Types, Causes, Detection and Repair

Types, Causes, Detection and Repair of DNA Fragmentation in Animal and Human Sperm Cells
Clara González-Marín, Jaime Gosálvez, and Rosa Roy

Additional article information

Abstract
Concentration, motility and morphology are parameters commonly used to determine the fertilization potential of an ejaculate. These parameters give a general view on the quality of sperm but do not provide information about one of the most important components of the reproductive outcome: DNA. Either single or double DNA strand breaks can set the difference between fertile and infertile males. Sperm DNA fragmentation can be caused by intrinsic factors like abortive apoptosis, deficiencies in recombination, protamine imbalances or oxidative stress. Damage can also occur due to extrinsic factors such as storage temperatures, extenders, handling conditions, time after ejaculation, infections and reaction to medicines or post-testicular oxidative stress, among others. Two singular characteristics differentiate sperm from somatic cells: Protamination and absence of DNA repair. DNA repair in sperm is terminated as transcription and translation stops post-spermiogenesis, so these cells have no mechanism to repair the damage occurred during their transit through the epididymis and post-ejaculation. Oocytes and early embryos have been shown to repair sperm DNA damage, so the effect of sperm DNA fragmentation depends on the combined effects of sperm chromatin damage and the capacity of the oocyte to repair it. In this contribution we review some of these issues.

Keywords: sperm, infertility, DNA fragmentation, DNA repair, oocyte
1. Introduction
Male infertility has traditionally been diagnosed by microscopic assessment of concentration, motility and morphology of sperm in the ejaculate. These tests are essential to provide the fundamental information on sperm quality. However, evidence based medicine shows that sperm DNA fragmentation (SDF) tests can also differentiate fertile from infertile males and that high levels of SDF are positively correlated with lower fertilization rates in IVF, impaired implantation rates and an increased incidence of abortion. Decades ago, Evenson et al.[1] suggested that the assessment of DNA integrity in sperm could be an independent marker of fertility. Clinical data followed, demonstrating higher levels of chromatin damage in men with severe sperm defects [2]. The negative impact of high levels of sperm DNA damage on both natural [3,4] and ART [5] have also been demonstrated. Subsequently, the assessment of DNA damage in the male germ line and the impact on reproductive outcome has received significant attention. In animals, where DNA damage can be experimentally induced in the paternal germ line, strong associations have been shown between damage to the paternal genome and embryo development including effects on the new born and subsequent generations [6,7]. These experiments are not feasible in humans, but provide clear warnings of the impact that some therapies like cancer treatments may exert on the sperm DNA.

Sperm chromatin differs from somatic cells in both constituents and arrangement. During spermiogenesis, protamines, which are half the size of histones, replace the majority of histones and the chromatin is wound into unique supercoiled structure named toroids [8]. As the sperm pass through the epididymis, the protamines are cross-linked by disulphide bonds reducing the chromatin to one-sixth the volume taken up in somatic cell nuclei. This dense compaction gives protection against exogenous assault to the sperm DNA [9]. Despite this protection, basal levels of sperm DNA damage are relatively high in infertile and even fertile men when compared with other species [10]. In addition to exhibiting higher basal levels of DNA damage, sperm from infertile males are more susceptible to damage over time after ejaculation [11].

Damaged DNA has been observed in testicular, epididymal and ejaculated sperm. Sperm DNA first becomes susceptible to damage if chromatin packing is not completed during spermatogenesis when protamine replacement is occurring in elongating spermatids. Temporary nicks, linked to the topoisomerases activity, facilitate histone-protamine replacement [12], but if these nicks are not fixed they will evolve into DNA fragmentation on mature sperm. Other internal causes of DNA fragmentation are abortive apoptosis, deficiencies in recombination or oxidative stress, among others. Damage can also occur due to extrinsic factors, the so called iatrogenic damage, and can be a result of storage temperatures, extenders used, handling conditions, lapse of time after ejaculation, infections, reaction to medicines, or post-testicular oxidative stress.

A number of tests are currently available to evaluate SDF. These include the Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA) [3,13], the TUNEL Assay, the In Situ Nick Translation (ISNT) [14], the DNA Breakage Detection-Fluorescence in Situ Hybridization (DBD-FISH) test [15], the Comet Assay [16], the Single-cell pulsed-field gel electrophoresis technique [17] and the Sperm Chromatin Dispersion Test (SCDt) [18,19]. All of these are valuable tools to gain information on the state of the desoxirribonucleic acid in the sperm, but the existing mechanisms of reparation existing in the oocyte, may provide a confusing view of the real impact of the DNA damage on pregnancy. This is probably one of the main reason supporting discrepancies existing among authors about the impact of SDF on pregnancy rates. Some authors report SDF to be an important predictor of male infertility, especially that associated with compromised syngamy and early embryonic loss [20–22], although in other cases, this relationship is still not clear [23–26].

