2003 Argentina Screenhouse Trials.

2003 Argentina Screenhouse Trials. Homozygous R5 plants of all three Bt lines were evaluated in screen- house trials at Fontezuela and Oliveros. Negative iso- lines and the parental ÔA5547Õ were included in each trial as negative checks. Essentially, the same methods and experimental design were used as in the 2002
Argentina trials except as noted here. Trials were planted 10 Ð21 January 2003 at a rate of 30 seeds per meter row, with no culling of negative plants required. Screenhouses were infested with R. nu at both loca- tions (50 Ð 60 Þrst to second instars per row) at V5 to V6 stage of growth (25Ð 41 dap) and at Oliveros (350
Þrst to second instars per row) at R5 stage of growth (70 dap). Larvae were reared from eggs obtained from adults collected at light traps at Oliveros and main- tained in oviposition cages in the laboratory. An ad- ditional screenhouse at Oliveros was infested with S. virginica (8 Ð 40 Þrst to second instars per row) three times during V6 ÐR4 stage of growth (31Ð56 dap) and at R3 stage of growth (41 dap) with 40 adults. Larvae and adults were obtained from S. virginica larvae col- lected on sunßower and reared to adulthood at Yana´ - suy (Venado Tuerto, Santa Fe Province, Argentina). The second screenhouse at Fontezuela could not be infested due to a shortage of S. virginica livestock.



Damage was assessed as described previously at R3 to R6 stage of growth (52Ð 87 dap) in the R. nu screen- houses and R6 stage of growth (101 dap) in the S. virginica screenhouse. Damage data were analyzed as described previously.
High-Dose Bioassays. Lines 19459-55 and 19487-35 were evaluated for high dose expression of TIC107 against A. gemmatalis and P. includens by using dilution bioassays of lyophilized leaf tissues incorporated into artiÞcial diet. These two pests were selected because of their differing sensitivity to Bt and their occurrence in the United States where the study was conducted. Insect eggs were obtained from laboratory colonies at Monsanto, Union City, TN (A. gemmatalis) and Uni- versity of Georgia, Tifton (P. includens), and incu- bated in 2.8-liter polypropylene boxes (Rubbermaid, Wooster, OH) lined with lightly moistened tissue and incubated in an environmental chamber (#I-35VL, Percival, Boone, IA) at 27 ± 1°C, 60 ± 10% RH, and a photoperiod of 0:24 (L:D) h until hatch. Leaf tissue samples collected for protein expression analysis as described above were used in this study. After taking a portion of the samples for ELISA, the remaining tissues were transferred to 50-ml plastic centrifuge tubes, weighed, and lyophilized overnight in a freeze dryer (VirTis, Gardiner, NY). Lyophilized samples were thawed and reweighed to establish fresh:dry weight correlations and pulverized by placing Þve to six 5/8-inch steel balls in each tube and shaking on a Harbil 5G-HD mixer for 3Ð 6 min. Pulverized samples were stored at 4°C until used for bioassay.
Three bioassays were conducted against each spe- cies, with each including one replicate of each Bt line and one isoline at each plant growth stage from each location. Samples were warmed to room temperature and weighed into 50-ml plastic centrifuge tubes, using the fresh:dry weight correlation of each sample to calculate an amount that, when incorporated into ar- tiÞcial insect diet, would result in a 25-fold dilution relative to fresh tissue. Multiple species lepidopteran diet with mold inhibitor (Southland Products Inc., Lake Village, AR), modiÞed by replacing the agar with analytical grade agar (#11393, Serva, Heidelberg, Ger- many) at a rate of 11.2 g/liter of diet, was prepared and cooled to 260°C in a water bath. Samples were in- corporated by adding diet to a Þnal volume of 17.5 ml each and agitating on a Vortex-Genie mixer (ScientiÞc Industries, Bohemia, NY) at the highest setting until the diet was a uniform color, and no traces of sample were visible on the tube wall. Sample-laced diet was dispensed (0.5 ml/well) under a biological hood into
128-well bioassay trays (#BIO-BA-128, CD Interna- tional Inc., Pitman, NJ) by using an Eppendorf Re- peater 4780 (Brinkmann Instruments, Westbury, NY) and allowed to solidify. Treatments contained 28 Ð32 wells, and two untreated controls (UTC) consisting of diet only (32 or 64 wells each) were included in each bioassay, one dispensed before sample incorporation and another afterward. A single A. gemmatalis or P. includens larva, 0 Ð24 h posthatch, was transferred to each well with a Þne camelÕs-hair brush. Trays were sealed with preventilated, self-adhesive covers (#BIO-CV-16, CD International Inc.) and incubated in an #I-35VL environmental chamber at 27 ± 1°C,
60 ± 10% RH, and a photoperiod of 0:24 (L:D) h. Bioassays were scored by recording the number of dead larvae and instar of survivors in each treatment after 11 d and correcting for untreated diet controls (Abbott 1925).

