CHAPTER THREE: MATERIALS AND METHOD

CHAPTER THREE: MATERIALS AND METHODS
3.1 Study design
This was a descriptive study that involved examination of live birds and carcasses submitted for
post-mortem (PM) examination, followed by a thorough systematic necropsy done in the faculty
PM unit. Live birds and carcasses of chicken were received from clients for diagnostic purposes
in the study period, (October 2008 to March 2010). The clients originated from the Districts of
Kampala, Wakiso, Mukono, Jinja, Kyenjojo and Mpigi. Tissue samples were collected and fixed
in 10% buffered formalin for histopathology and immunohistochemistry.
3.2 Sample size determination
Sample size was determined using a formula described by Wayne and colleagues in (1987) as
below.
N == 4PQ/ L²
Where, N is the sample size
P, the estimated prevalence,
L is the allowable error and Q = 1- P
Assuming that the prevalence of ND in chicken presented for necropsy at the faculty was 15%
and the allowable error was 5%. The number of samples collected was calculated as:
N == 4× 0.1 ×0.9
(O.O5)²
= 204
Basing on the above formula, samples from 216 carcasses of chickens were obtained for the
study.
3.3. Data analysis.
Descriptive statistics was used to analyze the data
3.4 Methods
Clinical history of each chicken presented for necropsy was obtained from the clients. The
information recorded included, each client’s and clinician’s details such as the name and address
of the farmer, location of the farm, the name and address of the clinician. Bio-data of the
chickens were also recorded, namely, the breed, age, sex, mortality and morbidity rates including
the date when the death or drop in production started.
A thorough systematic post mortem examination was then done on all chickens presented for
necropsy during the study period; gross lesions observed were recorded and described basing on
the location, severity and distribution of the lesions. Samples for histopathology were obtained
from the following organs, liver, spleen, caecal tonsils, lungs, segments of intestines, kidneys,
and the brain. The tissue samples were fixed in 10% buffered formalin.
Formalin fixed samples were trimmed and processed in automated tissue processor following the
protocol of Histotechnology as described by Edna et al, (1994). In brief; the tissue samples were
dehydrated by passing them through graded isopropyl alcohol (70%, to 80% to 90% to 96% and
100% absolute alcohol). Alcohol in tissue samples was cleared by xyelene, followed by paraffin
infiltration. Samples in solidified paraffin wax were cut into paraffin blocks; each sample was
sectioned to 5μm thick, and adhered onto clean glass slide. They were stained with
Haematoxylin and Eosin (H & E) and examined with light microscope; lesions seen were
recorded and described.
Immunohistochemistry (IHC) on formalin fixed, paraffin embedded sections was the diagnostic
method used to confirm Newcastle disease and for studying the viral antigen distribution in the
target tissues. Direct labelled Avidin- Biotin complex immunohistochemistry technique on
formalin fixed paraffin embedded chicken tissue sections were performed on 86 samples out of
the 216 total samples collected in this study. Samples for IHC were taken from all those chickens
that had clinical signs and lesions suggestive of ND (51 samples) and those chickens from flocks
with history of high mortalities and or rapid drop in production without implicating lesions of
any disease (35 samples).
Formalin fixed paraffin embedded blocked samples were sectioned to 4μm thickness and
adhered onto clean labelled slides. The samples were then placed in an oven at 54-56ºC for 24-48 hours so as to enhance firm adhesion of the tissue sections onto the slides. This was followed
by quenching of the endogenous peroxidase activity by incubating the specimen with peroxidase
block (3% hydrogen peroxide) for 5 minutes. The primary antibody was biotinylated by mixing
calculated quantities of diluent (PBS), concentrated primary antibody and Biotinylation reagent
in a test tube and the solution was incubated for 15 minutes at room temperature. The biotin
labelled primary antibody was then applied to the specimen on the slides and incubated for 30
minutes. The specimens were then incubated with Strepavidin- peroxidase followed by reaction
with 3́, 3΄ Diaminobenzidine as substrate chromogen. The samples were counter stained with
haematoxylin and dipped into ammonium water (2% ammonium solution) for the blue back
ground staining and finally mounted.
Chicken tissue from a known ND positive case was used as positive control. Two sections were
cut from Paraffin block containing a known ND positive sample, and each section was adhered
onto a clean glass slide. On to one positive control section, biotinylated primary antibody was
added and on to the other section, buffer was added instead of the primary antibody and the same
IHC staining procedure descried previously were followed on both slides. The later section
served as a negative control while the former was used as positive control. The same procedure
of substituting buffer for biotinylated primary antibody was used to run negative control for each
test section and all other stages of staining were maintained following the protocol of DAKO
ARK kit (www.histochem.org/archives/ark.pdf). The test sections, positive and negative control
sections from each set of slides were stained co-currently as quality assurance measure to
evaluate non specific staining and allow better interpretation of specific staining at antigen –
antibody sites. The stained slides were air dried and then examined under light microscope.