DNA repair does occur in developing sperm but it is terminated as transcription and translation stops post-spermiogenesis. As a result, sperm have no mechanism to repair DNA damage that occurs during their transit and storage in the epididymis or post-ejaculation. However, that ocytes and early embryos have been shown to repair some types of sperm DNA breakage. Consequently, the biological effect of abnormal sperm chromatin structure depends on the combined effects of level and type of sperm chromatin damage and the capacity of the oocyte to repair it.

This review will focus on sperm DNA single and double strand breaks caused by intrinsic and extrinsic factors. Additionally, some attention will be given to DNA damage response (DDR) mechanisms in spermatids and in the oocyte after fertilization.

2. Detection of DNA Damage: Techniques
As mentioned in the introduction, various tests are currently available to evaluate sperm DNA damage. An important aspect to assess DNA Fragmentation is related to the type of damage affecting the DNA strands and the susceptibility of that DNA to get fragmented. Tests like SCSA, SCDt or the Comet Assay at alkaline or acidic pH, require a denaturalization step to detect the DNA fragments or the potential breaks in the DNA. However, TUNEL, ISNT or Comet Assay at neutral pH do not require denaturalization and they measure real DNA breakage, either on one or both strands of the DNA. The important questions about all these methods are whether they reveal the same type of damage, whether they obtain comparable results and last but not least, whether they are standardized. The different data in the literature for the levels of SDF in fertile and subfertile men, and the lack of agreement among the different studies evaluating the impact of SDF on ART outcomes, reflect how different methods may affect the results. A systemic meta-analysis of papers reporting the relationship between sperm DNA damage and ART outcomes published by Li et al. [27] shows how, when data are pooled according to the method (TUNEL and SCSA) employed in the study, completely different conclusions can be drawn.

Two of the most employed techniques to reveal SDF are TUNEL and SCSA. Although the two techniques show correlated results, they are not equivalent and reveal different types of damage [28]. In particular, the TUNEL assay quantifies the amount of cellular DNA breakage by incorporating fluorescent dNTPs at single- and double-stranded DNA ends in the presence of the enzyme terminal deoxynucleotidyl transferase while the SCSA method determines the extent of cellular DNA denaturation (induced by acids or heat treatment) by measuring the metachromatic shift of acridine orange from green (indicative of intercalation into double-stranded DNA) to red fluorescence (indicative of association with single-stranded DNA).

Previous studies indicate that DNA fragmentation measured by SCSA is not related to fertilization rates, embryo quality, and pregnancy rates in in vitro fertilization and intra cytoplasmic sperm injection, but could be related to spontaneous abortion rates [29–31]. On the other hand, Studies by Greco et al. [32], showed that the microinjection of sperm with DNA fragmentation over 15% analyzed with TUNEL, resulted in a pregnancy rate of 5.6% versus a 44.4% when DNA fragmentation was below 6%.

Other methods frequently used in clinical investigations are the COMET (a single-cell gel electrophoresis assay) and the SCDt, which are relatively simple methods for detecting DNA damage in individual cells. Both methods consist of several steps: cells are embedded in agarose; lysis is carried out; DNA is stained and sperm are analyzed under the microscope. The COMET assay includes an electrophoresis step to differentiate between intact DNA and single or double strand DNA damage. Both assays are rapid and sensitive, and allow the evaluation of DNA fragmentation on a few sperm. The disadvantages are the lack of standardized protocols and the need for software to conduct image analysis.

