Chemicals All chemicals were of ana

Chemicals All chemicals were of analytical grade, unless otherwise stated. 2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6sulfonate) (ABTS), syringaldazine, and vanillic acid were purchased from Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany). Unless otherwise stated in the text, all other materials were purchased from Merck (Darmstadt, Germany).
Fungal strain and culture conditions The isolation of Myrioconium sp. strain UHH 1-13-18-4 from the river Saale (Central Germany), its identification, and its maintenance has previously been described (Junghanns et al. 2007). Myrioconium sp. UHH 1-13-18-4 represents a mitosporic isolate connected to the Helotiales, ascomycetes. For laccase production, liquid cultures of Myrioconium sp. in Erlenmeyer flasks (250 ml) containing 75 ml of a 1% (w/v) malt extract medium (pH 5.6–5.8) were incubated at 14°C and 120 rpm in the dark. To stimulate laccase production, 50 μM CuSO4 and 1 mM vanillic acid were added to fungal cultures 3 days after inoculation (Junghanns et al. 2005). Cultures were harvested after a total cultivation time of 16 days, and laccase was isolated from the cell-free culture supernatant.
Laccase isolation and purification Mycelia were removed from culture supernatants by filtration (Whatman no. 4 filter papers, Dassel, Germany). The cell-free culture supernatants were concentrated by ultrafiltration with a tangential-flow membrane filter (polysulfone minisette, 10 kDa cut-off; Pall Filtron, East Hills, USA). Thereafter, the ultrafiltration retentate was washed several times with 10 mM sodium acetate buffer (pH 5.5), and 20 μM phenylmethylsulfonylfluoride was added to inhibit proteases. To remove dark-brown colored material from the retentate, (NH4)2SO4 was added at 30% saturation and the preparation was left at 4°C overnight. The resulting precipitate was removed by centrifugation at 20,817×g for 30 min. The laccase-containing supernatant was applied to a disposable PD-10 desalting column (PD-10, Sephadex, 50×10 mm; Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) and eluted with 10 mM sodium acetate buffer (pH 5.5). Laccase-containing fractions were pooled and applied to a BioLogic HR protein liquid chromatography system (Bio-Rad, Munich, Germany) equipped with a MonoQ anion exchange column (50×5 mm; Amersham Biosciences). Laccase was eluted with a linear gradient of 0 to 0.5 M NaCl in 10 mM ammonium acetate (pH 5.0) at a

Kết quả (Việt) 1:

Hóa chất tất cả hóa chất đã phân tích cấp, trừ khi được nêu. 2,2′-Azino-Bis(3-ethylbenzthiazoline-6sulfonate) (ABTS), syringaldazine và vanillic axít được mua từ Sigma-Aldrich (Steinheim, Đức). Trừ khi được nêu trong văn bản, tất cả các tài liệu khác đã được mua từ Merck (Darmstadt, Đức).Nấm điều kiện căng thẳng và nền văn hóa sự cô lập của Myrioconium sp. căng UHH 1-13-18-4 từ sông Saale (trung Đức), nhận dạng của nó, và bảo trì của nó trước đó đã miêu tả (Junghanns et al. 2007). Myrioconium sp. UHH 1-13-18-4 đại diện cho một isolate mitosporic kết nối với Helotiales, ascomycetes. Laccase sản xuất, chất lỏng các nền văn hóa Myrioconium sp. ở Erlenmeyer bình (250 ml) có chứa 75 ml phương tiện chiết xuất mạch Nha 1% (w/v) (pH 5.6 – 5,8) đã được ủ tại 14° C và 120 vòng/phút trong bóng tối. Để kích thích sản xuất laccase, 50 μM CuSO4 1 mM vanillic axit và được thêm vào nền văn hóa nấm 3 ngày sau khi tiêm chủng (Junghanns et al. 2005). Nền văn hóa đã được thu hoạch sau một thời gian tất cả trồng trọt 16 ngày, và laccase bị cô lập từ tế bào miễn phí văn hóa supernatant.Laccase cô lập và tinh chế Mycelia đã được gỡ bỏ từ văn hóa supernatants bởi lọc (giấy lọc tráng nhựa Whatman số 4, Dassel, Đức). Supernatants di động miễn phí văn hóa đã được tập trung bởi siêu lọc với một tiếp tuyến luồng màng lọc (polysulfone minisette, 10 kDa cắt; Pall Filtron, East Hills, Hoa Kỳ). Sau đó, retentate siêu lọc được rửa sạch nhiều lần với 10 mM natri axetat đệm (pH 5,5), và 20 μM phenylmethylsulfonylfluoride đã được bổ sung để ức chế protease. Để loại bỏ các vật liệu màu nâu bóng tối từ retentate, (NH4) 2SO4 được bổ sung vào 30% độ bão hòa và chuẩn bị còn ở 4° C qua đêm. Kết quả precipitate đã được gỡ bỏ bởi số lúc 20 g 817 × trong 30 phút. Laccase có chứa supernatant được áp dụng cho một lần PD-10 desalting cột (PD-10, Sephadex, 50 × 10 mm; Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Vương Quốc Anh) và eluted với 10 mM natri axetat đệm (pH 5,5). Laccase có chứa các phần phân đoạn đã được gộp lại và áp dụng cho một sinh học HR protein sắc kí lỏng hệ thống (Bio Rad, Mu-ních, Đức) được trang bị với một MonoQ anion trao đổi cột (50 × 5 mm; Amersham Biosciences). Laccase eluted với một gradient tuyến tính của 0 đến cách 0.5 M NaCl trong 10 mM amoni axetat (pH 5,0) tại một

