Using Harbo’s diluent, slow cooling

Using Harbo’s diluent, slow cooling to
prevent cold shock, and freezing samples at
3 ◦C/min produced the greatest spermatozoa
viability (93%) (Tab. I). Motility in this treatment
was indistinguishable from unfrozen semen.
When using the same diluent and freezing
rate, but rapidly cooling to just above 0 ◦C
the viability of spermatozoa was just 13%,
and motility was absent. Comparing these two
554 B.K. Hopkins, C. Herr
results would suggest that honey bee spermatozoa
is susceptible to cold shock when
frozen at 3 ◦C/min in Harbo’s diluent. When
Harbo (1983) performed his freezing experiments,
spermatozoa containing solutions were
loaded as 22 µL volumes in capillary tubes and
placed in a refrigerator at 5 ◦C overnight. The
cooling rate would be expected to have been
more rapid than our slow cooling method and
might explain his lower percentage of worker
brood (22%). Harbo provided no post-thaw
cell viability data that would make possible a
comparison with our study. Whereas these results
are consistent with honey bee spermatozoa
being cold shock sensitive, interestingly,
cold shock did not appear to be as important
a factor with the other treatments (Tab. I).
The other treatments being resistant to cold
shock would be consistant with findings in
Kaftanoglu and Peng’s (1984) report. Harbo’s
diluent is the only one that lacked Tris base.
We observed that at least a portion of the egg
yolk in Harbo’s diluent formed an insoluble
flocculent, whereas, in diluents containing Tris
base, the egg yolk and diluent appeared clear,
as if the yolk had been solubilized. It has been
suggested that egg yolk protects against the
effects of cold shock (Amann and Graham,
1993). Maybe the difference in egg yolk solubility
is why slow cooling to above 0 ◦C was
such a major factor in Harbo’s diluent and not
in others. Hopefully, slow cooling might eliminate
the need for egg yolk, or make finding a
replacement easier, which is one of our future
goals.
In the preliminary experiments, viability
was poor in treatments using glycerol.
Cryoprotectant toxicity tests, using live/dead
staining, were done in order to investigate cell
viability independent of the effects of freezing
and thawing. We found that the glycerol containing
diluent caused the greatest percentage
of cell death prior to freezing; interesting because
glycerol is widely and successfully used
for mammalian semen freezing (Curry, 2007).
Glycerol was eliminated as a candidate cryoprotectant
in this study. However, cryoprotectant
toxicity of glycerol was not tested prior to
our preliminary experiments and so was used.
The lower spermatozoa viability recorded in
the glycerol containing treatments in the preliminary
experiments might have been in part
caused by the glycerol toxicity, not freezing.
A future study is needed that includes a treatment
where glycerol is added to the Harbo’s
base diluent.
Ethylene glycol was far less toxic to spermatozoa
than glycerol, but simple observations
of motility could have easily concealed
this fact. When placed in a diluent containing
EG, all motility ceased. However, when diluted
out of the diluent, motility was restored.
An interesting possibility seemed that maybe
spermatozoa might benefit by having motility
inhibited during the freezing process. No results
bared this out though. In general, EG performed
poorly as a honey bee semen cryoprotectant.
However, a future study is needed that
includes a treatment where EG is added to the
Harbo’s base diluent.
Spermatozoa survived well and seem to tolerate
both “HH DMSO diluent” and “Harbo’s
DMSO diluent” absent freezing. To further investigate
the limits of tolerance to DMSO,
spermatozoa were exposed to an even greater
concentration of DMSO in our “HH DMSO
diluent” (“HH Extra DMSO”) in order to determine
the cells’ toxicity limit. At the increased
concentrations of DMSO (15% v/v),
there was a significant drop in cellular viability
over an hour at room temperature.
We tested two different freezing rates:
3 ◦C/min and rapid freezing (vitrification). Future
studies that test other freezing rates and
methods would seem worthwhile. It would
be worth testing some more commonly used
freezing methods used in the artificial breeding
industry. Freezing in pellets on dry ice and
in LN2 vapor are some of the industry standards
for semen freezing. However, it would
seem more worthwhile to first field test the
method that generated the best results presented
within this report, since these results
appeared to equal unfrozen semen in terms of
viability and motility. Our current concern is
for the compatibility of the diluent with queen
insemination. Harbo (1976) reported queens
produced normal progeny when inseminated
with semen containing DMSO at concentrations
below 12%. However, egg yolk has not
been tested in the insemination of queens.