The In Situ Nick Translation (ISNT) is a modified form of TUNEL, which utilizes incorporation of biotinylated-dUTP at the ssDNA in a reaction catalyzed by templ

Kết quả (Việt) 1:

Loại, nguyên nhân, phát hiện và sửa chữa phân mảnh DNA trong các tế bào tinh trùng động vật và con ngườiClara González-Marín, Jaime Gosálvez, và Rosa RoyThông tin bổ sung bài viếtTóm tắtTập trung, motility và hình thái học là tham số thường được sử dụng để xác định tiềm năng thụ tinh của một xuất tinh. Các tham số này cho một cái nhìn tổng quát về chất lượng tinh trùng nhưng không cung cấp thông tin về một trong các thành phần quan trọng nhất của kết quả sinh sản: DNA. Hoặc là một hoặc hai phá vỡ sợi DNA có thể thiết lập sự khác biệt giữa nam giới màu mỡ và vô sinh. Tinh trùng DNA phân mảnh có thể được gây ra bởi intrinsic yếu tố như quá trình chết rụng trái cây không đậu, sự thiếu hụt trong gen, protamine sự mất cân bằng hoặc căng thẳng oxy hoá. Thiệt hại cũng có thể xảy ra do các yếu tố extrinsic như nhiệt độ lưu trữ, mở rộng, xử lý các điều kiện, thời gian sau khi xuất tinh, nhiễm trùng và phản ứng với thuốc hoặc căng thẳng oxy hóa tinh hoàn sau, trong số những người khác. Hai đặc điểm số ít phân biệt tinh trùng từ tế bào Soma: Protamination và sự vắng mặt của DNA sửa chữa. Sửa chữa DNA trong tinh trùng chấm dứt như phiên âm và dịch dừng sau spermiogenesis, do đó, các tế bào này đã không có cơ chế để sửa chữa những thiệt hại xảy ra trong thời gian quá cảnh của họ thông qua mào và xuất tinh sau. Oocytes và đầu phôi đã được hiển thị để sửa chữa thiệt hại DNA tinh trùng, do đó, tác động của tinh trùng DNA phân mảnh phụ thuộc vào những ảnh hưởng kết hợp của tinh trùng bị thiệt hại và khả năng của oocyte sửa chữa nó. Trong sự đóng góp này chúng tôi xem xét một số những vấn đề này.Từ khoá: tinh trùng, vô sinh, phân mảnh DNA, sửa chữa DNA, oocyte1. giới thiệuNam vô sinh theo truyền thống đã được chẩn đoán bởi vi đánh giá tập trung, motility và hình thái của tinh trùng trong xuất tinh. Những thử nghiệm này là rất cần thiết để cung cấp các thông tin cơ bản về chất lượng tinh trùng. Tuy nhiên, bằng chứng dựa trên y học cho thấy rằng tinh trùng DNA thử nghiệm phân mảnh (SDF) cũng có thể phân biệt màu mỡ từ Nam giới vô sinh và mức độ cao của SDF đang tích cực tương quan với giảm tốc độ thụ tinh trong thụ tinh ống nghiệm, tỷ lệ suy cấy và một tỷ lệ tăng của phá thai. Thập kỷ trước, Evenson et al. [1] đề xuất rằng đánh giá toàn vẹn DNA trong tinh trùng có thể là một điểm đánh dấu độc lập của khả năng sinh sản. Dữ liệu lâm sàng sau đó chứng tỏ các cấp độ cao hơn của bị thiệt hại trong một người đàn ông với tinh trùng nghiêm trọng lỗi [2]. Tác động tiêu cực của các mức độ cao của tinh trùng DNA thiệt hại trên cả hai tự nhiên [3,4] và nghệ thuật [5] cũng đã được chứng minh. Sau đó, đánh giá thiệt hại DNA trong dòng tỷ mầm và tác động trên các kết quả sinh sản đã nhận được sự chú ý đáng kể. Ở động vật, nơi thiệt hại DNA có thể được gây ra thử nghiệm trong dòng nội mầm, Hiệp hội mạnh mẽ có được hiển thị giữa thiệt hại cho nội bộ gen và phôi thai phát triển bao gồm cả các hiệu ứng trên các thế hệ mới sinh ra và sau đó [6,7]. Các thí nghiệm không phải là khả thi trong con người, nhưng cung cấp các cảnh báo rõ ràng của tác động mà một số phương pháp điều trị như điều trị ung thư có thể phát huy trên tinh trùng DNA.Tinh trùng bị khác với tế bào Soma trong cả hai thành phần và sắp xếp. Trong