Kết quả (Việt) 1:

2003 Argentina Screenhouse thử nghiệm. Màu R5 cây của tất cả các dòng Bt ba đã được đánh giá trong các màn hình-nhà thử nghiệm tại Fontezuela và Oliveros. Iso-dòng tiêu cực và ÔA5547Õ của cha mẹ đã được bao gồm trong mỗi phiên tòa như kiểm tra tiêu cực. Về cơ bản, các phương pháp tương tự và thiết kế thử nghiệm đã được sử dụng như trong năm 2002Thử nghiệm Argentina ngoại trừ như lưu ý ở đây. Thử nghiệm đã được trồng 10 Ð21 tháng 1 năm 2003 tốc độ 30 hạt trên mỗi hàng mét, với không tiêu huỷ vật tiêu cực cần thiết. Screenhouses đã bị nhiễm khuẩn với R. nu lúc cả hai loca-tions (50 Ð 60 Þrst để instars thứ hai cho hàng) tại V5 V6 giai đoạn tăng trưởng (25Ð 41 dap) và tại Oliveros (350Þrst để instars thứ hai cho hàng) ở R5 giai đoạn tăng trưởng (70 dap). Ấu trùng được nuôi dưỡng từ trứng thu được từ người lớn được thu thập tại bẫy ánh sáng tại Oliveros và main-tained trong oviposition lồng trong phòng thí nghiệm. Một quảng cáo-ditional screenhouse tại Oliveros bị nhiễm khuẩn với S. virginica (8 Ð 40 Þrst để instars thứ hai cho hàng) ba lần trong V6 ÐR4 giai đoạn tăng trưởng (31Ð56 dap) và ở R3 giai đoạn tăng trưởng (41 dap) với 40 người lớn. Ấu trùng và người lớn đã được thu được từ S. virginica ấu trùng col-lected trên sunßower và nuôi đến tuổi trưởng thành tại Yana´ - suy (Venado Tuerto, Santa Fe tỉnh, Argentina). Screenhouse thứ hai tại Fontezuela có thể không được bị nhiễm khuẩn do sự thiếu hụt S. virginica gia súc. Thiệt hại được đánh giá như mô tả trước đó tại R3 R6 giai đoạn tăng trưởng (52Ð 87 dap) ở R. nu màn hình nhà và R6 giai đoạn tăng trưởng (101 dap) trong S. virginica screenhouse. Thiệt hại dữ liệu được phân tích như mô tả trước đó.Liều cao Bioassays. Dòng 19459-55 và 19487-35 bị đánh giá cho biểu hiện liều cao của TIC107 chống lại A. gemmatalis và P. includens bằng cách sử dụng bioassays pha loãng sản lá mô tích hợp vào chế độ ăn uống artiÞcial. Các loài gây hại hai đã được lựa chọn bởi vì của nhạy cảm khác nhau với Bt và sự xuất hiện của họ tại Hoa Kỳ mà nghiên cứu được tiến hành. Côn trùng trứng được thu được từ phòng thí nghiệm thuộc địa tại Monsanto, Union City, TN (A. gemmatalis) và Uni-versity của Georgia, Tifton (P. includens), và incu - bated trong 2.8-lít polypropylene hộp (Rubbermaid, Wooster, OH) lót bằng chất nhẹ mô và ủ trong một môi trường phòng (#I-35VL, Percival, Boone, IA) tại 27 ± 1° C, 60 ± 10% RH, và một photoperiod 0:24 (L:D) h cho đến khi nở. Mẫu mô lá thu thập để phân tích biểu hiện protein như mô tả ở trên được sử dụng trong nghiên cứu này. Sau khi tham gia một phần của các mẫu cho ELISA, mô còn lại được chuyển cho 50 ml nhựa máy ly tâm ống, cân nặng, và sản qua đêm trong một đóng băng máy sấy (VirTis, Gardiner, NY). Sản mẫu được xả đá và reweighed để thiết lập mối tương quan trọng lượng tươi: Giặt và nghiền bằng cách đặt Þve đến sáu 5/8 inch thép bóng trong mỗi ống và lắc trên một máy trộn Harbil 5G-HD cho 3Ð 6 phút Pulverized mẫu đã được lưu giữ tại 4° C cho đến khi được sử dụng cho bioassay.Ba bioassays đã tiến hành chống lại mỗi spe-cies, với mỗi bao gồm một replicate mỗi dòng Bt và một isoline ở từng giai đoạn tăng trưởng thực vật từ mỗi địa điểm. Mẫu đã được nóng lên đến nhiệt độ phòng và cân nặng vào máy ly tâm nhựa 50-ml ống, bằng cách sử dụng các mối tương quan trọng lượng tươi: Giặt của mỗi mẫu để tính toán một số tiền đó, khi đưa vào chế độ ăn uống côn trùng ar-tiÞcial, sẽ cho kết