả năng của GFP-CBM3 Để khẳng định GFP-CBM3 Fused protein đã được xây dựng thành công, các protein tinh khiết đã được phân tích bởi SDS-PAGE. Như thể hiện trong hình. S2, các ban nhạc xuất hiện vào khoảng 27, 16 và 43 kDa, trọng lượng phân tử của GFP, CBM3 và GFP-CBM3
protein, tương ứng, chỉ ra rằng các protein hợp nhất được biểu hiện và hình thành một cấu trúc tan trong E. coli tế bào Rosetta pLysS đúng. Sau đó, khả năng carbohydrate-ràng buộc của GFP-CBM3 đã được kiểm tra sự hiện diện của Avicel, một cellulose vi tinh thể điển hình. Như đã thấy trong hình. 1, các hạt Avicel sẽ phát sáng màu xanh lá cây rõ ràng, chỉ ra rằng GFP-CBM3 đã bị ràng buộc và là một protein marker huỳnh quang thích hợp cho vật liệu xenlulo. Ngược lại, không có tín hiệu huỳnh quang đã được phát hiện trên các hạt Avicel tiếp xúc với GFP, chỉ ra rằng GFP đã không bị ràng buộc để Avicel. Trong công việc trước đây, nó đã được báo cáo rằng CBM3 từ P. curdlanolyticushad một mối quan hệ để yến mạch hoặc lúa mì đánh vần xylan arabinoxylan bên cạnh Avicel (13). Chúng tôi phát hiện các ràng buộc của GFP-CBM3 hợp nhất protein để các hạt của các carbohydrate (dữ liệu không hiển thị), cho thấy
khả năng carbohydrate-ràng buộc của CBM3 được bảo quản trong các protein hợp nhất.
Tiếp theo, để xác định xem GFP-CBM3 có thể phát hiện các EPSh sản xuất bởi các tế bào E. coli, màng sinh học của các chủng BW25113 và MG1655 được ủ với GFP-CBM3. Như đã thấy trong các hình ảnh CLSM (Fig. 2), GFP-CBM3 huỳnh quang xuất hiện để được địa phương hoá celldense khu vực trong microcolonies của cả hai BW25113 và MG1655 màng sinh học.
Để đánh giá tốt hơn hiệu suất của GFP-CBM3 hợp nhất protein trong E. coli màng sinh học, chúng tôi cũng nhuộm EPSh với mầm lúa mì agglutinin-Oregon 488 nhuộm, một chất hóa học thông thường cho ma trận biofilm nhuộm (10). Trong hình ảnh CLSM, nhuộm trong những lĩnh vực cốt lõi của microcolonies là phù hợp với điều đó của GFP-CBM3 hợp nhất protein (dữ liệu không hiển thị). Phát hiện này nhấn mạnh sự hiệu quả của GFP-CBM3 như một protein marker mới cho thăm dò EPSh trong màng sinh học. Tăng cường sản xuất EPSh Để xác nhận thêm sự sẵn có của GFP-CBM3, chúng tôi đã cố gắng để nâng cao EPSh sản xuất bởi các tế bào E. coli. Sự hình thành của cellflocs trong môi trường chất lỏng dự kiến sẽ trực tiếp chỉ ra sản xuất EPSh. Với mục đích này, chúng tôi
đã cố gắng để giới thiệu một số gen liên quan đến sự sinh tổng hợp cellulose thành các tế bào E. coli. Các tế bào của E. coli BW25113 và chủng mẹ MG1655 đã bị phân tán, như khẳng định bởi quan sát bằng kính hiển vi (Hình 3A. Và B). Tương tự như vậy, noflocs được quan sát thấy trong các nền văn hóa của E. coli BW25113 hoặc MG1655, mà biểu hiện quá mức các bcsA, bcsCandbcsZgenes (dữ liệu không hiển thị). Ngược lại, các flocs trong nền văn hóa của BW25113 / bcsB và các tế bào MG1655 / bcsB,
biểu hiện tốt các gen bcsB, đã phát triển tốt và có thể nhìn thấy