spermiogenesis, protamines, mà là một nửa kích thước của histones, thay thế phần lớn của histones và bị vết thương vào cấu trúc supercoiled độc đáo, đặt tên là toroids [8]. Khi tinh trùng đi qua mào, các protamines được cross-linked bởi disulphide trái phiếu giảm bị một thứ sáu tập đưa lên trong nhân tế bào Soma. Này ép dày đặc cho bảo vệ chống lại cuộc tấn công ngoại sinh tinh trùng DNA [9]. Mặc dù bảo vệ này, các cấp độ cơ bản của tinh trùng DNA thiệt hại là tương đối cao ở nam giới vô sinh và thậm chí màu mỡ khi so sánh với các loài khác [10]. Ngoài việc trưng bày cao cấp cơ sở của thiệt hại DNA, tinh trùng từ vô sinh nam giới đang dễ bị thiệt hại theo thời gian sau khi xuất tinh [11].Bị hư hại DNA đã được quan sát trong tinh hoàn, epididymal và ejaculated tinh trùng. Tinh trùng DNA lần đầu tiên trở nên dễ bị thiệt hại nếu bị đóng gói không được hoàn thành trong spermatogenesis khi protamine thay thế là xảy ra ở elongating spermatids. Nick tạm thời, liên kết với các hoạt động topoisomerases, tạo điều kiện thay thế histone-protamine [12], nhưng nếu những Nick không cố định họ sẽ phát triển thành phân mảnh DNA trên tinh trùng trưởng thành. Các nguyên nhân nội bộ phân mảnh DNA là quá trình chết rụng trái cây không đậu, sự thiếu hụt trong gen hoặc căng thẳng oxy hoá, trong số những người khác. Thiệt hại cũng có thể xảy ra do các yếu tố extrinsic, những thiệt hại như vậy gọi là iatrogenic, và có thể một kết quả của nhiệt độ lưu trữ, mở rộng được sử dụng, xử lý điều kiện, mất hiệu lực thời gian sau khi xuất tinh, nhiễm trùng, các phản ứng để thuốc, hoặc căng thẳng oxy hoá hậu tinh hoàn.Một số xét nghiệm là hiện đang có sẵn để đánh giá SDF. Trong đó có tinh trùng bị cấu trúc khảo nghiệm (SCSA) [3,13], khảo nghiệm TUNEL, các trong Situ Nick dịch (ISNT) [14], DNA vỡ phát hiện-huỳnh quang trong Situ lai ghép (DBD-cá) thử nghiệm [15], khảo nghiệm sao chổi [16], kỹ thuật điện trường pulsed gel đơn bào [17] và các tinh trùng bị phân tán thử nghiệm (SCDt) [18,19]. Tất cả các công cụ có giá trị để đạt được các thông tin về tình trạng của axit desoxirribonucleic trong tinh trùng, nhưng các cơ chế hiện có của nhiệm sẵn có trong oocyte, có thể cung cấp một cái nhìn khó hiểu của tác động thực sự thiệt hại DNA ngày mang thai. Điều này có lẽ là một trong những lý do chính hỗ trợ sẵn có trong số các tác giả về tác động của SDF trên tỷ lệ mang thai khác biệt. Một số báo cáo tác giả SDF là một dự báo quan trọng của Nam vô sinh, đặc biệt là liên quan đến thỏa hiệp syngamy và rụng sớm phôi [20-22], mặc dù trong trường hợp khác, mối quan hệ này là vẫn không rõ ràng [23-26].Sửa chữa DNA xảy ra trong việc phát triển tinh trùng nhưng nó chấm dứt như phiên âm và dịch dừng sau spermiogenesis. Kết quả là, tinh trùng đã không có cơ chế để sửa chữa thiệt hại DNA xảy ra trong quá trình vận chuyển và lưu trữ trong mào hoặc xuất tinh sau của họ. Tuy nhiên, ocytes và đầu phôi đã được hiển thị để sửa chữa một số loại tinh trùng DNA vỡ. Do đó, tác dụng sinh học của tinh trùng bất thường bị cấu trúc phụ thuộc vào những ảnh hưởng kết hợp của các cấp và tinh trùng bị hỏng cái kiểu và năng lực của oocyte để sửa chữa nó.