quả trong một pha loãng 25-fold liên quan đến mô lành. Nhiều loài Lepidoptera chế độ ăn với chất ức chế khuôn (Southland sản phẩm Inc, Lake Village, AR), modiÞed bằng cách thay thế agar với phân tích lớp agar (#11393, Serva, Heidelberg, Đức-nhiều) tại một tỷ lệ 11.2 g/lít của chế độ ăn uống, được chuẩn bị và làm mát bằng nước đến 260° C trong một bồn tắm nước. Mẫu là trong corporated bằng cách thêm chế độ ăn uống cho một khối lượng Þnal của 17,5 ml mỗi và agitating trên một máy trộn Vortex-Genie (ScientiÞc ngành công nghiệp, Bohemia, NY) tại các thiết lập cao nhất cho đến khi chế độ ăn uống là một màu sắc đồng nhất, và không có dấu vết của mẫu được hiển thị trên tường ống. Mẫu-tẩm chế độ ăn uống là dispensed (cách 0.5 ml/tốt) theo một mui xe sinh học vào128-cũng bioassay khay (#BIO-BA-128, CD Interna-tế Inc, Pitman, NJ) bằng cách sử dụng một Eppendorf Re peater 4780 (Brinkmann cụ, Westbury, NY) và được cho phép để củng cố. Phương pháp điều trị có 28 Ð32 wells, và hai không được điều trị điều khiển (UTC) bao gồm chế độ ăn uống chỉ (32 hoặc 64 wells mỗi) đã được bao gồm trong mỗi bioassay, một phân phát trước khi thành lập mẫu và khác sau đó. Một đơn A. gemmatalis hoặc ấu trùng P. includens, 0 Ð24 h posthatch, được chuyển cho mỗi tốt với một bàn chải tóc-camelÕs Þne. Khay được niêm phong với bao gồm preventilated, tự dính (#BIO-CV-16, CD International Inc) và ủ trong một buồng môi trường #I-35VL tại 27 ± 1° C,60 ± 10% RH, và một photoperiod 0:24 (L:D) h. Bioassays được ghi bởi ghi số chết ấu trùng và instar người sống sót ở mỗi lần điều trị sau khi 11 d và sửa chữa cho điều khiển chế độ ăn uống không được điều trị (Abbott 1925).

Kết quả (Việt) 2:

2003 Argentina Screenhouse thử nghiệm. Cây R5 đồng hợp tử của cả ba dòng Bt đã được đánh giá trong các thử nghiệm sàng lọc tại nhà Fontezuela và Oliveros. Dòng li tiêu cực và ÔA5547Õ cha mẹ đã được bao gồm trong mỗi thử nghiệm như kiểm tra tiêu cực. Về cơ bản, các phương pháp và thiết kế thí nghiệm được sử dụng như trong năm 2002
Argentina thử nghiệm ngoại trừ như đã nói ở đây. Các thử nghiệm được trồng 10 tháng 1 năm 2003 D21 với tốc độ 30 hạt giống cho mỗi hàng mét, không có loại thải của các nhà máy tiêu cực cần thiết. Screenhouses đã bị nhiễm khuẩn với R. nu ở cả hai phương loca- (50 Ð 60 Þrst để instars thứ hai mỗi dòng) ở V5 đến giai đoạn V6 tăng trưởng (25D 41 dap) và tại Oliveros (350
Þrst để instars thứ hai mỗi dòng) ở giai đoạn R5 tăng trưởng (70 dap). Ấu trùng được nuôi từ trứng thu được từ những người lớn thu thập tại bẫy đèn tại Oliveros và duy trì trong lồng oviposition trong phòng thí nghiệm. Một screenhouse ditional quảng cáo- tại Oliveros đã bị nhiễm S. virginica (8 Ð 40 Þrst để instars thứ hai mỗi hàng) ba lần trong V6 DR4 giai đoạn tăng trưởng (31Ð56 dap) và R3 giai đoạn tăng trưởng (41 dap) với 40 người lớn. Ấu trùng và người lớn thu được từ S. virginica ấu trùng đồng nghiệp lected trên sunßower và nuôi đến tuổi trưởng thành tại Yana' - suy (Venado Tuerto, Santa Fe, Argentina). Các screenhouse thứ hai tại Fontezuela không có thể bị nhiễm do sự thiếu hụt của S. virginica chăn nuôi. Thiệt hại đã được đánh giá là mô tả trước đây tại R3 để R6 giai đoạn tăng trưởng (Trung Đoàn 52 87 dap) trong R. nu nhà sàng lọc và R6 giai đoạn phát triển (101 dap) trong virginica screenhouse S.. Dữ liệu thiệt hại được phân tích như mô tả trước đây. High-Dose sinh trắc nghiệm. Dòng 19.459-55 và 19.487-35 được