3.5 Challenges faced during this study
Delayed fund release and inadequate funding for this study which was very frustrating and
limited the scope of the research.
Some tissues got washed off between the different stages of IHC staining procedure. This
challenge was overcome by ensuring that each sample was sectioned in triplicate, one for
control, another for the actual test and the third section was reserved.
Many of the foreign companies were not willing to supply reagents in small quantities and those
that responded delayed to deliver them and this lead to the prolonged study period.
Potency of the available Newcastle disease vaccines in the market should be assessed as most
poultry farmers who presented their birds for necropsy claimed that the birds were vaccinated
against Newcastle disease in the previous four to five weeks but were diagnosed with the disease.
Possibility of manufacturing Newcastle disease vaccine using the antigens from local strains of
Newcastle disease virus should be studied. The vaccines derived from the local strains may
present better option in disease prevention than those from foreign strains of the virus.

Kết quả (Việt) 2:

Chương ba: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1 Thiết kế nghiên cứu
Đây là một nghiên cứu mô tả liên quan đến sự kiểm tra của các loài chim sống và linh kiện nộp cho
khám nghiệm tử thi (PM) kiểm tra, theo sau là một khám tử có hệ thống triệt để thực hiện trong các giảng viên
đơn vị PM. Cầm sống và thịt những con gà đã nhận được từ khách hàng cho mục đích chẩn đoán
ở giai đoạn nghiên cứu, (tháng 10 năm 2008 đến tháng 3 năm 2010). Các khách hàng có nguồn gốc từ các huyện
Kampala, Wakiso, Mukono, Jinja, Kyenjojo và Mpigi. Mẫu mô được thu thập và cố định
ở 10% đệm formalin cho mô bệnh học và hóa mô miễn dịch.
3.2 Mẫu quyết định kích thước
cỡ mẫu điều tra được xác định bằng cách sử dụng một công thức mô tả bởi Wayne và các đồng nghiệp tại (1987) như
dưới đây.
N == 4PQ / L²
đâu, N là cỡ mẫu
P, tỷ lệ ước tính,
L là lỗi cho phép và Q = 1- P
Giả sử rằng tỉ lệ NĐ gà được trình bày cho mổ tử thi của khoa là 15%
và sai số cho phép là 5%. Số lượng mẫu thu được tính như sau:
N == 4 × 0,1 × 0,9
(O.O5) ²
= 204
Căn cứ vào công thức trên, các mẫu từ 216 xác gà đã thu được
nghiên cứu.
3.3. Phân tích dữ liệu.
thống kê mô tả được sử dụng để phân tích dữ liệu
3.4 Các phương pháp
lịch sử lâm sàng của mỗi con gà được trình bày cho mổ tử thi đã thu được từ khách hàng. Các
thông tin ghi nhận bao gồm, của từng khách hàng và các chi tiết của bác sĩ chẳng hạn như tên và địa chỉ
của người nông dân, vị trí của các trang trại, tên và địa chỉ của bác sĩ. Bio-dữ liệu của
gà cũng được ghi nhận, cụ thể là, tỷ lệ giống, tuổi, giới tính, tỷ lệ tử vong và bệnh tật bao gồm cả
ngày khi cái chết hoặc giảm sản lượng bắt đầu.
Kết quả khám nghiệm tử thi có hệ thống bài kỹ lưỡng sau đó đã được thực hiện trên tất cả các con gà đã trình bày cho
mổ tử thi trong suốt thời gian nghiên cứu; tổn thương tổng số quan sát ghi nhận và mô tả dựa trên
vị trí, mức độ nghiêm trọng và phân phối của các thương tổn. Mẫu mô bệnh học đã thu được
từ các cơ quan sau đây, gan, lá lách, amidan manh tràng, phổi, các phân đoạn của ruột, thận,
và bộ não. Các mẫu mô được cố định ở 10% đệm formalin.
Formalin mẫu cố định đã được cắt và xử lý tại bộ xử lý mô tự động theo các
giao thức của Histotechnology như mô tả của Edna et al, (1994). Tóm lại; các mẫu mô được
khử nước bằng cách cho chúng đi qua cồn isopropyl xếp loại (70%, 80% đến 90% đến 96% và
100% cồn tuyệt đối). Rượu trong các mẫu mô đã được xóa bởi xyelene, tiếp theo là paraffin
xâm nhập. Các mẫu trong sáp paraffin kiên cố đã được cắt thành các khối paraffin; mỗi mẫu được
sectioned để 5μm dày và tôn lên lam kính sạch. Họ đã được nhuộm màu với
Haematoxylin và Eosin (H & E) và kiểm tra với kính hiển vi ánh sáng; tổn thương nhìn thấy được
ghi nhận và mô tả.
mô miễn dịch (IHC) trên formalin cố định, paraffin phần nhúng là chẩn đoán
phương pháp được sử dụng để xác nhận bệnh Newcastle và để nghiên cứu sự phân bố kháng nguyên của virus trong
các mô đích. Direct nhãn Avidin- Biotin kỹ thuật hóa mô miễn dịch phức tạp trên
phần mô formalin cố định paraffin nhúng gà đã được thực hiện trên 86 mẫu ra của
216 tổng số mẫu thu thập được trong nghiên cứu này. Mẫu cho IHC được lấy ra từ những con gà
mà đã có dấu hiệu lâm sàng và tổn thương gợi của ND (51 mẫu) và những con gà từ đàn
với lịch sử chết cao và hoặc giảm nhanh chóng trong sản xuất mà không liên lụy tổn thương của
bất kỳ bệnh (35 mẫu).