Đánh giá này sẽ tập trung vào tinh trùng DNA đơn và đôi strand phá vỡ gây ra bởi các yếu tố nội tại và bên ngoài. Ngoài ra, một số sự chú ý sẽ được trao cho DNA thiệt hại cơ chế phản ứng (DDR) trong spermatids và trong oocyte sau khi thụ tinh.2. phát hiện thiệt hại DNA: kỹ thuậtNhư đã đề cập trong phần giới thiệu, các xét nghiệm hiện đang có sẵn để đánh giá tinh trùng DNA thiệt hại. Một khía cạnh quan trọng để đánh giá sự phân mảnh DNA liên quan đến loại thiệt hại ảnh hưởng đến các sợi DNA và tính nhạy cảm của rằng ADN để có được phân mảnh. Các xét nghiệm như SCSA, SCDt hoặc khảo nghiệm sao chổi ở pH kiềm hoặc axit, yêu cầu một bước denaturalization để phát hiện các DNA mảnh hoặc tiềm năng phá vỡ trong DNA. Tuy nhiên, TUNEL, ISNT hoặc sao chổi khảo nghiệm ở pH trung tính không yêu cầu denaturalization và họ đo thực DNA vỡ, hoặc trên một hoặc cả hai sợi DNA. Các câu hỏi quan trọng về tất cả những phương pháp này là cho dù họ tiết lộ cùng loại thiệt hại, cho dù họ được so sánh kết quả và cuối cùng nhưng không kém, cho dù họ được tiêu chuẩn hóa. Các dữ liệu khác nhau trong các tài liệu cho các đơn vị SDF ở nam giới màu mỡ và subfertile, và thiếu sự thỏa thuận giữa các nghiên cứu khác nhau đánh giá tác động của SDF trên kết quả nghệ thuật, phản ánh các phương pháp khác nhau như thế nào có thể ảnh hưởng đến kết quả. Hệ thống meta-phân tích về giấy tờ báo cáo mối quan hệ giữa tinh trùng DNA thiệt hại và nghệ thuật kết quả được xuất bản bởi Li et al. [27] cho thấy như thế nào, khi dữ liệu được gộp lại theo các phương pháp (TUNEL và SCSA) được sử dụng trong nghiên cứu, kết luận hoàn toàn khác nhau có thể được rút ra.Two of the most employed techniques to reveal SDF are TUNEL and SCSA. Although the two techniques show correlated results, they are not equivalent and reveal different types of damage [28]. In particular, the TUNEL assay quantifies the amount of cellular DNA breakage by incorporating fluorescent dNTPs at single- and double-stranded DNA ends in the presence of the enzyme terminal deoxynucleotidyl transferase while the SCSA method determines the extent of cellular DNA denaturation (induced by acids or heat treatment) by measuring the metachromatic shift of acridine orange from green (indicative of intercalation into double-stranded DNA) to red fluorescence (indicative of association with single-stranded DNA).Previous studies indicate that DNA fragmentation measured by SCSA is not related to fertilization rates, embryo quality, and pregnancy rates in in vitro fertilization and intra cytoplasmic sperm injection, but could be related to spontaneous abortion rates [29–31]. On the other hand, Studies by Greco et al. [32], showed that the microinjection of sperm with DNA fragmentation over 15% analyzed with TUNEL, resulted in a pregnancy rate of 5.6% versus a 44.4% when DNA fragmentation was below 6%.Các phương pháp khác thường xuyên được sử dụng trong điều tra lâm sàng là sao chổi (một khảo nghiệm điện đơn bào gel) và SCDt, các phương pháp tương đối đơn giản để phát hiện thiệt hại DNA trong các tế bào cá nhân. Cả hai phương pháp bao gồm một vài bước: tế bào được nhúng trong agarose; lysis được thực hiện; DNA màu và tinh trùng được phân tích dưới kính hiển vi. Sao chổi khảo nghiệm bao gồm một bước điện để phân biệt giữa DNA còn nguyên vẹn và một hoặc hai sợi DNA thiệt hại. Thử nghiệm cả hai được nhanh chóng và nhạy cảm, và cho phép việc thẩm định phân mảnh DNA trên một vài tinh trùng. Những khó khăn đang thiếu tiêu chuẩn giao thức và sự cần thiết cho phần mềm để tiến hành phân tích hình ảnh.Các trong Situ Nick dịch (ISNT) là một hình thức lần TUNEL, sử dụng kết hợp biotinylated-dUTP tại ssDNA trong một phản ứng xúc tác bởi templ

