ow rate of 1.0 ml min−1. Pooled lac

ow rate of 1.0 ml min−1. Pooled laccase fractions were lyophilized and re-suspended in 10 mM ammonium acetate (pH 5.0). Finally, laccase was purified to apparent homogeneity on a Superdex 220 GL gel filtration column (300× 10 mm; Amersham Biosciences) coupled to the BioLogic HR system mentioned before. Laccase was eluted with 0.1 M ammonium acetate buffer (pH 5.0) at a flow rate of 0.5 ml min−1. Protein concentrations were determined using the BCA protein kit (Novagen, Darmstadt, Germany). Bovine serum albumin served as an external standard.
Structural characterization of the purified laccase Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDSPAGE) was carried out on a Mini PROTEAN 3 electrophoresis chamber (Bio-Rad), using a 4% (w/v) stacking gel and a 10% resolving gel. Laccase samples were denatured by dilution in 2 volumes of Laemmli buffer (Bio-Rad) containing 5% β-mercaptoethanol and incubated at 95°C for 5 min. The apparent molecular mass of the purified enzyme was determined by comparison with commercial molecular mass marker proteins (SDS-PAGE standards, low range, Bio-Rad) after visualizing the protein bands with an ultrasensitive colloidal Coomassie Brilliant Blue (CBB) staining solution consisting of 0.1% CBB G-250 (Bio-Rad), 2% ortho phosphoric acid, and 0.76 M (NH4)2SO4 (Neuhoff et al. 1985). Additionally, glycosylation of the laccase protein was visualized using the GelCode® glycoprotein staining kit (Pierce Biotechnology, Rockford, USA), according to the manufacturer’s protocol. The molecular mass of laccase visualized upon glycostaining was determined by comparison with the PageRuler™ pre-stained protein ladder (Fermentas, St. Leon-Rot, Germany).
Isoelectric focusing (IEF) was performed on a Multiphor II gel electrophoresis system (Pharmacia Biotech, Piscataway, USA), using Servalyt Precotes® 3-10 (Serva, Heidelberg, Germany) according to the manufacturer’s protocol. Low isoelectric point (2.8–6.5) IEF markers (Amersham) were used to determine the isoelectric point. Marker proteins were stained with colloidal CBB G-250, and the laccase band was visualized by activity staining with ABTS as previously described (Junghanns et al. 2005). Laccase-specific protein bands were cut out from SDSPAGE gels and digested overnight using trypsine (SigmaAldrich) as described elsewhere (Shevchenko et al. 1996). The cleaved peptides were eluted, concentrated by vacuum centrifugation, and thereafter separated by reversed phase nano-liquid chromatography (LC1100 series, Agilent Technologies, Paolo Alto, CA, USA; column: Zorbax 300SBC18, 3.5 μm, 150×0.075 mm; eluate, gradient of 0 to 60% acetonitrile in 0.1% formic acid). The peptides were identified by on-line tandem mass spectrometry (MS/MS) (LC/MSD TRAP XCT mass spectrometer,

Kết quả (Việt) 1:

ow tỷ lệ của 1.0 ml min−1. Gộp laccase phân số sản và tái bị đình chỉ trong 10 mM amoni axetat (pH 5,0). Cuối cùng, laccase tinh khiết để rõ ràng tính đồng nhất trên cột lọc gel Superdex 220 GL (300 × 10 mm; Amersham Biosciences) cùng với hệ thống sinh học nhân sự đã đề cập trước. Laccase eluted với 0.1 M amoni axetat đệm (pH 5,0) tại một tỷ lệ lưu lượng cách 0.5 ml min−1. Nồng độ protein đã được xác định bằng cách sử dụng kit protein BCA (Novagen, Darmstadt, Đức). Bò huyết thanh albumin phục vụ như là một tiêu chuẩn bên ngoài.Các đặc tính cấu trúc của tinh khiết laccase natri dodecyl sulfat polyacrylamide gel electrophoresis (SDSPAGE) được thực hiện trên một Mini chỉ 3 electrophoresis buồng (Bio-Rad), bằng cách sử dụng một gel xếp chồng 4% (w/v) và một 10% giải quyết gel. Laccase mẫu đã denatured bởi pha loãng trong 2 tập của bộ đệm Laemmli (Bio-Rad) có chứa 5% β-mercaptoethanol và ủ tại 95° C trong 5 phút. Khối lượng phân tử rõ ràng của enzym tinh khiết được xác định nguồn thương mại điểm đánh dấu khối lượng phân tử protein (SDS-trang tiêu chuẩn, phạm vi thấp, Bio-Rad) sau khi visualizing các protein ban nhạc với một ultrasensitive chất keo Coomassie Brilliant Blue (CBB) nhuộm giải pháp bao gồm 0,1% CBB G-250 (Bio-Rad), 2% axit photphoric ortho và 0,76 M (NH4) 2SO4 (Neuhoff et al. 1985). Ngoài ra, glycosylation laccase protein được hình dung bằng cách sử dụng GelCode® glycoprotein nhuộm kit (Pierce Biotechnology, Rockford, Mỹ), theo giao thức của nhà sản xuất. Khối lượng phân tử của laccase hình dung khi glycostaining được xác định nguồn các bậc thang trước màu protein PageRuler™ (Fermentas, St. Leon-Rot, Đức).Isoelectric tập trung (IEF) được thực hiện trên một Multiphor gel electrophoresis hệ thống II (công nghệ sinh học Pharmacia, Piscataway, Mỹ), bằng cách sử dụng Servalyt Precotes® 3-10 (Serva, Heidelberg, Đức) theo giao thức của nhà sản xuất. Đánh dấu điểm isoelectric thấp (2,8-6,5) IEF (Amersham) được sử dụng để xác định điểm isoelectric. Đánh dấu protein đã được nhuộm màu với chất keo CBB G-250, và ban nhạc laccase được hình dung bởi hoạt động nhuộm với ABTS như mô tả trước đó (Junghanns et al. 2005). Ban nhạc dành riêng cho laccase protein được cắt ra từ SDSPAGE gel và tiêu hóa qua đêm bằng cách sử dụng trypsine (SigmaAldrich) như mô tả ở nơi khác (Shevchenko et al. 1996). Peptide cleaved eluted, tập trung bởi số chân không, và sau đó tách ra bằng sắc kí chất lỏng nano ngược pha (LC1100 loạt, các công nghệ Agilent, Paolo Alto, CA, USA; cột: Zorbax 300SBC18, 3,5 μm, 150 × 0.075 mm; eluate, gradient của acetonitrile 0 đến 60% trong axit formic 0,1%). Các peptide được xác định bởi on-line tandem mass spectrometry (MS/MS) (LC/MSK bẫy XCT khối phổ kế,

