To check for the assay variations f

To check for the assay variations for 25OHD3 and
25OHD2, a multilevel certified reference material (CRM)
serum calibrator set (Chromsystems, Germany) was also
used (based on human serum) and handled in the same manner as volunteer specimens [3]. The CRM calibrators
were analysed along with routine samples to meet the
standards outlined by National Institute of Standards and
Technology (NIST). External quality control samples
from the International Vitamin D External Quality Assessment
Scheme (DEQAS) were analysed for comparison
with other participating laboratories already using LCMS/MS
for 25OHD3 and 25OHD2 analysis.
Validation results
Intra-day and inter-day precision and accuracy are
shown in Table 1. The absolute recoveries of the analytes
range from 88.2 to 97.8% and internal standard 89.6%.
Relative recoveries for analytes ranged from 89.8 to
98.2% and internal standard 89.9%. The r2 in Table 1
represents linear regression, where all the results are
presented in units of nmol/L.
Under- or over-estimation of actual 25OHD3 concentrations
may occur owing to co-eluting epimers (e.g.
3-epi-25OHD3) and isobars (e.g. 7αC4). The endogenous
bile acid precursor 7α-hydroxy-4-cholestene-3-one
(7αC4) may cause isobaric inference in MS assays [3].
The use of high resolution microbore tandem column
technology not only chromatographically separated all
isobars and epimers from 25OHD co-eluting peaks but
also facilitated accurate and sensitive determination of
the analyte ions by sequential application of three periods during an MS/MS run. The protonated molecules,
[M + H]+
, the precursor ions and the diagnostic
product ions were monitored in the multiple reactions
monitoring (MRM) mode. The MRM parameters were
optimised for each analyte using a direct infusion of
0.1 μg/mL individual solutions and of standard compounds
mixture. The MRM sequence consisted of three
periods executed sequentially to monitor different transition
pairs using parameters optimised for each period.
The most abundant MRM transitions for each analyte
were acquired using the conditions given in Table 2.
Profiles of vitamin D analogues
The results from the pooled DEQAS samples are given
in Figure 2 revealing that all analogues were quantifiable.
As expected, the highest level was recorded for 25OHD3
with 25OHD2 present at a considerable level in all samples.
The C-3 epimer of 25OHD3 and 1α25(OH)2D2
were quantified in most samples, whereas the 1α25(OH)2
D2 and 3-epi-25OHD2 were only present in one sample
(410), which contained a significant amount of endogenous
25OHD2. It should be noted, however, that these are pooled
samples from donors undergoing treatment and thus are
used for the purposes of assay comparisons.
The Bland-Altman and correlation plots (Figure 3)
show the level of agreement and relationship between
the new method and the All Laboratory Trimmed Mean
(ALTM) data provided with the DEQAS sample. The
analytical data 25OHD for the individual samples are
presented in Figure 4 with detailed results given in
Additional file 1. As the Bland-Altman plot showed no
proportional bias (r2 = 0.0341, p = 0.376), the classic 96%
confidence interval approach was applied using the
Bland-Altman formula (mean difference ± 1.96SD) to set
the limits of agreement. Of the total 25 samples, 15 were
within the limits of agreement by Bland-Altman limit of
agreement (Figure 3A); and 18 were within the DEQAS
CV = 30.0 limit (Figure 4). Generally, the 25OHD concentration
level measures falling outside the BlandAltman
and DEQAS limits were recorded at a lower
level than the DEQAS’ ALTM means and confidence
intervals. A strong positive relationship was evidenced between
the new assay and the ALTM (r = 0.72, p < 0.001).
Our data were within the limit of tolerance of the subset of
5 pooled DEQAS samples (for samples 396–400) which
were analysed by the Centers for Disease Control and Prevention
(Atlanta) with known 3-epi-25OHD3 levels.
Our results for the serum pools averaged −11.8% from
the overall DEQAS-ALTM for the participating laboratories using LC-MS/MS methods. However, we did see a diversification
in some samples that afforded higher concentrations
of the 25OHD. Thus, as seen in Figure 4, five results for the
new assay lie below the range of the DEQAS data (383,
401, 407, 409, 415), with two samples being above the
DEQAS (384, 397).