Kết quả (Việt) 2:

Loại, Nguyên nhân, phát hiện và sửa chữa các ADN phân mảnh trong động vật và tế bào tinh trùng nhân
Clara González-Marín, Jaime Gosálvez, và Rosa Roy Thêm thông tin bài viết Tóm tắt tập trung, khả năng vận động và hình thái được các thông số thường được sử dụng để xác định khả năng thụ tinh của một lần xuất tinh. Những thông số cung cấp cho một cái nhìn tổng thể về chất lượng của tinh trùng nhưng không cung cấp thông tin về một trong những thành phần quan trọng nhất của các kết quả sinh sản: DNA. Hoặc là phá vỡ sợi DNA đơn hoặc kép có thể thiết lập sự khác biệt giữa nam giới và phì nhiêu màu mỡ. Tinh trùng DNA phân mảnh có thể được gây ra bởi các yếu tố nội tại như apoptosis bại, thiếu sót trong sự tái tổ hợp, sự mất cân bằng protamine hoặc stress oxy hóa. Thiệt hại cũng có thể xảy ra do các yếu tố bên ngoài như nhiệt độ lưu trữ, mở rộng, điều kiện xử lý, thời gian sau khi xuất tinh, nhiễm trùng và phản ứng với thuốc hoặc căng thẳng oxy hóa sau tinh hoàn, trong số những người khác. Hai đặc điểm phân biệt số ít tinh trùng từ tế bào soma: Protamination và sự vắng mặt của DNA. Sửa chữa DNA trong tinh trùng bị chấm dứt như phiên mã và dịch dừng lại sau spermiogenesis, do đó, những tế bào không có cơ chế để sửa chữa những thiệt hại xảy ra trong thời gian quá cảnh qua mào tinh hoàn và hậu xuất tinh. Tế bào trứng và phôi sớm đã được chứng minh để sửa chữa thiệt hại DNA của tinh trùng, vì vậy hiệu quả của sự phân mảnh DNA của tinh trùng phụ thuộc vào ảnh hưởng kết hợp của tinh trùng nhiễm sắc thiệt hại và khả năng của tế bào trứng để sửa chữa nó. Trong đóng góp này chúng tôi xem xét một số vấn đề. Từ khóa: tinh trùng, vô sinh, phân mảnh DNA, sửa chữa DNA, noãn bào 1. Giới thiệu Nam có truyền thống vô sinh được chẩn đoán bằng cách đánh giá bằng kính hiển vi tập trung, khả năng vận động và hình thái của tinh trùng trong tinh dịch. Những xét nghiệm này là rất cần thiết để cung cấp các thông tin cơ bản về chất lượng tinh trùng. Tuy nhiên, y học chứng cứ cho thấy sự phân mảnh DNA của tinh trùng (SDF) các xét nghiệm cũng có thể phân biệt được màu mỡ từ nam giới vô sinh và mức độ cao của SDF có tương quan dương với mức giá thấp hơn thụ tinh trong thụ tinh ống nghiệm, tỷ lệ cấy bị suy yếu và tăng tỷ lệ phá thai. Nhiều thập kỷ trước, Evenson et al. [1] cho rằng việc đánh giá tính toàn vẹn DNA trong tinh trùng có thể là một dấu hiệu độc lập với khả năng sinh sản. Dữ liệu lâm sàng theo sau, cho thấy mức độ cao hơn của tổn thương nhiễm sắc thể ở những người bị khuyết tật nặng tinh trùng [2]. Các tác động tiêu cực của các cấp cao của tinh trùng thiệt hại DNA trên cả tự nhiên [3,4] và ART [5] cũng đã được chứng minh. Sau đó, việc đánh giá thiệt hại DNA trong tinh trùng của nam giới và tác động đến kết quả sinh sản đã nhận được sự chú ý đáng kể. Ở động vật, nơi thiệt hại DNA có thể được thử nghiệm cảm ứng trong các dòng vi khuẩn nội, kết hợp chặt chẽ đã được trình bày giữa thiệt hại với hệ gen của bố mẹ và sự phát triển phôi thai bao gồm cả các hiệu ứng trên sinh ra và tiếp theo thế hệ mới [6,7]. Những thí nghiệm này là không khả thi trong con người, mà còn cung cấp những cảnh báo rõ ràng về tác động mà một số phương pháp điều trị như điều trị ung thư có thể gây trên DNA của tinh trùng. Tinh trùng nhiễm sắc khác với tế bào soma trong cả hai thành phần và sắp xếp. Trong spermiogenesis, protamines, đó là một nửa kích thước của histones, thay thế