Cryopreservation of honey bee spermatozoa 555
The tiny volume of semen collected from
a drone made it an attractive candidate for
the vitrification method. This being the first
reported study of honey bee semen vitrification,
the method could be improved by reducing
the number of transfers between LN2
baths. In preliminary experiments, vitrification
showed promising results, but samples thawed
after prolonged storage had significantly lower
cell viability. Using the same method of freezing
and thawing; samples stored for 6, 42, and
343 days resulted in 93.2, 77.5, and 41.5% viability,
respectively. Although these comparisons
are of data from different experiments,
and the experiments were not designed to investigate
this unexpected phenomenon; still
this decline in post-thaw spermatozoa viability
when using the vitrification method warrants
concern. Searching the literature revealed
a recent study published on cryopreservation
of mouse embryos that reported similar findings
(Mozdarani and Moradi, 2007). The study
included a vitrification treatment where the
severity of damage and subsequent failure of
embryos was related to the amount of time
spent in LN2 storage. Ice crystals forming at
LN2 temperatures in the storage straws over
time might be the cause of the decline in cellular
viability for vitrified samples. This finding
would contradict a currently accepted concept
within the field of cryobiology, which is that
below a temperature called the glass transition
temperature; ice fails to form (Giovambattista
et al., 2004). We are further researching this
phenomenon.
Results using the method of slow cooling
semen in Harbo’s diluent, and freezing in
a programmable freezing unit are promising
enough to warrant field trials. Live/dead cell
staining is useful but limited in its ability to assay
sperm viability. Obviously, the point of the
technology is to use it in the field. Next, use of
the cryopreserved semen with the instrumental
insemination of queens is necessary.
There is an urgent need for the cryopreservation
of honey bee spermatozoa. The frightening
losses of honey bees and humans’ vital
link to the species means the ability to properly
preserve and distribute honey bee genetics
is now crucial. Increased genetic diversity has
been shown to decrease severity of infection
(Seeley and Tarpy, 2007), and enhance productivity
and fitness (Mattila and Seeley, 2007).
There are populations of bees that do not require
chemical treatment for the control of parasites
or disease because of genetic characteristics.
With proper cryopreservation methods
those valuable alleles can be stored in the form
of semen, analyzed and distributed worldwide
for the purpose of increasing genetic diversity
and selective breeding without fretting time
constraints or environmental conditions. Certainly,
there are yet to be discovered important
alleles, which might disappear in the future
without a conscious effort at preserving
the currently available genetic diversity.
ACKNO

Kết quả (Việt) 2:

Sử dụng chất pha loãng Harbo của, làm mát chậm để
tránh sốc lạnh, đóng băng và mẫu tại
3 ◦C / min sản xuất tinh trùng lớn nhất
khả năng tồn tại (93%) (Tab tôi.). Motility trong điều trị này
là không thể phân biệt từ tinh dịch không đóng băng.
Khi sử dụng các chất pha loãng cùng và đóng băng
lãi suất, nhưng nhanh chóng làm mát chỉ còn trên 0 ◦C
khả năng tồn tại của tinh trùng chỉ là 13%,
và vận động đã vắng mặt. So sánh hai
554 BK Hopkins, C. Herr
kết quả sẽ cho thấy rằng mật ong tinh trùng
dễ bị sốc lạnh khi
đông lạnh ở 3 ◦C / phút trong dung môi Harbo của. Khi
Harbo (1983) thực hiện thí nghiệm đóng băng của ông,
tinh trùng có chứa các giải pháp đã được
nạp như khối lượng 22 ml trong ống mao dẫn và
đặt trong tủ lạnh ở 5 ◦C qua đêm. Các
tỷ lệ làm mát sẽ được dự kiến sẽ có được
nhiều hơn so với phương pháp làm mát nhanh chậm của chúng tôi và
có thể giải thích tỷ lệ thấp hơn của ông về nhân viên
bố mẹ (22%). Harbo không cung cấp lời giải đông
khả năng di động dữ liệu mà có thể làm cho một
so sánh với nghiên cứu của chúng tôi. Trong khi đó, những kết quả này
phù hợp với mật ong tinh trùng
bị sốc lạnh nhạy cảm, thú vị,
sốc lạnh dường như không phải là quan trọng
một yếu tố với các phương pháp điều trị khác (Tab. I).
Các phương pháp điều trị khác là khả năng chịu lạnh
sốc sẽ nhất quán với các kết quả nghiên cứu trong
Kaftanoglu và (1984) báo cáo của Peng. Harbo của
chất pha loãng là chỉ có một mà thiếu Tris cơ sở.