Conclusion
In conjunction with the ability to separate 7αC4, the assay
is capable of distinguishing between every major form of
vitamin D reported to date. The results show that the new
assay’s ability to quantify 25OHD levels is comparable to
other LC-MS/MS methods represented in the DEQAS
data, thus the simultaneous measures of eight analogues
does not compromise its analytical capability for assessing
the commonly used biomarker (25OHD) for vitamin D
status. In contrast, it adds a significant capability to identify
potential issues such as conversion of primary forms
to circulating or highly active forms [19]. However, the
additional capability of the new assay, namely the ability of
not only excluding but also quantifying 3-epimers of D2
and D3, along with the primary forms (D2 and D3),
1,25α(OH)2D3 and 1,25α(OH)2D2, makes this assay instrumental
in research and clinical practice where specific
and accurate measurement of the different forms is
required.

Kết quả (Việt) 1:

Để kiểm tra các biến thể khảo nghiệm cho 25OHD3 và25OHD2, một đa chứng nhận tài liệu tham khảo (CRM)đã thiết lập calibrator huyết thanh (Chromsystems, Đức) cũngsử dụng (dựa trên huyết thanh của con người) và xử lý theo cách thức tương tự như là tình nguyện viên mẫu vật [3]. Các bộ định cỡ CRMđã phân tích cùng với mẫu thường xuyên để đáp ứng cáctiêu chuẩn vạch ra bởi viện tiêu chuẩn quốc gia vàCông nghệ (NIST). Bên ngoài kiểm soát chất lượng mẫutừ việc đánh giá chất lượng bên ngoài quốc tế Vitamin DChương trình (DEQAS) đã được phân tích để so sánhvới phòng thí nghiệm tham gia khác đã sử dụng LCMS/MSđể phân tích 25OHD3 và 25OHD2.Xác nhận kết quảIntra-ngày và liên ngày chính xác và độ chính xácHiển thị trong bảng 1. Phục hồi tuyệt đối của các analytesphạm vi từ số 88.2 97,8% và nội bộ tiêu chuẩn 89,6%.Các phục hồi tương đối cho analytes trải dài từ 89,8 để98,2% và nội bộ tiêu chuẩn 89,9%. R2 trong bảng 1đại diện cho hồi qui tuyến tính, tất cả các kết quả đang ở đâutrình bày trong các đơn vị của nmol/L.Dưới - hoặc qua - estimation nồng độ thực tế 25OHD3có thể xảy ra do đồng eluting (ví dụ: epimers3-epi-25OHD3) và isobars (ví dụ như 7αC4). Các nội sinhtiền thân mật axit 7α-hydroxy-4-cholestene-3-one(7αC4) có thể gây ra quá suy luận trong MS thử nghiệm [3].Sử dụng độ phân giải cao microbore dọc cộtcông nghệ không chỉ chromatographically tách ra tất cảisobars và epimers từ 25OHD đồng eluting đỉnh nhưngcũng tạo điều kiện xác định chính xác và nhạy cảmCác ion analyte bởi các ứng dụng tuần tự trong ba giai đoạn trong một MS/MS chạy. Các phân tử protonated,[M + H] +, tiền thân của ion và chẩn đoánsản phẩm ION được giám sát trong các phản ứng nhiềuGiám sát (MRM) chế độ. Các tham số MRMtối ưu hóa cho mỗi analyte bằng cách sử dụng một truyền trực tiếp của0.1 μg/mL giải pháp cá nhân và tiêu chuẩn hợp chấthỗn hợp. Dãy MRM bao gồm bathời gian thực hiện tuần tự để giám sát quá trình chuyển đổi khác nhauCặp dùng tham số tối ưu hóa cho từng thời kỳ.Quá trình chuyển đổi MRM phổ biến nhất cho mỗi analyteđược mua bằng cách sử dụng các điều kiện được đưa ra trong bảng 2.Hồ sơ của vitamin D analoguesCác kết quả từ những DEQAS mẫu được đưa