Thein vitro scratch assay is an eas

Thein vitro scratch assay is an easy, low-cost and well-developed method to measure cell migrationin vitro. The basic steps involve
creating a ‘‘scratch’’ in a cell monolayer, capturing the images at the beginning and at regular intervals during cell migration to close
the scratch, and comparing the images to quantify the migration rate of the cells. Compared to other methods, thein vitro scratch
assay is particularly suitable for studies on the effects of cell–matrix and cell–cell interactions on cell migration, mimic cell migration
during wound healingin vivo and are compatible with imaging of live cells during migration to monitor intracellular events if desired.
Besides monitoring migration of homogenous cell populations, this method has also been adopted to measure migration of individual
cells in the leading edge of the scratch. Not taking into account the time for transfection of cells,in vitroscratch assayper seusually
takes from several hours to overnight.
INTRODUCTION
Thein vitro scratch assay is a straightforward and economical
method to study cell migrationin vitro
1
. This method is based on
the observation that, upon creation of a new artificial gap, so called
‘‘scratch’’, on a confluent cell monolayer, the cells on the edge of the
newly created gap will move toward the opening to close the
‘‘scratch’’ until new cell–cell contacts are established again. The
basic steps involve creation of a ‘‘scratch’’ on monolayer cells,
capture of images at the beginning and regular intervals during cell
migration to close the scratch, and comparison of the images to
determine the rate of cell migration.
One of the major advantages of this simple method is that it
mimics to some extent migration of cellsin vivo.Forexample,
removal of part of the endothelium in the blood vessels will induce
migration of endothelial cells (ECs) into the denuded area to close
the wound
2
. Furthermore, the patterns of migration either as
loosely connected population (e.g., fibroblasts) or as sheets of
cells (e.g., epithelial and ECs) also mimic the behavior of these
cells during migrationin vivo. Another advantage of the in vitro
scratch assay is its particular suitability to study the regulation of
cell migration by cell interaction with extracellular matrix (ECM)
and cell–cell interactions. In other popular methods such as Boyden
chamber assays, preparation of cells in suspension before the
assays disrupts cell–cell and cell–ECM interactions. In addition,
the in vitro scratch assay is also compatible with microscopy
including live cell imaging, allowing analysis of intracellular signaling events (e.g., by visualization of green fluorescent protein (GFP)-tagged proteins for subcellular localization or fluorescent resonance
energy transfer for protein–protein interactions) during cell migration. On the other hand, it is also probably the simplest method to
study cell migration in vitro and only uses the common and
inexpensive supplies found in most laboratories capable of cell
culturing.
Although it is developed and more suitable for measuring
migration of population of cells, thein vitro scratch assay has
also been combined with other techniques, such as microinjection
or gene transfection, to assess the effects of expression of exogenous
genes on migration of individual cells
3–5
. The migration path of
individual cells in the leading edge of the scratch is tracked with the
aid of time-lapse microscopy and image analysis software. Capturing of an image in the beginning of the experiment with fluorescence microscopy can mark the cells with expression of exogenous
gene or downregulation of endogenous genes by RNA interference
(e.g., using a GFP marker). By comparing the tracks of these cells
with surrounding control cells under the same experimental conditions allows determination of the role of a particular gene in the
regulation of directional cell migration using the assay.
There are a number of disadvantages and limitations of the
in vitroscratch assay compared to other available methods. It does
not replace other well-established methods for chemotaxis such
as the Boyden chamber assay, as no chemical gradient is established.
It takes a relatively longer time to perform than some other
methods. One to two days are needed for the formation of cell
monolayer and then 8–18 h for cell migration to close the scratch.
Last, relatively large amount of cells and chemicals will be required
for the assay as it is usually performed in a tissue culture dish.
Therefore, it is not a method of choice if the availability of cells
(e.g., specialized primary cells that are hard to get in sufficient
amount) or chemicals (e.g., expensive reagents) is limiting. The
following table summarizes comparisons of the in vitro scratch
assay with several other methods. Despite these limitations of the
method, overall,in vitro scratch assay is still often the method of
choice to analyze cell migration in a laboratory because it is easy to
set up, does not require any specialized equipment and all materials
required for the assay are available in any laboratory that performs
cell culture.
In this protocol, Steps 1–9 describe the basic method of the
in vitro scratch assay for measuring migration of cell populations.