Chúng tôi quan sát thấy rằng ít nhất một phần của trứng
lòng đỏ trong pha loãng Harbo của hình thành một không tan
flocculent, trong khi đó, trong dung dịch pha loãng có chứa Tris
cơ sở, lòng đỏ trứng và chất pha loãng đã xuất hiện rõ ràng,
nếu như lòng đỏ đã được hòa tan. Nó đã được
gợi ý rằng lòng đỏ trứng bảo vệ chống lại các
tác động của cú sốc lạnh (Amann và Graham,
1993). Có lẽ sự khác biệt trong lòng đỏ trứng hòa tan
là làm mát tại sao chậm trên 0 ◦C là
như một nhân tố chính trong chất pha loãng Harbo và không phải
ở những người khác. Hy vọng rằng, làm lạnh chậm có thể loại bỏ
sự cần thiết cho lòng đỏ trứng, hoặc làm cho việc tìm kiếm một
sự thay thế dễ dàng hơn, đó là một trong tương lai của chúng ta
bàn thắng.
Trong các thí nghiệm sơ bộ, tính khả thi
đã được người nghèo trong phương pháp điều trị bằng cách sử dụng glycerol.
Thử nghiệm độc tính chất bảo vệ lạnh, sử dụng trực tiếp / chết
nhuộm, đã được thực hiện để điều tra tế bào
khả năng tồn tại độc lập với tác dụng đóng băng
và tan băng. Chúng tôi thấy rằng các glycerol có chứa
chất pha loãng gây ra tỷ lệ phần trăm lớn nhất
của tế bào chết trước khi đóng băng; thú vị vì
glycerol được rộng rãi và sử dụng thành công
cho tinh dịch động vật có vú đông (Curry, 2007).
Glycerol đã được loại bỏ như là một chất bảo vệ lạnh ứng cử viên
trong cuộc nghiên cứu này. Tuy nhiên, chất bảo vệ lạnh
độc tính của glycerol không được kiểm tra trước khi
thí nghiệm sơ bộ của chúng tôi và do đó được sử dụng.
Khả năng sống tinh trùng thấp hơn được ghi lại trong
các glycerol có phương pháp điều trị trong sơ bộ
thí nghiệm có thể có được một phần là
do các độc tính glycerol, không đóng băng.
Một nghiên cứu tương lai là cần thiết bao gồm một điều trị
nơi glycerol được thêm vào của Harbo
cơ sở pha loãng.
Ethylene glycol là ít độc hại cho tinh trùng
so với glycerol, nhưng quan sát đơn giản
của sự vận động có thể dễ dàng che giấu
thực tế này. Khi được đặt vào một chất pha loãng có
EG, tất cả các khả năng vận động chấm dứt. Tuy nhiên, khi pha loãng
ra của các chất pha loãng, sự vận động đã được khôi phục.
Một khả năng thú vị dường như rằng có lẽ
tinh trùng có thể có lợi bằng việc có khả năng vận động
ức chế trong quá trình đóng băng. Không có kết quả
để trần này ra mặc dù. Nói chung, EG thực hiện
kém như một con ong mật ong tinh dịch bảo vệ lạnh.
Tuy nhiên, một nghiên cứu trong tương lai là cần thiết rằng
có một điều trị nơi EG được thêm vào
cơ sở pha loãng của Harbo.
Tinh trùng sống sót tốt và dường như chịu đựng được
cả "HH DMSO chất pha loãng" và "Harbo của
DMSO chất pha loãng "đông lạnh vắng mặt. Để điều tra thêm
các giới hạn của khả năng chịu DMSO,
tinh trùng được tiếp xúc với một lớn hơn
nồng độ của DMSO trong chúng tôi "HH DMSO
chất pha loãng" ("HH tắm DMSO") để xác định
giới hạn độc tính của tế bào. Đồng tăng
nồng độ của DMSO (15% v / v),
có sự giảm đáng kể về khả năng tồn tại của tế
bào. Hơn một giờ ở nhiệt độ phòng
Chúng tôi đã thử nghiệm hai giá lạnh khác nhau:
3 ◦C / phút và làm đông nhanh (thủy tinh hóa). Tương lai
nghiên cứu thử nghiệm mức đóng băng khác và
phương pháp có vẻ như đáng giá. Nó sẽ
có giá trị thử nghiệm một số thường được sử dụng
phương pháp đông lạnh được sử dụng trong sinh sản nhân tạo
ngành công nghiệp. Đóng băng ở dạng viên nước đá khô và
trong hơi LN2 là một số trong các tiêu chuẩn công nghiệp
cho tinh dịch đông lạnh. Tuy nhiên, nó sẽ
có vẻ đáng giá hơn để thử nghiệm thực địa đầu tiên các
phương pháp mà tạo ra các kết quả tốt nhất được trình bày
trong báo cáo này, từ những kết quả
xuất hiện để bằng tinh dịch không đóng băng về
khả năng tồn tại và vận động. Quan tâm hiện nay của chúng tôi là
về sự phù hợp của các chất pha loãng với nữ hoàng
thụ tinh. Harbo (1976) báo cáo queens
sản xuất thế hệ con cháu bình thường khi được thụ tinh
với tinh trùng chứa DMSO ở nồng độ
dưới 12%. Tuy nhiên, lòng đỏ trứng đã không
được thử nghiệm trong việc thụ tinh của các nữ hoàng.