ratrong hình 2 tiết lộ rằng tất cả analogues được định lượng.Theo dự kiến, mức cao nhất được ghi lại cho 25OHD3với 25OHD2 hiện diện ở một mức độ đáng kể trong tất cả các mẫu.Epimer C-3 của 25OHD3 và 1α25 (OH) 2D 2được định lượng ở hầu hết các mẫu, trong khi 1α25 (OH) 2D2 và 3-epi-25OHD2 đã được chỉ hiện diện trong một mẫu(410), mà chứa một số lượng đáng kể của nội sinh25OHD2. cần lưu ý, Tuy nhiên, chúng được gộp lạimẫu từ các nhà tài trợ điều trị và do đóđược sử dụng cho mục đích so sánh khảo nghiệm.Tỉnh Bland-Altman và tương quan lô (hình 3)Hiển thị mức độ cam kết và mối quan hệ giữaCác phương pháp mới và các tất cả phòng thí nghiệm tỉa có nghĩa làDữ liệu (ALTM) cung cấp với mẫu DEQAS. Cácphân tích dữ liệu 25OHD cho các mẫu cá nhântrình bày trong hình 4 với chi tiết kết quả được đưa ra trongTệp bổ sung 1. Là tỉnh Bland-Altman đồ thị cho thấy không cóthiên vị tỉ lệ (r2 = 0.0341, p = 0.376), cổ điển 96%cách tiếp cận khoảng tin cậy đã được áp dụng bằng cách sử dụng cácBland-Altman công thức (có nghĩa là sự khác biệt ± 1.96SD) để thiết lậpCác giới hạn của thỏa thuận. 25 mẫu tất cả, 15 đãtrong các giới hạn của thỏa thuận của Bland-Altman giới hạn củathỏa thuận (con số 3A); và 18 đang ở trong các DEQASCV = 30.0 giới hạn (hình 4). Nói chung, là sự tập trung 25OHDCác biện pháp cấp rơi bên ngoài BlandAltmanvà DEQAS giới hạn đã được thu âm tại thấp hơncấp hơn DEQAS' ALTM phương tiện và sự tự tinkhoảng thời gian. Một mối quan hệ tích cực mạnh đã được chứng minh giữaCác khảo nghiệm mới và ALTM (r = 0,72, p < 0,001).Dữ liệu của chúng tôi đang ở trong giới hạn của sự khoan dung của tập hợp con của5 những DEQAS mẫu (cho mẫu 396-400) màđã được phân tích bởi các trung tâm kiểm soát dịch bệnh và phòng ngừa(Atlanta) cấp 3-epi-25OHD3 được biết đến.Chúng tôi kết quả cho hồ bơi huyết thanh trung bình −11.8% từtổng thể DEQAS-ALTM cho các phòng thí nghiệm tham gia bằng cách sử dụng phương pháp LC-MS/MS. Tuy nhiên, chúng tôi đã nhìn thấy sự đa dạng hóatrong một số mẫu dành nồng độ cao hơncủa 25OHD. Vì vậy, như đã thấy trong hình 4, năm kết quả cho cácmới khảo nghiệm nằm dưới dãy dữ liệu DEQAS (383,401, 407, 409, 415), với hai mẫu đang ở trên cácDEQAS (384, 397).Kết luậnKết hợp với khả năng tách 7αC4, các khảo nghiệmcó khả năng phân biệt giữa mọi hình thức chính củavitamin D báo cáo đến nay. Kết quả cho thấy mớikhả năng của khảo nghiệm định lượng 25OHD cấp được so sánh vớiCác phương pháp khác của LC-MS/MS đại diện trong các DEQASdữ liệu, do đó là các biện pháp đồng thời của tám analogueskhông thỏa hiệp của nó khả năng phân tích để đánh giábiomarker (25OHD) thường được sử dụng cho vitamin Dtrạng thái. Ngược lại, nó cho biết thêm một khả năng đáng kể để xác địnhCác vấn đề tiềm năng như chuyển đổi hình thức chínhđể lưu hành hoặc cao hoạt động các hình thức [19]. Tuy nhiên, cáccác khả năng bổ sung của các khảo nghiệm mới, cụ thể là khả năng củakhông chỉ trừ nhưng cũng định lượng 3-epimers của D2và D3, cùng với các hình thức chính (D2 và D3),1, 25α (OH) 2D 3 và 1, 25α (OH) 2D 2, làm cho khảo nghiệm này công cụtrong nghiên cứu và thực hành lâm sàng trong trường hợp cụ thểvà đo chính xác của các hình thức khác nhau làyêu cầu.