In Steps 10–13, the method is adopted to track migration of individual cells at the leading edge of the scratch. The latter is suitable to
study the effect of particular gene products on cell migration when
it is difficult to achieve high efficiency of transfection for exogenous
gene expression or siRNA-mediated gene knockdown.
p u o r G g n i h s i l b u P e r u t a N 7 0 0 2 © natureprotocols / m o c . e r

Kết quả (Việt) 1:

Thein ống nghiệm đầu khảo nghiệm là một phương pháp dễ dàng, rẻ và phát triển tốt để đo lường di động migrationin ống nghiệm. Các bước cơ bản liên quan đếntạo ra một vết xước '''' trong một tế bào monolayer, chụp những hình ảnh ở đầu và đặn trong khi di động di chuyển để đóngđầu, và so sánh các hình ảnh để định lượng tốc độ di chuyển của các tế bào. So với các phương pháp khác, thein ống nghiệm đầukhảo nghiệm là đặc biệt thích hợp cho các nghiên cứu về tác động của tế bào-ma trận và tế bào-tế bào tương tác trên di chuyển tế bào, tế bào mimic di chuyểntrong vết thương healingin vivo và là tương thích với hình ảnh của các tế bào sống trong khi di chuyển để theo dõi sự kiện nội bào nếu mong muốn.Bên cạnh việc giám sát các di chuyển của quần thể tế bào đồng nhất, phương pháp này đã cũng được áp dụng để đo lường các di cư của cá nhântế bào ở rìa hàng đầu của đầu. Không có tính đến thời gian cho transfection của các tế bào, trong vitroscratch assayper seusuallymất từ vài giờ để qua đêm.GIỚI THIỆUThein ống nghiệm đầu khảo nghiệm là một đơn giản và kinh tếphương pháp học di động migrationin ống nghiệmrface. Phương pháp này dựa trênkết luận là, sau khi tạo ra một khoảng cách nhân tạo mới, vì vậy gọi là'' cào '', trên một monolayer confluent tế bào, các tế bào ở rìa của cácmới được thành lập khoảng cách sẽ di chuyển về hướng cửa để đóng các'' đầu '' cho đến khi số liên lạc mới tế bào-tế bào được thành lập một lần nữa. Cácbước cơ bản liên quan đến sáng tạo của một đầu '''' trên tế bào monolayer,chụp các hình ảnh theo chu kỳ đầu và thường xuyên trong tế bàodi chuyển để đóng đầu, và so sánh các hình ảnh đểxác định tỷ lệ di động di chuyển.Một trong những lợi thế lớn của phương pháp này đơn giản là nóbắt chước để di chuyển một số mức độ của cellsin vivo. Forexample,loại bỏ một phần của nội mạc trong các mạch máu sẽ gây radi cư của các tế bào nội mô (ECs) vào khu vực denuded để đóngvết thương2. Hơn nữa, các mô hình của di chuyển một trong hai nhưlỏng lẻo kết nối dân (ví dụ: fibroblasts) hoặc như tờtế bào (ví dụ:, biểu mô và ECs) cũng bắt chước hành vi của nhữngtế bào trong migrationin vivo. Một ưu điểm khác của trong ống nghiệmđầu khảo nghiệm là của nó thích hợp cụ thể để nghiên cứu các quy định củadi động di chuyển bằng di động tương tác với ngoại bào ma trận (ECM)và tế bào-tế bào tương tác. Trong phương pháp phổ biến khác chẳng hạn như BoydenPhòng thí, chuẩn bị của các tế bào trong hệ thống treo trước khi cácthử nghiệm sẽ phá vỡ tế bào-tế bào và tế bào-ECM tương tác. Ngoài raCác khảo nghiệm đầu trong ống nghiệm là cũng tương thích với kính hiển vibao gồm cả di động trực tiếp hình ảnh, cho phép phân tích của nội bào tín hiệu sự kiện (ví dụ:, bởi kiểu trực quan của màu xanh lá cây huỳnh quang protein (GFP)-được dán protein cho địa phương hoá của hoặc cộng hưởng huỳnh quangnăng lượng chuyển cho tương tác protein-protein) trong khi di động di chuyển. Mặt khác, nó cũng có lẽ là phương pháp đơn giản nhất đểstudy cell migration in vitro and only uses the common andinexpensive supplies found in most laboratories capable of cellculturing.Although it is developed and more suitable for measuringmigration of population of cells, thein vitro scratch assay hasalso been combined with other techniques, such as microinjectionor gene transfection, to assess the effects of expression of exogenousgenes on migration of individual cells3–5. The migration path ofindividual cells in the leading edge of the scratch is tracked