bằng mắt thường (3A hình.). Thật thú vị, GFP-CBM3 huỳnh quang là
điều hiển nhiên trong suốt flocs của cả hai tái tổ hợp bcsB. Incontrast, không có huỳnh quang đã được phát hiện trong các tế bào sinh vật phù du của BW25113, MG1655, BW25113 / bcsB hoặc MG1655 / bcsB căng thẳng cho thấy rằng các tế bào phân tán chứa EPSh không đáng kể (Hình. 3B). Như vậy, quá mức của các gen bcsB gây keo tụ di động thông qua tăng cường hình EPSh. Hình thành màng sinh học của tế bào E. coli biểu hiện tốt bcsB Vì bcsB quá mức gây ra tế bào chất keo tụ, chúng tôi cho rằng gây gen này sẽ thúc đẩy sự hình thành màng sinh học của tế bào E. coli. Để đánh giá ảnh hưởng của bcsB quá mức
về sự hình thành màng sinh học, màng sinh học được định lượng trong một tấm PVC microtiter nhuộm với safranin. Tại 24 giờ ủ, bcsB quá mức không ảnh hưởng đến tế bào thuộc địa trên bề mặt rắn. Các chỉ số của các tế bào thuộc địa BW25113 / bcsB và MG1655 / bcsB không khác biệt đáng kể so với các chủng cha mẹ của họ (Hình. 4A). Đáng chú ý, sự căng thẳng BW25113 / bcsB hình thành khoảng 5 lần
màng sinh học nhiều hơn các chủng BW25113 trong ncubation kéo dài 48 h. Tương tự như vậy, MG1655 / bcsB chủng hình thành màng sinh học đáng kể hơn so với dòng mẹ. Việc tăng cường hình thành màng sinh học bởi bcsBoverexpression được
hỗ trợ bởi hình ảnh SEM. Như thể hiện trong hình. 4B, các BW25113 / bcsB và MG1655 / bcsB tế bào xuất hiện để được kết nối với nhau thông qua ma trận EPSh làm giàu, trong khi ít kết nối như vậy đã được thành lập bởi các tế bào hoang dại. Nói chung, ourfindings đề nghị rằng sự hình thành màng sinh học của E. coli K-12 chủng có nguồn gốc đã được tăng lên đáng kể bởi các thành phần EPSh dồi dào
do bcsB quá mức. EPSh nội địa hóa trong màng sinh học Các EPSh vị trí trong màng sinh học sản xuất các cấp khác nhau của EPSh được xác định bởi các GFP-CBM3 marker.Fig. 5A cho thấy đại diện hình ảnh ba chiều của
E. colicells nhuộm bằng thuốc nhuộm SYTO 60 (redfluorescence) và EPSh nhuộm màu bởi GFP-CBM3 (greenfluorescence) trong màng sinh học của BW25113 và MG1655 chủng có và không có bcsB giới thiệu. Tất cả các màng sinh học đã được thành lập trên bề mặt kính. Huỳnh quang màu xanh lá cây được tập trung ở khu vực trung tâm của BW25113 và MG1655 microcolonies, chỉ ra rằng EPSh đã được bản địa hóa ở đó (Hình 5A.). Lớn hơn số lượng EPSh GFP-CBM3 liên quan đã được phát hiện trong
các BW25113 / bcs nhạc MG1655 / bcsB chủng hơn trong các chủng cha mẹ của họ. Các EPSh thêm sản xuất bởi bcsB quá mức lấp đầy khoảng trống giữa các microcolonies, bắc cầu cho họ hình thành các vùng tế bào đặc (Hình. 5A). Các màng sinh học của các chủng BW25113 / bcsB và MG1655 / bcsB là dày hơn so với các chủng cha mẹ của họ (Hình. 5B) khoảng 3 lần. Hơn nữa, EPSh
việc khảo sát khẳng định rằng các tế bào chuyển hóa bao phủ một tỷ lệ lớn hơn của bề mặt hơn so với các chủng cha mẹ của họ.