Kết quả (Việt) 2:

Để kiểm tra các biến thể khảo nghiệm cho 25OHD3 và
25OHD2, một tài liệu tham khảo được chứng nhận (CRM) multilevel
calibrator huyết thanh tập (Chromsystems, Đức) cũng được
sử dụng (dựa trên huyết thanh người) và xử lý theo cách tương tự như mẫu tình nguyện viên [3]. Các calibrators CRM
đã được phân tích cùng với các mẫu thường xuyên để đáp ứng các
tiêu chuẩn được nêu bởi Viện Tiêu chuẩn và
Công nghệ (NIST). Mẫu kiểm soát chất lượng từ bên ngoài
từ những đánh giá chất lượng Vitamin D đối ngoại quốc tế
Scheme (DEQAS) được phân tích để so sánh
với các phòng thí nghiệm tham gia khác đã sử dụng LCMS / MS
cho 25OHD3 và 25OHD2 phân tích.
Validation quả
Intra-day và chính xác giữa các ngày và độ chính xác được
hiển thị trong Bảng 1. Các đợt hồi phục tuyệt đối của các chất phân tích
dao động 88,2-97,8% và tiêu chuẩn nội bộ 89,6%.
phục hồi tương đối cho chất phân tích dao động 89,8 để từ
98,2% và tiêu chuẩn nội bộ 89,9%. Các r2 trong Bảng 1
thể hiện hồi quy tuyến tính, nơi mà tất cả các kết quả được
trình bày trong đơn vị của nmol / L.
Rửa non hay quá trời ước tính nồng độ 25OHD3 thực tế
có thể xảy ra do tác tẩy rửa epimers (ví dụ như
3-epi-25OHD3) và isobars (ví dụ như 7αC4). Các nội sinh
acid mật tiền thân 7α-hydroxy-4-cholestene-3-one
(7αC4) có thể gây ra suy luận đẳng áp trong MS xét nghiệm [3].
Việc sử dụng độ phân giải cao cột microbore tandem
công nghệ không chỉ sắc ký tách tất cả
isobars và epimers từ 25OHD đồng -eluting đỉnh nhưng
cũng tạo điều kiện xác định chính xác và nhạy cảm của
các ion chất phân tích bằng cách áp dụng tuần tự ba giai đoạn trong một MS / MS chạy. Các phân tử proton,
[M + H]
+, các ion tiền chất và các chẩn đoán
ion sản phẩm được theo dõi trong nhiều phản ứng
giám sát (MRM) chế độ. Các thông số MRM đã được
tối ưu hóa cho mỗi chất phân tích bằng cách sử dụng một truyền trực tiếp của
0,1 mg / mL giải pháp cá nhân và các hợp chất tiêu chuẩn
hỗn hợp. Trình tự MRM gồm ba
giai đoạn thực hiện tuần tự theo dõi quá trình chuyển đổi khác nhau
cặp sử dụng các thông số tối ưu cho từng giai đoạn.
Giai đoạn chuyển tiếp MRM phong phú nhất cho mỗi chất phân tích
đã được thu thập bằng cách sử dụng các điều kiện được đưa ra trong Bảng 2.
Profiles của vitamin D analogues
Kết quả từ DEQAS gộp mẫu được đưa ra
trong hình 2 tiết lộ rằng tất cả các chất tương tự đã định lượng được.
Theo dự kiến, mức cao nhất được ghi nhận cho 25OHD3
với 25OHD2 mặt tại một mức độ đáng kể trong tất cả các mẫu.