with theaid of time-lapse microscopy and image analysis software. Capturing of an image in the beginning of the experiment with fluorescence microscopy can mark the cells with expression of exogenousgene or downregulation of endogenous genes by RNA interference(e.g., using a GFP marker). By comparing the tracks of these cellswith surrounding control cells under the same experimental conditions allows determination of the role of a particular gene in theregulation of directional cell migration using the assay.There are a number of disadvantages and limitations of thein vitroscratch assay compared to other available methods. It doesnot replace other well-established methods for chemotaxis suchas the Boyden chamber assay, as no chemical gradient is established.It takes a relatively longer time to perform than some othermethods. One to two days are needed for the formation of cellmonolayer and then 8–18 h for cell migration to close the scratch.Last, relatively large amount of cells and chemicals will be requiredfor the assay as it is usually performed in a tissue culture dish.Therefore, it is not a method of choice if the availability of cells(e.g., specialized primary cells that are hard to get in sufficientamount) or chemicals (e.g., expensive reagents) is limiting. Thefollowing table summarizes comparisons of the in vitro scratchassay with several other methods. Despite these limitations of themethod, overall,in vitro scratch assay is still often the method ofchoice to analyze cell migration in a laboratory because it is easy toset up, does not require any specialized equipment and all materialsrequired for the assay are available in any laboratory that performscell culture.In this protocol, Steps 1–9 describe the basic method of thein vitro scratch assay for measuring migration of cell populations.In Steps 10–13, the method is adopted to track migration of individual cells at the leading edge of the scratch. The latter is suitable tostudy the effect of particular gene products on cell migration whenit is difficult to achieve high efficiency of transfection for exogenousgene expression or siRNA-mediated gene knockdown.p u o r G g n i h s i l b u P e r u t a N 7 0 0 2 © natureprotocols / m o c . e r

Kết quả (Việt) 2:

Thein vitro đầu khảo nghiệm là một cách dễ dàng, chi phí thấp và phương pháp phát triển tốt để đo cell migrationin vitro. Các bước cơ bản liên quan đến việc
tạo ra một '' đầu '' trong một lớp tế bào, chụp những hình ảnh lúc đầu và đều đặn trong thời gian di cư tế bào để đóng
các đầu, và so sánh những hình ảnh để xác định tốc độ di chuyển của các tế bào. So với các phương pháp khác, Thein vitro đầu
khảo nghiệm là đặc biệt thích hợp cho các nghiên cứu về tác động của tế bào-matrix và tế bào-tế bào tương tác trên di động, di cư tế bào bắt chước
trong vết thương healingin vivo và phù hợp với hình ảnh của các tế bào sống trong khi di chuyển để theo dõi nội bào sự kiện nếu muốn.
Bên cạnh đó theo dõi sự di cư của quần thể tế bào đồng nhất, phương pháp này cũng được sử dụng để đo lường sự di cư của cá nhân
các tế bào trong phần đầu của mẻ. Không tính đến thời gian cho thâm chuyển của các tế bào, trong vitroscratch assayper seusually
mất từ vài giờ đến qua đêm.
GIỚI THIỆU
Thein vitro đầu khảo nghiệm là một đơn giản và kinh tế
phương pháp để nghiên cứu tế bào migrationin vitro
1
. Phương pháp này dựa trên
sự quan sát rằng, sau khi tạo ra một khoảng cách nhân tạo mới, vì vậy được gọi là
'' đầu '', trên một lớp tế bào confluent, các tế bào trên các cạnh của các
khoảng cách vừa được tạo ra sẽ di chuyển về phía mở để đóng
' 'đầu' 'cho đến khi liên lạc di động tế bào mới được thành lập lại. Các
bước cơ bản liên quan đến việc tạo ra một '' đầu '' trên các tế bào đơn lớp,
chụp hình ảnh ở đầu và khoảng thời gian thường xuyên trong tế bào
di cư để đóng đầu, và so sánh các hình ảnh để
xác định tỷ lệ di cư tế bào.
