Low pressure gel filtration is the

Low pressure gel filtration is the easiest chromatographic method in principle, but it is the
hardest method to administer properly. Because gel filtration seems so straight forward,
liberties are sometimes taken in utilizing the method. For best results, attention to detail is
essential. Gel filtration (or size exclusion as the method is called in HPLC) separates
macromolecules by size. Size exclusion chromatography (SEC) is generally used as an
analytical HPLC method while gel filtration is used primarily in preparative protein
separations. Size exclusion HPLC utilizes small, rigid, uniform, spherical beads of 5
micrometer or 10 micrometer diameter. Small, porous, silica beads used in SEC provide
higher resolution than low pressure gel filtration. But, the price per ml of HPLC column
packing material is much higher than that of any soft gel used in low pressure applications.
For further discussion of HPLC, refer to the HPLC section later in this chapter.
Low pressure gels are comprised of small (20 to 300 micrometers) porous beads which,
unlike Fast Flow adsorption beads, have blind cul-de-sacs that provide differential flow
paths through the column. The largest molecules are unable to enter any pores, so they must
travel around the beads. This means that large molecules exit first while smaller molecules
spend some time inside the beads, so they exit later. The volume in which the very large
molecules exit (DNA, proteoglycans, ribosomes, lipid micelles, and protein complexes) is
called the void volume. The void volume, usually 25% of the total column volume, is often measured by the elution position of Blue Dextran (GE Healthcare), a covalently-dyed sugar
polymer having a molecular weight of 2 million Daltons. So, if the column volume (π r2 h) is
200 cubic centimeters (200 ml), the center of the Blue Dextran-calibrated void volume peak
will appear close to the 50 ml mark. The next 25% of the column volume (the second 50 ml
in this example) is the resolving zone, accessible to moderate size proteins. The final 50% of
the column volume (100 ml) is the zone in which peptides, very small proteins,
oligonucleotides, other small molecules and salt ions will elute. The total liquid volume in
the column (salt volume) is accepted as being either the total volume of the column, as
calculated from π r2 h, or it is the volume measured by adding a measurable salt to the
applied sample. The salt can be sodium chloride, detectable by conductivity, or sodium
nitrite, detected by its fairly strong absorbance at 280 nm.
Gel filtration is, intrinsically, a low resolution separation method for proteins, yet it is
frequently used in protein purification. Gel filtration is gentle to the sample and it is the best
preparative method for fractionating native proteins by size and shape. Passage though the
partially accessible pores in the beads will generate broad elution bands, each band lying
within just 25 percent of the total column volume, thus the intrinsically low resolution of the
method. Generally, the highest resolving columns, containing very small beads of soft gel
materials, like Sephadex G-100 Superfine (GE Healthcare) or BioGel P-100 minus 400 mesh
(BioRad Laboratories), operate under low gravitational force fields (50 cm pressure head, or
smaller). Beads used for relatively large proteins must have low degrees of cross-linking,
making the gels soft and highly compressible. For the most compressible beads (G-200
Sephadex, for example), pressure heads may need to be as small as 15 cm. In general, gel
filtration columns are able to give baseline resolution for no more than 4 proteins, each
differing in molecular weight by a factor of 2. So, under the best of conditions, a mixture of
globular proteins of MW 200,000, 100,000, 50,000, and 25,000 Daltons can be baseline
resolved.
Listed in Table 3 is a set of “best

Kết quả (Việt) 1:

Áp suất thấp gel lọc là phương pháp đơn giản nhất chromatographic về nguyên tắc, nhưng nó là cáckhó khăn nhất phương pháp để quản lý đúng cách. Bởi vì gel lọc có vẻ rất thẳng chuyển tiếp,tự do đôi khi được đưa vào sử dụng các phương pháp. Cho kết quả tốt nhất, sự chú ý đến từng chi tiết làđiều cần thiết. Gel lọc (hoặc kích cỡ loại trừ các phương pháp được gọi là trong hệ HPLC) táchđại phân tử bởi kích thước. Sắc kí loại trừ kích thước (SEC) thường được sử dụng như là mộtphân tích các phương pháp HPLC trong khi gel lọc được sử dụng chủ yếu trong đáo proteinđứt. Loại trừ kích thước hệ HPLC sử dụng hạt nhỏ, cứng nhắc, thống nhất, hình cầu của 5Panme đo hoặc 10 Panme đo đường kính. Nhỏ, xốp, silica hạt được sử dụng trong giây cung cấpđộ phân giải cao hơn áp suất thấp gel lọc. Tuy nhiên, giá mỗi ml HPLC cộtđóng gói vật liệu là cao hơn nhiều so với bất kỳ gel mềm được sử dụng trong các ứng dụng áp suất thấp.Để tiếp tục thảo luận về hệ HPLC, tham khảo phần hệ HPLC sau đó trong chương này.Áp suất thấp gel được bao gồm nhỏ (20-300 thước micrômét) xốp hạt mà,không giống như dòng chảy nhanh chóng hấp phụ hạt, có sỏi mù cung cấp vi phân luồngđường dẫn thông qua các cột. Các phân tử lớn nhất là không thể nhập vào bất kỳ lỗ chân lông, do đó, họ phảiđi du lịch khắp các hạt. Điều này có nghĩa rằng phân tử lớn thoát ra lần đầu tiên trong khi các phân tử nhỏ hơnchi tiêu một số thời gian bên trong hạt, để họ thoát ra sau đó. Khối lượng trong đó rất lớnlối ra phân tử (DNA, proteoglycans, ribosom, lipid micelles và khu phức hợp protein) làđược gọi là khối lượng khoảng trống. Khối void, thường 25% khối lượng tất cả cột, là thường được đo bằng vị trí elution của màu xanh Dextran (GE y tế), một đường một nhuộmpolymer có một trọng lượng phân tử của 2.000.000 Dalton. Vì vậy, nếu khối lượng cột (π r2 h) là200 cm khối (200 ml), Trung tâm đỉnh hiệu chỉnh màu xanh Dextran khối lượng khoảng trốngsẽ xuất hiện gần đánh dấu 50 ml. Tới 25% lượng cột (thứ hai 50 mltrong ví dụ này) là khu vực giải quyết, có thể truy cập trung bình kích thước protein. 50% cuối cùng củakhối lượng cột (100 ml) là khu vực trong đó peptide, protein rất nhỏ,oligonucleotides, các phân tử nhỏ và các ion muối sẽ elute. Tổng khối lượng chất lỏng trongcột (khối lượng muối) được chấp nhận như là một trong hai tổng khối lượng cột, nhưtính từ π r2 h, hoặc nó là thể tích đo bằng cách thêm một muối đo để cácứng dụng mẫu. Muối có thể là natri clorua, phát hiện bởi độ dẫn điện, hoặc natrinitrit, phát hiện bởi của nó hấp thu khá mạnh mẽ tại 280 nm.Gel lọc là, intrinsically, một phương pháp tách độ phân giải thấp cho protein, nhưng nó làthường xuyên được sử dụng trong protein thanh lọc. Gel lọc là nhẹ nhàng đến mẫu và nó là tốt nhấtđáo phương pháp cho fractionating bản xứ protein bởi kích thước và hình dạng. Đoạn văn mặc dù cáclỗ chân lông có thể truy cập một phần trong các hạt sẽ tạo ra các ban nhạc rộng elution, mỗi ban nhạc nói dốitrong vòng chỉ 25 phần trăm của khối lượng cột tất cả, do đó có độ phân giải intrinsically thấp của cácphương pháp. Nói chung, các cao nhất giải quyết cột, có hạt rất nhỏ của gel mềmvật liệu, giống như Sephadex G-100 Superfine (GE y tế) hoặc BioGel P-100 trừ 400 lưới(BioRad phòng thí nghiệm), hoạt động theo thấp trường lực hấp dẫn (50 cm áp lực đầu, hoặcnhỏ hơn). Hạt được sử dụng cho các protein tương đối lớn phải thấp độ khác nhau của qua,làm cho những gel mềm và rất nén. Cho đặt nén hạt (G-200Áp lực Sephadex, ví dụ), người đứng đầu có thể cần phải làm nhỏ như 15 cm. Nói chung, gellọc cột có thể cung cấp cho cơ sở giải quyết cho không quá 4 protein, mỗikhác nhau trong trọng lượng phân tử bởi một nhân tố của 2. Vì vậy, theo sắc nhất của điều kiện, một hỗn hợp củacụm sao cầu protein của MW 200.000, 100.000, 50.000 và 25.000 Dalton có thể là đường cơ sởgiải quyết.Được liệt kê trong bảng 3 là một tập hợp của "tốt nhất

Kết quả (Việt) 2:

Low lọc gel áp lực là phương pháp sắc ký đơn giản nhất về nguyên tắc, nhưng nó là
phương pháp khó khăn nhất để quản lý đúng cách. Bởi vì lọc gel có vẻ như vậy thẳng về phía trước,
tự do đôi khi được thực hiện trong việc sử dụng phương pháp này. Để có kết quả tốt nhất, chú ý đến chi tiết là
cần thiết. Gel lọc (hoặc loại trừ kích thước như các phương pháp được gọi là trong HPLC) chia tách
phân tử theo kích cỡ. Kích loại trừ sắc ký (SEC) thường được sử dụng như một
phương pháp HPLC phân tích, lọc gel được sử dụng chủ yếu trong protein chuẩn bị
phân ly. Kích trừ HPLC sử dụng nhỏ, cứng nhắc, đồng phục, hạt hình cầu của 5
micromet hoặc 10 đường kính micromet. Nhỏ, xốp, hạt silica được sử dụng trong SEC cung cấp
độ phân giải cao hơn lọc gel áp suất thấp. Nhưng, giá mỗi ml của HPLC cột
vật liệu đóng gói là cao hơn nhiều so với bất kỳ gel mềm được sử dụng trong các ứng dụng áp suất thấp.
Để thảo luận thêm về HPLC, hãy tham khảo phần HPLC sau trong chương này.
gel áp thấp được bao gồm nhỏ ( 20-300 micromet) hạt xốp đó,
không giống như nhanh Dòng chảy hạt hấp phụ, có mù cul-de-túi cung cấp khác biệt giữa dòng chảy
con đường xuyên qua cột. Các phân tử lớn nhất là không thể nhập vào bất kỳ lỗ chân lông, do đó họ phải
đi xung quanh các hạt. Điều này có nghĩa rằng các phân tử lớn thoát ra đầu tiên trong khi các phân tử nhỏ hơn
dành thời gian bên trong các hạt, để họ thoát sau đó. Khối lượng trong đó rất lớn
các phân tử thoát ra (DNA, proteoglycans, ribosome, mixen lipid, và protein) được
gọi là khối lượng hiệu. Khối lượng trống, thường là 25% tổng khối lượng cột, thường được đo bằng vị trí rửa giải của Blue Dextran (GE Healthcare), một loại đường đồng hóa trị-nhuộm
polymer có trọng lượng phân tử của 2 triệu Daltons. Vì vậy, nếu khối lượng cột (π r2 h) là
200 phân khối (200 ml), trung tâm của Blue Dextran-hiệu chỉnh âm lượng cực khoảng trống
sẽ xuất hiện gần đến vạch 50 ml. Tiếp theo 25% khối lượng cột (50 ml thứ hai
trong ví dụ này) là khu giải quyết, có thể truy cập vào các protein kích thước vừa phải. 50% thức của
khối lượng cột (100 ml) là vùng trong đó các peptide, rất protein nhỏ,
oligonucleotide, các phân tử nhỏ khác và các ion muối sẽ rửa giải. Tổng khối lượng chất lỏng trong
cột (khối lượng muối) được chấp nhận như là một trong hai tổng khối lượng của các cột, như
tính từ π r2 h, hoặc nó là khối lượng đo bằng cách thêm muối đo được với
mẫu áp dụng. Các muối có thể là clorua natri, bị phát hiện bởi tính dẫn điện, hoặc sodium
nitrite, phát hiện bằng cách hấp thụ khá mạnh tại 280 nm.
lọc gel là, về bản chất, một phương pháp tách phân giải thấp cho các protein, nhưng nó là
thường xuyên được sử dụng trong lọc protein. Lọc gel là nhẹ nhàng cho mẫu và nó là tốt nhất
phương pháp chuẩn bị cho chưng cất protein có nguồn gốc theo kích thước và hình dạng. Passage dù các
lỗ chân lông một phần truy cập trong hạt sẽ tạo ra băng rộng rửa giải, mỗi băng tần nằm
trong vòng chỉ 25 phần trăm của tổng khối lượng cột, do đó độ phân giải thấp bản chất của
phương pháp. Nói chung, các cột giải quyết cao nhất, chứa những hạt rất nhỏ của gel mềm
vật liệu, như Sephadex G-100 Superfine (GE Healthcare) hoặc BioGel P-100 trừ đi 400 lưới
(BioRad Laboratories), hoạt động theo trường lực hấp dẫn thấp (cột áp 50 cm hoặc
nhỏ hơn). Hạt được sử dụng cho các protein tương đối lớn phải có trình độ thấp của liên kết ngang,
làm cho gel mềm mại và rất chịu nén. Đối với các hạt nén nhất (G-200
Sephadex, ví dụ), người đứng đầu áp có thể cần phải được làm nhỏ như 15 cm. Nói chung, gel
cột lọc có thể cung cấp cho độ phân giải cơ bản không quá 4 protein, mỗi
khác nhau về trọng lượng phân tử bằng một hệ số 2. Vì vậy, dưới sự tốt nhất của điều kiện, một hỗn hợp của các
protein hình cầu của MW 200.000, 100.000, 50.000 , và 25.000 Daltons có thể cơ bản
được giải quyết.
Được liệt kê trong Bảng 3 là một tập hợp các "tốt nhất