phần lớn các histone và các nhiễm sắc được quấn vào cấu trúc độc đáo supercoiled tên toroids [8]. Khi vượt qua tinh trùng qua mào tinh hoàn, các protamines được liên kết ngang bằng trái phiếu disulphite giảm nhiễm sắc tới một phần sáu lượng đưa lên trong nhân tế bào soma. Nén chặt dày đặc này giúp bảo vệ chống tấn công từ bên ngoài vào các ADN tinh trùng [9]. Mặc dù bảo vệ này, mức độ cơ bản của tinh trùng thiệt hại DNA tương đối cao ở nam giới vô sinh và thậm chí cả màu mỡ khi so sánh với các loài khác [10]. Ngoài đó mức độ cơ bản cao hơn thiệt hại DNA, tinh trùng của nam giới vô sinh dễ bị tổn thương theo thời gian sau khi xuất tinh [11]. DNA bị hư hại đã được quan sát thấy trong tinh hoàn, mào tinh và xuất tinh tinh trùng. DNA tinh trùng đầu tiên trở thành dễ bị tổn hại nếu nhiễm sắc bao bì không được hoàn thành trong tinh dịch khi thay thế protamine đang xảy ra tại elongating spermatids. Nick tạm thời, liên kết với các hoạt động topoisomerases, tạo điều kiện cho histone-protamine thay thế [12], nhưng nếu những nick không cố định họ sẽ phát triển thành các mảnh DNA vào tinh trùng trưởng thành. Nguyên nhân bên trong khác của sự phân mảnh DNA là apoptosis bại, thiếu sót trong tái tổ hợp hoặc oxy hóa stress, trong số những người khác. Thiệt hại cũng có thể xảy ra do các yếu tố bên ngoài, như vậy gọi là thiệt hại do điều trị, và có thể là một kết quả của nhiệt độ lưu trữ, bộ mở rộng sử dụng, xử lý, quá thời gian sau khi xuất tinh, nhiễm trùng, phản ứng với thuốc, hoặc căng thẳng oxy hóa sau tinh hoàn. Một số xét nghiệm hiện có sẵn để đánh giá SDF. Chúng bao gồm các cấu trúc tinh trùng nhiễm sắc Assay (SCSA) [3,13], các tunel Assay, In Situ Nick Translation (isnt) [14], các DNA Lân Detection-Fluorescence trong Situ Hybridization (DBD-FISH) thử nghiệm [15] , các Comet Assay [16], các đơn bào xung-field gel electrophoresis kỹ thuật [17] và các tinh trùng nhiễm sắc Dispersion Test (SCDt) [18,19]. Tất cả những công cụ có giá trị để có được thông tin về tình trạng của các axit desoxirribonucleic trong tinh trùng, nhưng các cơ chế hiện có đền bù hiện trong các tế bào trứng, có thể cung cấp một cái nhìn khó hiểu về tác động thực sự của các thiệt hại DNA vào thời kỳ mang thai. Đây có lẽ là một trong những lý do chính hỗ trợ hiện có sự khác biệt giữa các tác giả về tác động của SDF về tỉ lệ có thai. Một số tác giả báo cáo SDF là một yếu tố dự báo quan trọng của vô sinh nam, là liên kết các syngamy bị xâm nhập và đầu mất phôi [20-22], mặc dù trong trường hợp khác, mối quan hệ này vẫn còn chưa rõ ràng [23-26]. sửa chữa DNA không xảy ra trong việc phát triển tinh trùng nhưng nó chấm dứt như phiên mã và dịch dừng lại sau spermiogenesis. Kết quả là, tinh trùng không có cơ chế để sửa chữa hư hỏng DNA xảy ra trong khi vận chuyển và lưu trữ của họ trong mào tinh hoàn hoặc bài xuất tinh. Tuy nhiên, đó Ocytes và phôi sớm đã được hiển thị để sửa chữa một số loại gãy DNA của tinh trùng. Do đó, tác dụng sinh học của cấu trúc nhiễm sắc thể bất thường tinh trùng phụ thuộc vào các tác động tổng hợp của mức độ và loại tổn thương nhiễm sắc thể của tinh trùng và khả năng của tế bào trứng để sửa chữa nó. Đánh giá này sẽ tập trung vào DNA của tinh trùng phá vỡ sợi đơn và đôi do nội sinh và ngoại yếu tố. Ngoài ra, một số sự chú ý sẽ được trao cho phản ứng hư hại DNA (DDR) cơ chế trong spermatids và trong các tế bào trứng sau khi thụ tinh. 2. Phát hiện DNA Damage: Kỹ thuật