2.4. pH measurementSamples containi

2.4. pH measurement
Samples containing 10 guts in 50 ml of deioni-
zed water were vortexed briefly. Measurements of
pH were made using a Hamilton Biotrode filled
with Proteolyte connected to a Corning pH meter
440 (Corning, New York).
2.5. Insect bioassay
The bioassay diet consisted of 85% toasted
wheat germ (Southland Products, Inc., Lake Vil-
lage, AR), 10% wheat flour, and 5% brewers yeast
(Sigma). This diet was chosen because larvae grew
faster than on the rearing diet. In addition, bioas-
says with this diet reflected the natural situation
of larvae feeding primarily on the protein-rich
germ of wheat kernels. E-64 was predissolved in
water before addition to the diet because of its
relatively limited solubility. Proteinaceous inhibi-
tors were added as powders. Water was added to
each diet in a ratio of 3:2 (vyw), and after mixing
with a spatula, the diet was lyophilized and then
ground in a mortar with a pestle. Individual neo-
nates were placed on 6 mg of diet and held at 28
8C, 16L:8D, ;75% RH over saturated NaCl. After
12 days, each larva was weighed. Growth was
calculated from mean initial weight (IW) on day
0 (0.03 mg) and mean final weight (FW) on day
12, according to the formula: (FW-IWyIW). After
log transformation of the weights, Ryan’s Q test
was used to determine significant differences
between dietary treatments (SAS Institute). The
data for percent reduction in growth were not
transformed before analysis. The Fisher exact test
was used to determine significant differences in
mortality.
3. Results
The pH for optimal protein hydrolysis by T.
castaneum larval gut proteinases was determined
for use in the evaluation of inhibitors in vitro.
Hydrolysis of a general proteinase substrate,
casein, by gut extracts from T. castaneum larvae
was optimal at pH 4.2 in the presence of a reducing
reagent, indicative of cysteine proteinase activity
(Fig. 1a). The hydrolysis of more specific sub-
strates, BApNA and SAAPFpNA, provided evi-
dence for both acidic and alkaline proteinases in
gut extracts (Fig. 1b,c). BApNA was hydrolyzed
maximally at both pH 4.2 and 8.5–9.2, whereas
maximal hydrolysis of SAAPFpNA occurred in
the alkaline range (pH 9.2–10.6). In contrast, the
pH of larval gut extracts was 6.5"0.1 (ns3,
"S.D.).
The effect of selected inhibitors on the activity
of T. castaneum larval gut proteinases was evalu-
ated in vitro with the general substrate casein in
pH 4.2 buffer. Inhibitors were tested over a range
of concentrations and compared to the activity
measured in the absence of inhibitors (Fig. 2).
Under these conditions, the most effective inhibi-
tors were leupeptin, a peptide that inhibits both
serine and cysteine proteinases, and E-64, a low
molecular weight epoxy derivative with cysteine
proteinase selectivity, with IC values of 0.05 and
50
0.11 mM, respectively (Table 1). Three proteina-
ceous cysteine proteinase inhibitors, equistatin,
JCPI, and PCPI, caused inhibition similar to that
of TLCK and antipain, with IC values ranging
50
from 0.2–0.8 mM. Chymostatin, TPCK, and STI
only weakly inhibited T. castaneum gut proteolytic
activity, with IC values of 3.4, 24, and 58 mM,

Kết quả (Việt) 1:

2.4. pH đo lườngMẫu có chứa 10 ruột trong 50 ml của deioni-Zed nước đã vortexed một thời gian ngắn. Các số đo củapH đã được thực hiện bằng cách sử dụng một Biotrode Hamilton đầyvới Proteolyte kết nối với một đồng hồ đo độ pH Corning440 (Corning, New York).2.5. côn trùng bioassayChế độ ăn uống bioassay bao gồm 85% nướngmầm lúa mì (Southland Products, Inc., Lake Vil-Lage, AR), 10% lúa mì bột, và 5% brewers nấm men(Sigma). Chế độ ăn uống này được chọn vì ấu trùng lớnnhanh hơn tại một trong những chế độ ăn uống nuôi. Ngoài ra, bioas-nói với điều này chế độ ăn uống phản ánh tình hình tự nhiênẤu trùng ăn chủ yếu chất đạm phong phúmầm lúa mì hạt nhân. E-64 được predissolved trongnước trước khi bổ sung chế độ ăn uống vì của nóhòa tan tương đối hạn chế. Proteinaceous inhibi-Tors đã được thêm vào như bột. Nước đã được thêm vàomỗi chế độ ăn uống theo tỉ lệ 3:2 (vyw), và sau khi trộnvới một spatula, chế độ ăn uống sản và sau đómặt đất trong một vữa với một pestle. Cá nhân neo-nates được đặt trên 6 mg của chế độ ăn uống và được tổ chức tại 288C, 16L: 8 d, 75% RH trên bão hòa NaCl. Sau khi12 ngày, mỗi ấu trùng được cân nặng. Tốc độ tăng trưởngtính toán trọng lượng ban đầu có nghĩa là (IW) vào ngày0 (0.03 tấn) và trọng lượng cuối cùng có nghĩa là (FW) vào ngày12, theo công thức: (FW-IWyIW). Sau khiđăng nhập chuyển đổi của trọng lượng, Ryan của Q thử nghiệmđược sử dụng để xác định sự khác biệt lớngiữa chế độ ăn uống điều trị (SAS viện). Cácdữ liệu cho phần trăm giảm tăng trưởng đã khôngchuyển đổi trước khi phân tích. Fisher thử nghiệm chính xácwas used to determine significant differences inmortality.3. ResultsThe pH for optimal protein hydrolysis by T.castaneum larval gut proteinases was determinedfor use in the evaluation of inhibitors in vitro.Hydrolysis of a general proteinase substrate,casein, by gut extracts from T. castaneum larvaewas optimal at pH 4.2 in the presence of a reducingreagent, indicative of cysteine proteinase activity(Fig. 1a). The hydrolysis of more specific sub-strates, BApNA and SAAPFpNA, provided evi-dence for both acidic and alkaline proteinases ingut extracts (Fig. 1b,c). BApNA was hydrolyzedmaximally at both pH 4.2 and 8.5–9.2, whereasmaximal hydrolysis of SAAPFpNA occurred inthe alkaline range (pH 9.2–10.6). In contrast, thepH of larval gut extracts was 6.5"0.1 (ns3,"S.D.).The effect of selected inhibitors on the activityof T. castaneum larval gut proteinases was evalu-ated in vitro with the general substrate casein inpH 4.2 buffer. Inhibitors were tested over a rangeof concentrations and compared to the activitymeasured in the absence of inhibitors (Fig. 2).Under these conditions, the most effective inhibi-tors were leupeptin, a peptide that inhibits bothserine and cysteine proteinases, and E-64, a lowmolecular weight epoxy derivative with cysteineproteinase selectivity, with IC values of 0.05 and500.11 mM, respectively (Table 1). Three proteina-ceous cysteine proteinase inhibitors, equistatin,JCPI, and PCPI, caused inhibition similar to thatof TLCK and antipain, with IC values ranging50from 0.2–0.8 mM. Chymostatin, TPCK, and STIonly weakly inhibited T. castaneum gut proteolyticactivity, with IC values of 3.4, 24, and 58 mM,

Kết quả (Việt) 2:

2.4. đo pH
mẫu chứa 10 ruột trong 50 ml deioni-
nước Zed đã vortexed một thời gian ngắn. Các phép đo
pH đã được thực hiện bằng cách sử dụng một Biotrode Hamilton điền
với Proteolyte kết nối với một máy đo pH Corning
440 (Corning, New York).
2.5. Côn trùng xét nghiệm sinh học
Các chế độ ăn uống xét nghiệm sinh học bao gồm 85% nướng
mầm lúa mì (Southland Products, Inc., Hồ Vil-
lage, AR), 10% bột lúa mì, và 5% men bia
(Sigma). Chế độ ăn uống này được chọn vì ấu trùng phát triển
nhanh hơn so với chế độ ăn chăn nuôi. Ngoài ra, bioas-
nói với chế độ ăn uống này phản ánh tình hình tự nhiên
cho ăn ấu trùng chủ yếu vào các protein giàu
mầm của hạt lúa mì. E-64 được predissolved trong
nước trước khi bổ sung vào chế độ ăn vì nó
hòa tan tương đối hạn chế. Ức chế Proteinaceous
TOR đã được thêm vào như bột. Nước được bổ sung vào
chế độ ăn uống mỗi năm một tỷ lệ 3: 2 (vyw), và sau khi trộn
với một thìa, chế độ ăn uống đã được đông khô và sau đó
nghiền trong cối với một cái chày. Neo- cá nhân
mươi từ được đặt trên 6 mg của chế độ ăn uống và tổ chức tại 28
8C, 16L: 8D,; 75% RH hơn bão hòa NaCl. Sau
12 ngày, mỗi ấu trùng được cân. Tăng trưởng được
tính từ cân nặng ban đầu trung bình (IW) vào ngày
0 (0,03 mg) và cân nặng trung bình cuối cùng (FW) vào ngày
12, theo công thức: (FW-IWyIW). Sau khi
chuyển đổi đăng nhập của các trọng, Q thử nghiệm của Ryan
đã được sử dụng để xác định sự khác biệt đáng kể
giữa các công thức chế độ ăn uống (SAS Institute). Các
dữ liệu cho giảm phần trăm trong tăng trưởng không được
chuyển đổi trước khi phân tích. Các thử nghiệm chính xác Fisher
đã được sử dụng để xác định sự khác biệt đáng kể trong
tỷ lệ tử vong.
3. Kết quả
pH tối ưu cho quá trình thủy phân protein của T.
castaneum proteinases ruột ấu trùng đã được xác định
để sử dụng trong việc đánh giá chất ức chế in vitro.
Thủy phân của một chất nền proteinase chung,
casein, bởi chiết xuất từ ruột ấu trùng T. castaneum
được tối ưu ở pH 4.2 trong sự hiện diện của một giảm
thuốc thử, chỉ thị của hoạt động cysteine ​​proteinase
(Hình 1a.). Quá trình thủy phân của phụ cụ thể hơn
strates, BApNA và SAAPFpNA, cung cấp chứng cứ
dence cho cả proteinases có tính axit và kiềm trong
chiết xuất ruột (Hình. 1b, c). BApNA được thủy phân
tối đa ở cả hai pH 4.2 và 8,5-9,2, trong khi
thủy phân tối đa của SAAPFpNA xảy ra trong
khoảng kiềm (pH 9,2-10,6). Ngược lại,
pH của chất chiết xuất từ ruột của ấu trùng là 6,5 "0.1 (NS3,
"SD).
Các tác dụng của các thuốc ức chế chọn lọc về các hoạt động
của T. castaneum proteinases ruột ấu trùng evalu-
ated trong ống nghiệm với casein chất nền chung ở
pH 4,2 đệm . Các chất ức chế đã được thử nghiệm trên một phạm vi
của nồng độ và so sánh với các hoạt động
đo trong sự vắng mặt của các chất ức chế (Hình. 2).
Dưới những điều kiện này, ức chế hiệu quả nhất
các nhà đã leupeptin, một peptide mà ức chế cả
serine và cysteine ​​proteinases, và E -64, một thấp
trọng lượng phân tử epoxy phái sinh với cysteine
​​proteinase chọn lọc, với giá trị IC 0,05 và
50
0,11 mM, tương ứng (Bảng 1). Ba proteina-
ức chế cysteine ​​proteinase ceous, equistatin,
JCPI, và PCPI, gây ra sự ức chế tương tự như
của TLCK và antipain, với các giá trị khác nhau, IC
50
0,2-0,8 mM. Chymostatin, TPCK, và STI
T. proteolytic castaneum ruột chỉ yếu ức chế
hoạt động, với các giá trị IC 3,4, 24, và 58 mM,