Bảo quản lạnh tinh trùng của ong mật ong 555
Khối lượng nhỏ tinh dịch thu thập từ
một mục tiêu giả đã làm cho nó một ứng cử viên hấp dẫn đối với
các phương pháp đông lạnh nhanh. Điều này được cho là người đầu tiên
nghiên cứu báo cáo của tinh dịch mật ong thủy tinh hóa,
phương pháp này có thể được cải thiện bằng cách giảm
số lượng chuyển giao giữa LN2
phòng tắm. Trong các thí nghiệm sơ bộ, thủy tinh hóa
cho kết quả đầy hứa hẹn, nhưng các mẫu tan băng
sau khi bảo quản kéo dài đã thấp hơn đáng kể
khả năng di động. Sử dụng cùng một phương pháp đông lạnh
và rã đông; mẫu được lưu trữ cho 6, 42, và
343 ngày dẫn đến 93.2, 77.5, và 41.5% khả năng tồn tại,
tương ứng. Mặc dù những so sánh
là số liệu từ các thí nghiệm khác nhau,
và các thí nghiệm đã không được thiết kế để điều tra
hiện tượng này bất ngờ; vẫn
suy giảm này ở sau giải đông tinh trùng khả năng tồn tại
khi sử dụng các phương pháp thủy tinh hóa bảo đảm
mối quan tâm. Tìm kiếm tài liệu tiết lộ
một nghiên cứu gần đây được đăng trên bảo quản lạnh
phôi chuột mà báo cáo kết quả tương tự
(Mozdarani và Moradi, 2007). Nghiên cứu
bao gồm một điều trị đông lạnh nhanh nơi
mức độ thiệt hại và thất bại tiếp theo của
phôi đã được liên quan đến số lượng thời gian
dành cho việc lưu trữ LN2. Tinh thể băng hình thành với
LN2 nhiệt độ trong ống hút lưu trữ qua
thời gian có thể là nguyên nhân của sự suy giảm trong tế bào
khả thi cho các mẫu vitrified. Phát hiện này
sẽ mâu thuẫn với một khái niệm chấp nhận hiện nay
trong lĩnh vực cryobiology, mà là
bên dưới một nhiệt độ được gọi là chuyển tiếp thủy tinh
nhiệt độ; băng không để hình thành (Giovambattista
et al., 2004). Chúng tôi đang tiếp tục nghiên cứu này
hiện tượng.
Kết quả sử dụng các phương pháp làm lạnh chậm
tinh dịch pha loãng trong Harbo, và đóng băng trong
một đơn vị đóng băng có thể lập trình được hứa hẹn
đủ để đảm bảo cuộc thử nghiệm. Live / chết tế bào
nhuộm là hữu ích nhưng chỉ giới hạn trong khả năng của nó để khảo nghiệm
khả năng phát triển của tinh trùng. Rõ ràng, điểm của các
công nghệ là sử dụng nó trong lĩnh vực này. Tiếp theo, sử dụng
tinh dịch được bảo quản lạnh với các cụ
thụ tinh của các nữ hoàng là cần thiết.
Có một nhu cầu cấp thiết cho sự bảo quản lạnh
của ong mật ong tinh trùng. Các đáng sợ
thua lỗ của ong mật và quan trọng của con người
liên kết đến các loài có nghĩa là khả năng đúng cách
bảo quản và phân phối di truyền học ong mật
tại là rất quan trọng. Sự đa dạng di truyền tăng đã
được chứng minh là làm giảm mức độ nghiêm trọng của nhiễm trùng
(Seeley và Tarpy, 2007), và nâng cao năng suất
và thể dục (Mattila và Seeley, 2007).
Có số lượng ong mà không yêu cầu
xử lý hóa học đối với việc kiểm soát ký sinh trùng
hoặc bệnh vì các đặc điểm di truyền.
Với phương pháp bảo quản lạnh đúng
những alen có giá trị có thể được lưu trữ trong các hình thức
của tinh dịch, phân tích và phân phối trên toàn thế giới
với mục đích gia tăng sự đa dạng di truyền
và chọn tạo giống mà không cần băn khoăn thời gian
hạn chế hoặc điều kiện môi trường. Chắc chắn,
đó là chưa được phát hiện quan trọng
alen, mà có thể biến mất trong tương lai
mà không có một nỗ lực có ý thức giữ gìn
sự đa dạng di truyền hiện nay.
ACKNO