Như đã đề cập trong phần giới thiệu, kiểm tra khác nhau hiện đang có sẵn để đánh giá thiệt hại DNA của tinh trùng. Một khía cạnh quan trọng để đánh giá DNA phân mảnh được liên quan đến các loại thiệt hại ảnh hưởng đến các sợi DNA và sự nhạy cảm của DNA rằng để có được phân mảnh. Các xét nghiệm như SCSA, SCDt hoặc Assay Comet tại kiềm hoặc độ pH axit, đòi hỏi một bước denaturalization để phát hiện các mảnh vỡ DNA hoặc vỡ tiềm năng trong DNA. Tuy nhiên, Tunel, đúng hay Comet Assay ở pH trung tính không yêu cầu denaturalization và họ đánh vỡ DNA thực, hoặc tại một hoặc cả hai sợi của DNA. Các câu hỏi quan trọng về tất cả những phương pháp này cho dù họ tiết lộ cùng một loại tổn thương, cho dù họ có được kết quả so sánh và cuối cùng nhưng không kém, cho dù họ được chuẩn hóa. Các dữ liệu khác nhau trong văn học với trình độ của SDF ở nam giới phì nhiêu và subfertile, và sự đồng thuận trong các nghiên cứu khác nhau đánh giá các tác động của SDF trên kết quả ART, phản ánh như thế nào phương pháp khác nhau có thể ảnh hưởng đến kết quả. Một phân tích hệ thống của các giấy tờ báo cáo các mối quan hệ giữa thiệt hại và ART kết quả DNA tinh trùng được xuất bản bởi Li et al. [27] cho thấy như thế nào, khi dữ liệu được gộp lại theo phương pháp (Tunel và SCSA) được sử dụng trong nghiên cứu, kết luận hoàn toàn khác nhau có thể được rút ra. Hai trong số các kỹ thuật có việc làm nhất để lộ SDF là Tunel và SCSA. Mặc dù hai kỹ thuật cho thấy kết quả tương quan, chúng không tương đương và tiết lộ các loại khác nhau của các thiệt hại [28]. Đặc biệt, các xét nghiệm định lượng Tunel lượng vỡ DNA của tế bào bằng cách kết hợp dNTP huỳnh quang tại DNA đơn và kép kết thúc trong sự hiện diện của các thiết bị đầu cuối enzyme deoxynucleotidyl transferase trong khi phương pháp SCSA xác định mức độ biến tính DNA của tế bào (gây ra bởi axit hoặc xử lý nhiệt) bằng cách đo sự thay đổi của metachromatic acridine orange từ màu xanh lá cây (chỉ định của xen vào DNA sợi kép) để phát huỳnh quang màu đỏ (chỉ định của hiệp hội với DNA sợi đơn). Các nghiên cứu trước cho thấy sự phân mảnh DNA được đo bằng SCSA là không có liên quan đến tỷ lệ thụ tinh, chất lượng phôi và tỉ lệ có thai trong thụ tinh ống nghiệm và trong nội tế bào chất tiêm tinh trùng, nhưng có thể liên quan đến tỷ lệ sẩy thai tự nhiên [29-31]. Mặt khác, nghiên cứu của Greco et al. [32], cho thấy rằng các vi tiêm tinh trùng với phân mảnh DNA trên 15% được phân tích với Tunel, dẫn đến một tỷ lệ có thai là 5,6% so với 44,4% một khi phân mảnh DNA là dưới 6%. Các phương pháp khác thường được sử dụng trong điều tra lâm sàng là COMET (một đơn bào gel electrophoresis assay) và SCDt, đó là phương pháp tương đối đơn giản để phát hiện thiệt hại DNA trong các tế bào. Cả hai phương pháp bao gồm một số bước sau: tế bào này được nhúng trong agarose; ly giải được thực hiện; DNA được nhuộm màu và tinh trùng được phân tích dưới kính hiển vi. Xét nghiệm COMET bao gồm một bước điện di để phân biệt giữa DNA nguyên vẹn và thiệt hại DNA sợi đơn hoặc kép. Cả hai xét nghiệm là nhanh chóng và nhạy cảm, và cho phép đánh giá các phân mảnh DNA trên một vài tinh trùng. Những nhược điểm là thiếu các quy trình tiêu chuẩn hóa và sự cần thiết của phần mềm để tiến hành phân tích hình ảnh. The In Situ Nick Translation (isnt) là một hình thức sửa đổi của Tunel, trong đó sử dụng kết hợp các biotinylated-dUTP tại ssDNA trong một phản ứng được xúc tác bởi templ