2. Methods2.1. MicroorganismSpores

2. Methods
2.1. Microorganism
Spores of S. hygroscopicus 5008 (Yu et al., 2005) were stored in
25% (w/v, the same as below) glycerol at 20 C. Before use, the
strain was grown on an agar plate containing 2% (w/v, the same as
below) soybean meal, 2% maltose, and 2% agar, and spores were collected
and suspended in 25% glycerol after cultivation for five days
at 30 C.
2.2. Fermentation conditions
Medium I contains 3% corn powder, 2.2% soybean meal, 1%
yeast extract, 0.2% NaCl, and 0.08% KH2PO4, and Medium II contains
9% corn powder, 4% soybean meal, 0.5% yeast extract, 0.1%
NaCl, and 0.1% KH2PO4. For seed culture, spore suspension
(100 ll) was inoculated into 250 ml shake flasks containing
50 ml of Medium I under an agitation speed of 220 rpm at 30 C.
After 24 h, 5 ml of seed cultures was inoculated to 250 ml flasks
containing 50 ml of Medium II and fermented for 5 days at 37 C.
Three duplicates were carried out for each condition.
2.3. Addition of H2O2 and diphenyleneiodonium chloride (DPI)
H2O2 and DPI were sterilized by filtration before addition to the
medium. Fifty lM H2O2 was added to the medium at 0, 8th and
24th h of fermentation to study the effect of H2O2 addition time
on cell growth and VAL-A production. Ten, 25 or 50 lM H2O2
was added to the medium at 8th h of fermentation to study the effect
of H2O2 amount on cell growth and VAL-A production. Two lM
DPI was added before 25 lM H2O2 was added at 8th h to study the
effect of ROS inhibitor on VAL-A production.
2.4. Sampling and analysis
A total of 2 ml broth was taken from three duplicates every 24 h
for analyses of dry cell weight, residual sugar and VAL-A concentration.
To determine the intracellular protein concentration,
mycelia were centrifuged, washed and then distributed to two
eppendorf tubes, with lysozyme added to one of the tube to lyse
the cells as reported (Kieser et al., 2000). Standard Bradford method
was used to determine the protein released from the mycelia.
The total residual sugar was determined by standard phenol–
sulfuric acid method and VAL-A production by HPLC (Yu et al.,
2005; Liao et al., 2009).
2.5. RNA and qRT-PCR assay
The total RNA from S. hygroscopicus 5008 was extracted using
TriZol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) as an extracting solution.
Residual genomic DNA was removed using RNase-free DNase I
(MBI Fermentas, Canada) according to the manufacturer’s protocol.
RNA concentration was determined using a Biophotometer Plus
(Eppendorf, Germany). Reverse transcription was achieved using total
RNA as the starting material and the Superscript RNAase H
Firststrand synthesis kit (Invitrogen). The transcriptional levels of
valABC, valKLMN, valG and valPQ were determined by quantitative
real-time RT-PCR (qRT-PCR) carried out on an Eppendorf
Mastercycler Realplex2 with One Step PrimeScript™ RT-PCR Kit
(Takara) according to manufacturer’s procedure. Control reactions
were set by adding RNA without reverse transcription instead of
cDNA. After pre-denature at 95 C for 5 min, amplification occurred
in two steps: 15 s at 95 C for denature, 15 s at 60 C for annealing
and 30 s at 72 C for extension for 40 cycles. The sequences of
primer pairs were listed in Table 1.
2.6. Ass

Kết quả (Việt) 1:

2. phương pháp2.1. vi sinh vậtCác bào tử của S. hygroscopicus 5008 (Yu và ctv., 2005) được lưu trữ trong25% (w/v, giống như dưới đây) glyxêrin lúc 20 C. Trước khi sử dụng, cáccăng thẳng đã được trồng trên một tấm thạch chứa 2% (w/v, giống nhưdưới đây) bữa ăn đậu tương, 2% maltose, và 2% thạch và bào tử được thu thậpvà bị đình chỉ trong 25% glyxêrin sau khi trồng trọt trong năm ngàyở 30 C.2.2. lên men điều kiệnTrung bình tôi chứa 3% ngô bột, bột đậu nành 2,2% 1%chiết xuất nấm men, cách 0.2% NaCl, và 0,08% KH2PO4 and vừa II bao gồm9% ngô bột, Bữa ăn đậu nành 4%, 0,5% chiết xuất nấm men, 0,1%NaCl, và 0,1% KH2PO4. Cho văn hóa hạt giống, spore đình chỉ(100 ll) được tiêm chủng vào 250 ml lắc bình chứa50 ml của phương tiện truyền thông tôi theo kích động một tăng tốc độ của 220 rpm ở 30 C.Sau khi 24 h, 5 ml của nền văn hóa hạt giống được tiêm chủng để 250 ml bìnhcó 50 ml vừa II và lên men trong 5 ngày tại 37 C.Ba bản sao được thực hiện cho mỗi điều kiện.2.3. bổ sung của H2O2 và diphenyleneiodonium clorua (DPI)H2O2 và DPI đã được khử trùng bằng cách lọc trước khi bổ sung cho cácphương tiện truyền thông. Năm mươi lM H2O2 đã được thêm vào các trung tại 0, 8 và24 h của quá trình lên men để nghiên cứu tác dụng của H2O2 bổ sung thời gianngày tăng trưởng tế bào và VAL-A sản xuất. Mười, 25 hoặc 50 lM H2O2đã được thêm vào phương tiện tại 8 h của quá trình lên men để nghiên cứu các hiệu ứngcủa H2O2 các số tiền vào tăng trưởng tế bào và VAL-A sản xuất. Hai lMDPI đã được bổ sung trước khi 25 lM H2O2 được bổ sung vào 8 h để nghiên cứu cáctác động của chất ức chế ROS VAL-A sản xuất.2.4. Lấy mẫu và phân tíchTổng cộng 2 ml canh được chụp từ ba bản sao mỗi 24 hĐối với phân tích của trọng lượng di động giặt, dư đường và VAL-A tập trung.Để xác định nồng độ protein nội bào,mycelia đã ly, rửa sạch và sau đó phân phối cho haiEppendorf ống, với lysozyme thêm vào một trong ống để lyseCác tế bào như là báo cáo (Kieser et al., 2000). Phương pháp tiêu chuẩn Bradfordđược sử dụng để xác định các protein phát hành từ các mycelia.Dư đường tất cả đã được xác định theo tiêu chuẩn phenol-phương pháp axít sulfuric và VAL-A sản xuất bởi hệ HPLC (Yu et al.,năm 2005; Liêu et al., 2009).2.5. RNA và Đảng Cộng sản Romania qRT khảo nghiệmRNA tất cả từ S. hygroscopicus 5008 được chiết xuất bằng cách sử dụngTriZol (Invitrogen, Carlsbad, California, Hoa Kỳ) như là một giải pháp giải nén.Dư DNA gen đã được gỡ bỏ bằng cách sử dụng miễn phí RNase DNase tôi(MBI Fermentas, Canada) theo giao thức của nhà sản xuất.RNA tập trung đã được xác định bằng cách sử dụng một Biophotometer Plus(Eppendorf, Đức). Phiên mã ngược đã đạt được bằng cách sử dụng tổng cộngRNA là nguyên liệu khởi đầu và Superscript RNAase HFirststrand tổng hợp bộ (Invitrogen). Các đơn vị transcriptionalvalABC, valKLMN, valG và valPQ đã được xác định bởi số lượngthời gian thực RT Đảng Cộng sản Romania (qRT PCR) được thực hiện trên một EppendorfMastercycler Realplex2 với một bước PrimeScript ™ RT-PCR Kit(Takara) theo thủ tục của nhà sản xuất. Kiểm soát phản ứngđã được thiết lập bằng cách thêm RNA mà không có các phiên mã ngược thay vìcDNA. Sau khi trước denature tại 95 C cho 5 phút, khuếch đại xảy ratrong hai bước: 15 s tại 95 C cho denature, 15 s tại 60 C cho tôivà 30 s tại 72 C cho phần mở rộng cho 40 chu kỳ. Trình tựChất mồi đệm cặp đã được liệt kê trong bảng 1.2.6. ass

Kết quả (Việt) 2:

2. Phương pháp
2.1. Vi sinh
bào tử của S. hygroscopicus 5008 (Yu et al., 2005) được lưu trữ trong
25% (w / v, giống như dưới đây) glycerol ở 20 C. Trước khi sử dụng, các
chủng đã được trồng trên một tấm thạch có chứa 2% ( w / v, giống như
bên dưới) bột đậu tương, 2% maltose, và agar 2%, và bào tử được thu thập
và bị đình chỉ trong 25% glycerol sau khi trồng trong năm ngày
ở 30 C.
2.2. Điều kiện lên men
trung bình I chứa 3% bột ngô, 2,2% bột đậu tương, 1%
chiết xuất nấm men, 0,2% NaCl, và 0,08% KH2PO4, vừa và II chứa
9% bột ngô, 4% bột đậu tương, 0,5% chiết xuất nấm men, 0,1%
NaCl, và 0,1% KH2PO4. Đối với văn hoá giống, bào tử
(100 ll) được cấy vào 250 ml lắc bình chứa
50 ml Medium I theo một tốc độ kích động của 220 rpm ở 30 C.
Sau 24 h, 5 ml của các nền văn hóa hạt giống đã được tiêm cho 250 ml bình
chứa 50 ml Medium II và lên men trong 5 ngày ở 37 C.
Ba bản sao được thực hiện đối với từng trường hợp.
2.3. Ngoài ra H2O2 và diphenyleneiodonium clorua (DPI)
H2O2 và DPI đã được khử trùng bằng cách lọc trước khi thêm vào các
phương tiện. Năm mươi LM H2O2 đã được thêm vào môi trường ở mức 0, 8 và
24 h lên men để nghiên cứu tác động của thời gian H2O2 Ngoài ra
sự tăng trưởng tế bào và VAL-A sản xuất. Mười, 25 hoặc 50 LM H2O2
đã được thêm vào môi trường tại h 8 của quá trình lên men để nghiên cứu tác động
của lượng H2O2 vào tăng trưởng tế bào và VAL-A sản xuất. Hai LM
DPI đã được thêm vào trước 25 LM H2O2 được thêm vào 8 h để nghiên cứu
ảnh hưởng của chất ức chế ROS trên VAL-A sản xuất.
2.4. Lấy mẫu và phân tích
tổng số 2 ml nước thịt được lấy từ ba bản sao mỗi 24 h
để phân tích trọng lượng tế bào khô, đường còn lại và VAL-A tập trung.
Để xác định nồng độ protein trong tế bào,
sợi nấm được ly tâm, rửa sạch và sau đó phân phối cho hai
Eppendorf ống, với lysozyme thêm vào một ống để Lyse
các tế bào theo báo cáo (Kieser et al., 2000). Phương pháp chuẩn Bradford
đã được sử dụng để xác định các protein phát hành từ các sợi nấm.
Tổng lượng đường còn lại được xác định bằng phenol- tiêu chuẩn
phương pháp axit sulfuric và VAL-A sản xuất bởi HPLC (Yu et al,.
2005; Liao et al., 2009).
2.5. RNA và QRT-PCR assay
Tổng RNA từ S. hygroscopicus 5008 được trích xuất bằng
TriZol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) là một giải pháp chiết xuất.
DNA dư được loại bỏ bằng DNase RNase free-I
(MBI Fermentas, Canada) theo để các nhà sản xuất của giao thức.
nồng độ RNA được xác định bằng cách sử dụng một Biophotometer Cộng
(Eppendorf, Đức). Phiên mã ngược được sử dụng đạt được tổng số
RNA là nguyên liệu đầu vào và các Nằm ở trên RNAase H
Firststrand bộ tổng hợp (Invitrogen). Các mức phiên mã của
valABC, valKLMN, valG và valPQ được xác định bằng định lượng
real-time RT-PCR (QRT-PCR) được thực hiện trên một Eppendorf
Mastercycler Realplex2 với One Step Kit PrimeScript ™ RT-PCR
(Takara) theo quy trình của nhà sản xuất. Phản ứng kiểm soát
được thiết lập bằng cách thêm RNA mà không phiên mã ngược thay vì
cDNA. Sau khi tiền làm biến tính ở 95 C trong 5 phút, khuếch đại xảy ra
theo hai bước: 15 s ở 95 C để làm biến tính, 15 s ở 60 C để ủ
và 30 s ở 72 C gia hạn cho 40 chu kỳ. Các trình tự của
các cặp mồi được liệt kê trong Bảng 1.
2.6. Đít