Kết quả (Việt) 2:

tỷ lệ ow 1,0 ml min-1. Phân số laccase gộp được đông khô và lại bị đình chỉ trong 10 mM amoni axetat (pH 5.0). Cuối cùng, laccase được thanh tẩy để đồng nhất rõ ràng trên Superdex 220 GL cột lọc gel (300 × 10 mm; Amersham Biosciences) cùng với hệ thống nhân sự sinh học đề cập trước đây. Laccase được tách rửa với 0,1 ammonium acetate M đệm (pH 5.0) với tốc độ dòng chảy 0,5 ml min-1. Nồng độ protein được xác định bằng cách sử dụng bộ protein BCA (Novagen, Darmstadt, Đức). Albumin huyết thanh bò phục vụ như là một tiêu chuẩn bên ngoài.
Đặc tính cấu trúc của laccase tinh khiết Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDSPAGE) đã được thực hiện trên một chiếc Mini protean 3 buồng điện di (Bio-Rad), sử dụng 4% (w / v) xếp chồng gel và giải quyết gel 10%. Mẫu Laccase đã được biến tính bằng cách pha loãng trong 2 tập của Laemmli đệm (Bio-Rad) có chứa 5% β-mercaptoethanol và ủ ở 95 ° C trong 5 phút. Khối lượng phân tử biểu của enzyme tinh khiết đã được xác định bằng cách so sánh với các protein thương mại phân tử khối đánh dấu (SDS-PAGE tiêu chuẩn, phạm vi thấp, Bio-Rad) sau khi hình dung băng protein với một chất keo siêu nhạy Coomassie giải pháp Brilliant Blue (CBB) nhuộm gồm 0,1% CBB G-250 (Bio-Rad), 2% ortho axit phosphoric, và 0,76 M (NH4) 2SO4 (Neuhoff et al. 1985). Ngoài ra, glycosyl hóa protein laccase được hình dung bằng cách sử dụng bộ GelCode® glycoprotein nhuộm (Pierce Công nghệ sinh học, Rockford, Mỹ), theo giao thức của nhà sản xuất. Khối lượng phân tử của laccase hình dung khi glycostaining được xác định bằng cách so sánh với PageRuler ™ trước màu thang protein (Fermentas, St. Leon-Rot, Đức).
Đẳng điện tập trung (IEF) đã được thực hiện trên một hệ thống điện di gel Multiphor II (Pharmacia Biotech , Piscataway, Mỹ), sử dụng Servalyt Precotes® 3-10 (Serva, Heidelberg, Đức) theo giao thức của nhà sản xuất. Điểm đẳng điện thấp (2,8-6,5) IEF dấu (Amersham) đã được sử dụng để xác định điểm đẳng điện. Protein Marker đã được nhuộm màu với keo CBB G-250, và ban nhạc laccase được hình dung bằng cách hoạt động nhuộm với ABTS như mô tả trước đây (Junghanns et al. 2005). Băng protein Laccase cụ thể đã được cắt ra từ gel SDSPAGE và tiêu hóa qua đêm bằng trypsine (Sigma-Aldrich) như mô tả ở nơi khác (Shevchenko et al. 1996). Các peptide chẻ được tách rửa, tập trung bằng cách ly tâm chân không, và sau đó tách ra bởi giai đoạn đảo ngược nano-sắc ký lỏng (loạt LC1100, Agilent Technologies, Paolo Alto, CA, Hoa Kỳ; cột: Zorbax 300SBC18, 3,5 mm, 150 × 0.075 mm; rửa giải, gradient của 0-60% acetonitrile trong 0,1% axit formic). Các peptide đã được xác định bởi trên đường song song khối phổ (MS / MS) (LC / MSD TRAP XCT khối phổ kế,