Formalin paraffin cố định nhúng mẫu chặn được khúc với độ dày 4μm và
tôn lên slide có nhãn sạch. Các mẫu sau đó được đặt trong lò ở 54-56ºC trong 24-48 giờ để tăng cường độ bám dính vững các phần mô lên slide. Điều này đã được theo sau
bởi dập tắt các hoạt động peroxidase nội sinh bằng cách ủ các mẫu vật với peroxidase
khối (3% hydrogen peroxide) trong 5 phút. Các kháng thể chính được biotinylated bằng cách trộn
một lượng tính toán của các chất pha loãng (PBS), kháng thể chính tập trung và Biotinylation thuốc thử
trong một ống nghiệm và các giải pháp đã được ủ trong 15 phút ở nhiệt độ phòng. Các biotin
nhãn kháng thể chính sau đó đã được áp dụng cho các mẫu vật trên các slide và ủ trong 30
phút. Các mẫu vật sau đó được ủ với Strepavidin- peroxidase theo sau phản ứng
với 3, 3 Diaminobenzidine như chất nền chất nhiễm sắc. Các mẫu được cập nhuộm bằng
haematoxylin và nhúng vào nước amoni (dung dịch amoni 2%) cho màu xanh trở lại
nhuộm mặt đất và cuối cùng gắn kết.
Gà mô từ một trường hợp nổi tiếng NĐ tích cực đã được sử dụng như kiểm soát tích cực. Hai phần được
cắt ra từ khối paraffin có chứa một tiếng mẫu dương ND, và mỗi phần được tôn
lên lam kính sạch. Vào một phần kiểm soát tích cực, kháng thể chính biotinylated được
thêm vào và chuyển sang phần khác, bộ đệm đã được bổ sung thay vì các kháng thể chính và cùng
trình nhuộm IHC descried trước đó được theo dõi trên cả slide. Các phần sau này
phục vụ như một điều khiển âm trong khi trước đây đã được sử dụng như kiểm soát tích cực. Các thủ tục tương tự
của việc thay thế đệm cho kháng thể chính biotinylated đã được sử dụng để chạy kiểm soát tiêu cực cho từng
phần thi và tất cả các giai đoạn khác của nhuộm được duy trì sau các giao thức của DAKO
ARK kit (www.histochem.org/archives/ark.pdf). Các phần kiểm tra, kiểm soát tích cực và tiêu cực
phần từ mỗi bộ slide được nhuộm đồng hiện đang là biện pháp đảm bảo chất lượng để
đánh giá nhuộm không cụ thể và cho phép giải thích rõ hơn về nhuộm cụ thể tại kháng nguyên -
kháng thể các trang web. Các slide màu được không khí khô và sau đó quan sát dưới kính hiển vi ánh sáng.
3.5 Những thách thức phải đối mặt trong quá trình nghiên cứu này
bị trì hoãn phát hành quỹ và tài trợ đầy đủ cho nghiên cứu này mà đã rất bực bội và
giới hạn phạm vi của nghiên cứu.
Một số mô sóng biển cuốn trôi đi giữa các giai đoạn khác nhau của IHC thủ tục nhuộm. Điều này
thách thức đã được khắc phục bằng cách bảo đảm rằng mỗi mẫu được khúc trong ba lần, một cho
kiểm soát, một cho các thử nghiệm thực tế và phần thứ ba được dành riêng.
Nhiều người trong số các công ty nước ngoài đã không sẵn sàng để cung cấp chất phản ứng với số lượng nhỏ và những người
đó đáp lại trì hoãn đến cung cấp cho họ và điều này dẫn đến thời gian nghiên cứu kéo dài.
Potency loại vắc-xin phòng bệnh Newcastle sẵn trên thị trường nên được đánh giá như hầu hết
nông dân chăn nuôi gia cầm có biểu hiện loài chim của họ cho mổ tử thi khẳng định rằng những con chim đã được chủng ngừa
chống lại bệnh Newcastle trong 4-5 tuần trước nhưng đã được chẩn đoán mắc bệnh.
Khả năng sản xuất vaccine Newcastle bệnh bằng cách sử dụng các kháng nguyên từ các chủng địa phương của
virus bệnh Newcastle cần được nghiên cứu. Các loại vắc xin có nguồn gốc từ các chủng địa phương có thể
trình bày lựa chọn tốt hơn trong công tác phòng bệnh hơn những người từ nước ngoài chủng của virus.