THẢO LUẬN
Các CBM3 protein fromP. curdlanolyticusB-6 là một thành viên của gia đình 3b rằng liên kết mạnh mẽ với carbohydrate như cellulose và các dẫn xuất xylan (13). Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xây dựng một protein hợp nhất chức năng của CBM3 và GFP, và khẳng định mối quan hệ ràng buộc của nó với carbohydrate; đặc biệt, với EPSh ine. coli microcolonies. Mặc dù các carbohydrate cụ thể mục tiêu của CBM trong E. coli microcolonies không được làm sáng tỏ, chúng tôi khẳng định rằng, bên cạnh cellulose, GFP-CBM3 gắn với ái lực mạnh mẽ để chitosan (dữ liệu không hiển thị). Morag et al. báo cáo các ràng buộc của CBM3a để chitin (18). Chitin và chitosan (dẫn xuất poly-D-glucosamine) là hóa học tương tự để PGA, một thành phần chính của EPSh trong E. coli màng sinh học. Mika et al. (19) báo cáo cellulose, PGA và axit colanic như các thành phần ma trận chi phối ofe. colibiofilm. Trong bối cảnh này,
protein xây dựng GFP-CBM3 của chúng tôi có thể nhắm mục tiêu cellulose và PGA trong
các EPSh hình thành bởi E. coliK-12 chủng có nguồn gốc. Vì vậy, GFPCBM3 trình bày như là một công cụ mới để thăm dò hình EPSh trong màng sinh học và flocs của tế bào E. coli. Trong nghiên cứu này, chúng tôi cũng báo cáo một gen giả định, bcsB, mà
tăng cường hình thành màng sinh học và sản xuất EPSh bởi E. coli. BcsB là một
protein periplasmic lớn mà neo vào màng bên trong. Vai trò của sự tổng hợp bcsBin EPSh bởi E. coliis không đầy đủ hiểu. Theo kết quả của chúng tôi, những biểu hiện của gene trong cellulose, PGA và tổng hợp acid colanic là trong các tế bào BW25113 / bcsB cao hơn về mặt thống kê so với các tế bào BW25113 mẹ của họ (Hình. S3). Do đó, nó xuất hiện rằng EPSh sản xuất, và do đó cellflocculation trong các nền văn hóa lỏng, được tăng cường bằng cách giới thiệu bcsB vào E. coliK-12 chủng có nguồn gốc (Hình. 3). Trong các xét nghiệm phát hiện, các
ma trận kết nối các tế bào vi khuẩn flocculent được xác định như
EPSh, với mạnh ràng buộc để GFP-CBM3. Dorken et al. (20) đã chứng minh vai trò của EPSh trong aggregatingE. coliK-12 tế bào và hình thành cấu trúc màng sinh học như trên một bề mặt. Vì vậy, chúng tôi cho rằng việc làm giàu EPSh bởi bcsB quá mức chịu trách nhiệm cho các tập hợp tế bào trong nuôi cấy lỏng của cả hai BW25113 / bcsB và chủng MG1655 / bcsB. Vai trò của EPSh trong việc hình thành màng sinh học trên bề mặt rắn đã được làm rõ trong các nghiên cứu gần đây (2e4). Xiao et al. (21) mô tả sự phát triển polysaccharide qua trung gian của màng sinh học
thông qua các giai đoạn của phân nhóm tế bào, hình thành microcolony và
đa microcolony tập hợp. Trong nghiên cứu của BW25113 và MG1655 màng sinh học, EPSh hình thành giàn giáo đã tạo điều kiện thành lập microcolonies duy nhất. Chủng biểu hiện tốt bcsB đủ tăng tổng hợp EPSh họ làm đông microcolonies cá nhân vào uẩn đa microcolony.
Trong kết luận, chúng tôi đã xây dựng một GFP-CBM3 hợp nhất protein như một
cuốn tiểu thuyết đầu dò để phát hiện EPSh sản xuất bởi E. coliK-12 chủng có nguồn gốc. GFP-CBM3 việc khảo sát xác nhận rằng bcsB quá mức khuyến khích keo tụ và màng sinh học phát triển của các tế bào E. coli bằng cách thúc đẩy sản xuất EPSh.
dữ liệu bổ sung liên quan đến bài viết này có thể được tìm thấy athttp: //dx.doi.org/10.1016/j.jbiosc.2014.03. 005.
Lời cảm ơn
Công trình này được hỗ trợ bởi Grant-in-Aid Society cho Nhật Bản cho Xúc tiến Khoa học (JSPS) Fellows Số 23-2425. Chúng tôi cảm ơn Tiến sĩ Muranaka tại Trung tâm Nghiên cứu Ultra-High Voltage Electron Microscopy, Đại học Osaka, để hỗ trợ chụp ảnh SEM. Chúng tôi cũng cảm ơn ông Ashida của Phòng Kỹ thuật Hóa học, Trường Đại Học Khoa học Kỹ thuật, Đại học Osaka, hỗ trợ kỹ thuật trong việc chuẩn bị các GFP-CBM3 hợp nhất protein.