đánh giá biểu hiện liều cao TIC107 chống lại A. gemmatalis và P. includens bằng cách sử dụng sinh trắc nghiệm pha loãng của các mô lá đông khô được đưa vào chế độ ăn uống artiÞcial. Hai loài gây hại đã được lựa chọn vì độ nhạy cảm khác nhau của họ để Bt và sự xuất hiện của họ tại Hoa Kỳ, nơi nghiên cứu đã được tiến hành. Trứng côn trùng được lấy từ các thuộc địa phòng thí nghiệm tại Monsanto, Union City, TN (A. gemmatalis) và uni trường đại học Georgia, Tifton (P. includens), và incu- nín trong hộp polypropylene 2.8-lít (Rubbermaid, Wooster, OH) lót bằng mô ẩm nhẹ nhàng và ủ trong buồng môi trường (# I-35VL, Percival, Boone, IA) tại 27 ± 1 ° C, 60 ± 10% RH, và một gian chiếu sáng của 00:24 (L: D) cho đến khi h hatch. Mẫu mô lá thu thập để phân tích biểu hiện protein như mô tả ở trên đã được sử dụng trong nghiên cứu này. Sau khi tham gia một phần của các mẫu cho ELISA, mô còn lại được chuyển vào ống ly tâm nhựa 50 ml, cân nặng, và đông khô qua đêm trong một máy sấy đông (VIRTIS, Gardiner, NY). Mẫu đông khô được giải đông và cân lại để thành lập mới: tương quan trọng lượng khô và nghiền thành bột bằng cách đặt Þve để quả bóng thép sáu 5/8-inch trong mỗi ống và lắc trên một máy trộn Harbil 5G-HD 3D 6 phút. Mẫu nghiền thành bột được bảo quản ở nhiệt độ 4 ° C cho đến khi sử dụng cho xét nghiệm sinh học. Ba sinh trắc nghiệm được tiến hành đối với từng loài ngoại, mỗi trong đó có một lần lặp lại của mỗi dòng Bt và một Isoline ở từng giai đoạn phát triển của cây từ mỗi địa điểm. Các mẫu được làm ấm đến nhiệt độ phòng và cân nặng vào 50 ml ống ly tâm nhựa, bằng cách sử dụng tươi: khô tương quan trọng lượng của mỗi mẫu để tính toán một số tiền đó, khi được đưa vào chế độ ăn uống ar- côn trùng tiÞcial, sẽ cho kết quả trong một pha loãng tương đối 25 lần để mô sống. Nhiều loài bướm chế độ ăn uống với khuôn inhibitor (Southland Products Inc., Lake Village, AR), modiÞed bằng cách thay thế agar agar với lớp phân tích (# 11.393, Serva, Heidelberg, Ger- nhiều) với tốc độ 11,2 g / lít của chế độ ăn uống , đã được chuẩn bị và làm lạnh đến 260 ° C trong một cốc nước. Các mẫu được trong- corporated bằng cách thêm vào chế độ ăn uống cho một khối lượng Þnal 17,5 ml mỗi và kích động trên một máy trộn Vortex-Genie (ScientiÞc Industries, Bohemia, NY) ở thiết lập cao nhất cho đến khi chế độ ăn uống là một màu đồng nhất, và không có dấu vết của mẫu là có thể nhìn thấy trên tường ống. Chế độ ăn uống tẩm mẫu đã được phân phát (0,5 ml / giếng) dưới mui xe sinh học vào khay xét nghiệm sinh học 128 giếng (# BIO-BA-128, CD quốc tế trong Inc., Pitman, NJ) bằng cách sử dụng một peater Eppendorf Re- 4780 ( Brinkmann Instruments, Westbury, NY) và được củng cố. Phương pháp điều trị chứa 28 D32 giếng, và hai điều khiển không được điều trị (UTC) gồm chế độ ăn uống chỉ (32 hoặc 64 giếng mỗi) đã được bao gồm trong mỗi xét nghiệm sinh học, một phân phối trước khi mẫu lập và khác sau đó. A A. gemmatalis đơn hoặc P. includens larva, 0 D24 h posthatch, đã được chuyển giao cho từng tốt với một bàn chải Þne camelÕs-tóc. Khay được ấn chứng bằng preventilated, bìa tự dính (# BIO-CV-16, CD International Inc.) và ủ trong buồng môi trường # I-35VL ở 27 ± 1 ° C, 60 ± 10% RH, và một gian chiếu sáng của 00:24 (L: D) h. Sinh trắc nghiệm được ghi bằng cách ghi lại số lượng ấu trùng chết và instar nạn nhân ở từng điều trị sau 11 d và điều chỉnh chế độ ăn uống không điều trị cho các điều khiển (Abbott 1925).