Kết quả (Việt) 2:

Hóa chất Tất cả các hóa chất là các phân tích, trừ khi có quy định khác. 2,2'-Azino-bis (3 ethylbenzthiazoline-6sulfonate) (ABTS), syringaldazine, và acid vanillic được mua từ Sigma-Aldrich (Steinheim, Đức). Trừ khi có quy định khác trong các văn bản, tài liệu khác được mua từ Merck (Darmstadt, Đức).
Nấm căng thẳng và văn hóa điều kiện Sự cô lập của Myrioconium sp. căng Uhh 1-13-18-4 từ sông Saale (Trung Đức), nhận dạng của nó, và bảo trì của nó trước đây đã được mô tả (Junghanns et al. 2007). Myrioconium sp. Uhh 1-13-18-4 đại diện cho một chủng mitosporic kết nối với Helotiales, ascomycetes. Đối với sản xuất laccase, văn hoá lỏng của Myrioconium sp. trong Erlenmeyer bình (250 ml) có chứa 75 ml dung dịch 1% (w / v) chiết xuất từ malt trung bình (pH 5,6-5,8) được ủ ở 14 ° C và 120 rpm trong bóng tối. Để kích thích sản xuất laccase, 50 mM CuSO4 và 1 mM axit vanillic đã được thêm vào các nền văn hóa nấm 3 ngày sau khi cấy (Junghanns et al. 2005). Nền văn hóa đã được thu hoạch sau khi tổng thời gian trồng 16 ngày, và laccase được phân lập từ dịch nổi nuôi cấy tế bào-miễn phí.
Laccase cô lập và tinh chế Sợi nấm đã được gỡ bỏ từ nước nổi văn hóa bằng cách lọc (Whatman không. 4 giấy lọc, Dassel, Đức). Các nước nổi nuôi cấy tế bào tự do được tập trung bằng siêu lọc với màng lọc tiếp tuyến luồng (polysulfone minisette, 10 kDa cắt; Pall Filtron, East Hills, Mỹ). Sau đó, các retentate siêu lọc được rửa nhiều lần với 10 mM sodium acetate đệm (pH 5.5), và 20 mM phenylmethylsulfonylfluoride đã được bổ sung để ức chế protease. Để loại bỏ các tài liệu màu nâu sẫm từ retentate, (NH4) 2SO4 đã được bổ sung tại 30% độ bão hòa và việc chuẩn bị còn lại ở 4 ° C qua đêm. Kết tủa thu được loại bỏ bằng cách ly tâm ở 20.817 × g trong 30 phút. Các bề laccase có chứa đã được áp dụng cho một cột dùng một lần PD-10 khử muối (PD-10, Sephadex, 50 × 10 mm; Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Anh) và rửa giải với 10 mM đệm sodium acetate (pH 5.5). Phân số Laccase chứa được gộp chung và áp dụng cho một protein hệ thống sắc ký lỏng sinh học Nhân sự (Bio-Rad, Munich, Đức) được trang bị với một cột trao đổi anion MonoQ (50 × 5 mm; Amersham Biosciences). Laccase được tách rửa với một gradient tuyến tính từ 0 đến 0,5 M NaCl trong 10 mM amoni axetat (pH 5.0) tại một