Các C-3 epimer của 25OHD3 và 1α25 (OH) 2d2
được định lượng trong hầu hết các mẫu, trong khi 1α25 (OH) 2
D2 và 3-epi-25OHD2 là chỉ xuất hiện trong một mẫu
(410), trong đó có một số lượng đáng kể các nội sinh
25OHD2. Cần lưu ý, tuy nhiên, những được gộp lại
mẫu từ các nhà tài trợ đang được điều trị và do đó được
sử dụng cho các mục đích so sánh khảo nghiệm.
Các Bland-Altman và các lô tương quan (Hình 3)
cho thấy mức độ thỏa thuận và mối quan hệ giữa
các phương pháp mới và Phòng thí nghiệm Tất cả Trimmed Mean
(ALTM) dữ liệu được cung cấp với các mẫu DEQAS. Các
phân tích 25OHD dữ liệu cho các mẫu cá nhân được
trình bày trong Hình 4 với kết quả chi tiết được đưa ra trong
bổ sung tập tin 1. Khi lô-Altman Bland cho thấy không có
sự thiên vị theo tỷ lệ (r2 = 0,0341, p = 0,376), các cổ điển 96%
tiếp cận khoảng tin cậy là áp dụng bằng cách sử dụng
công thức Bland-Altman (có nghĩa là sự khác biệt ± 1.96SD) để thiết lập
các giới hạn của thỏa thuận. Trong tổng số 25 mẫu, 15 là
trong giới hạn của thỏa thuận của Bland-Altman giới hạn của
thỏa thuận (hình 3A); và 18 đều nằm trong giới DEQAS
CV = 30,0 hạn (Hình 4). Nói chung, nồng độ 25OHD
biện pháp cấp nằm ngoài BlandAltman
giới hạn và DEQAS được ghi nhận tại một thấp hơn
mức hơn phương tiện ALTM của DEQAS và sự tự tin
khoảng thời gian. Một mối quan hệ tích cực mạnh mẽ đã được chứng minh giữa
các khảo nghiệm mới và ALTM (r = 0,72, p <0,001).
Số liệu của chúng đều nằm trong giới hạn chịu đựng của các tập hợp con của
5 mẫu gộp DEQAS (cho mẫu 396-400) mà
đã được phân tích bởi Trung Tâm Kiểm Soát và Ngừa Bệnh
(Atlanta) với mức 3-epi-25OHD3 biết.
Kết quả của chúng tôi cho các hồ bơi trong huyết thanh trung bình -11,8% từ
tổng thể DEQAS-ALTM cho các phòng thí nghiệm tham gia sử dụng LC-MS / MS phương pháp. Tuy nhiên, chúng tôi đã nhìn thấy một sự đa dạng hóa
trong một số mẫu mà dành nồng độ cao hơn
của 25OHD. Vì vậy, như đã thấy trong hình 4, năm kết quả cho
lời nói dối khảo nghiệm mới dưới phạm vi của dữ liệu DEQAS (383,
401, 407, 409, 415), với hai mẫu là trên
DEQAS (384, 397).
Kết luận
Cùng với khả năng tách 7αC4, khảo nghiệm
khả năng phân biệt giữa tất cả các hình thức chủ yếu của
vitamin D báo cáo cho đến nay. Kết quả cho thấy rằng, các
khả năng xét nghiệm để định lượng mức 25OHD được so sánh với
các phương pháp LC-MS / MS khác đại diện trong DEQAS
dữ liệu, do đó các biện pháp đồng thời của tám tương tự
không thỏa hiệp khả năng phân tích của mình để đánh giá
các dấu ấn sinh học thường được sử dụng (25OHD) cho vitamin D
trạng thái. Ngược lại, nó thêm một khả năng quan trọng để xác định
các vấn đề tiềm năng như chuyển đổi các hình thức chính
để lưu thông hoặc các hình thức hoạt động rất mạnh [19]. Tuy nhiên,
khả năng bổ sung của các xét nghiệm mới, cụ thể là khả năng của
không chỉ loại trừ mà còn định lượng 3-epimers của D2
và D3, cùng với các dạng nguyên sinh (D2 và D3),
1,25α (OH) 2D3 và 1,25α (OH) 2d2, làm xét nghiệm này cụ
trong nghiên cứu và thực hành lâm sàng nơi cụ
đo lường và chính xác của các hình thức khác nhau được
yêu cầu.