Một trong những chính ưu điểm của phương pháp này đơn giản là nó
bắt chước một số di dân mức độ cellsin vivo.Forexample,
cắt bỏ một phần của nội mạc trong các mạch máu sẽ gây ra
sự di cư của các tế bào nội mô (ECs) vào khu vực núi trọc để đóng
vết thương
2
. Hơn nữa, mô hình di cư hoặc như
dân số kết nối lỏng lẻo (ví dụ, các nguyên bào sợi) hoặc như tấm
tế bào (ví dụ, biểu mô và ECs) cũng bắt chước các hành vi của các
tế bào trong migrationin vivo. Một ưu điểm khác của in vitro
đầu khảo nghiệm là phù hợp đặc biệt của mình để nghiên cứu các quy định về
di cư tế bào bằng cách tương tác với tế bào ma trận ngoại bào (ECM)
và tương tác tế bào-tế bào. Trong các phương pháp phổ biến khác như Boyden
xét ​​nghiệm buồng, chuẩn bị của các tế bào trong hệ thống treo trước khi
xét nghiệm sẽ phá vỡ tế bào-tế bào và tế bào tương tác-ECM. Ngoài ra,
trong ống nghiệm đầu khảo nghiệm cũng tương thích với kính hiển vi
bao gồm cả hình ảnh di động, cho phép phân tích các sự kiện truyền tín hiệu nội bào (ví dụ, bằng cách hình dung của protein huỳnh quang xanh (GFP) protein -tagged cho nội địa hóa dưới tế bào hoặc huỳnh quang cộng hưởng
truyền năng lượng cho protein- tương tác protein) trong quá trình chuyển động. Mặt khác, nó cũng có lẽ là phương pháp đơn giản nhất để
nghiên cứu di cư tế bào in vitro và chỉ sử dụng phổ biến và
nguồn cung cấp rẻ tiền được tìm thấy trong hầu hết các phòng thí nghiệm có khả năng tế bào
nuôi cấy.
Mặc dù nó được phát triển và phù hợp hơn để đo
di cư dân số của các tế bào, Thein vitro đầu khảo nghiệm đã
cũng được kết hợp với các kỹ thuật khác, chẳng hạn như tiêm
hoặc gen thâm chuyển, đánh giá hiệu quả của các biểu hiện của ngoại sinh
gen về di cư của các tế bào riêng lẻ
3-5
. Các con đường di chuyển của
tế bào riêng lẻ trong phần đầu của đầu được theo dõi với sự
trợ giúp của thời gian trôi kính hiển vi và phần mềm phân tích hình ảnh. Chụp một hình ảnh trong đầu của thí nghiệm với kính hiển vi huỳnh quang có thể đánh dấu các tế bào với biểu hiện của ngoại sinh
gen hoặc ức chế tuyến yên của gen nội sinh do sự can thiệp RNA
(ví dụ, bằng cách sử dụng một dấu GFP). Bằng cách so sánh các bài hát của các tế bào này
với xung quanh các tế bào kiểm soát theo các điều kiện thí nghiệm như nhau cho phép xác định vai trò của một gen đặc biệt trong các
quy định về di cư tế bào định hướng sử dụng các xét nghiệm.
Có một số nhược điểm và hạn chế của
trong vitroscratch khảo nghiệm so sánh với các phương pháp khác có sẵn. Nó
không thay thế các phương pháp cũng như thành lập các hóa hướng như vậy
là buồng khảo nghiệm Boyden, như không có độ dốc hóa học được thành lập.
Phải mất một thời gian tương đối dài để thực hiện hơn một số khác
phương pháp. Một đến hai ngày là cần thiết cho sự hình thành của tế bào
đơn lớp và sau đó 8-18 h cho di cư tế bào để đóng đầu.
ngoái, số lượng tương đối lớn các tế bào và hóa chất sẽ được yêu cầu
cho việc khảo nghiệm vì nó thường được thực hiện trong một nền văn hóa mô món ăn.
Do đó, nó không phải là một phương pháp được chọn nếu sự sẵn có của các tế bào
(ví dụ, các tế bào tiểu học chuyên ngành là khó để có được đủ
số tiền) hoặc các hóa chất (ví dụ như các chất đắt tiền) là hạn chế. Các
bảng sau đây tóm tắt so sánh về nhà trong ống nghiệm đầu
thử nghiệm với một số phương pháp khác. Mặc dù có những hạn chế của các
phương pháp, tổng thể, trong ống nghiệm đầu khảo nghiệm vẫn thường các phương pháp
lựa chọn để phân tích di cư tế bào trong một phòng thí nghiệm vì nó rất dễ dàng để
thiết lập, không yêu cầu bất kỳ thiết bị chuyên dụng và tất cả các vật liệu
cần thiết cho việc khảo nghiệm có sẵn trong bất kỳ phòng thí nghiệm mà thực hiện
nuôi cấy tế bào.
Trong giao thức này, các bước 1-9 mô tả các phương pháp cơ bản của
tinh trong ống nghiệm đầu khảo nghiệm để đo di cư của các quần thể tế bào.
Trong bước 10-13, phương pháp này được áp dụng để theo dõi di chuyển của tế bào riêng lẻ tại cạnh hàng đầu của mẻ. Sau đó là phù hợp để
nghiên cứu tác động của các sản phẩm gen đặc biệt trên di động khi
nó là khó khăn để đạt được hiệu quả cao thâm chuyển cho ngoại sinh
biểu hiện gen hay knockdown gen siRNA qua trung gian.
puor G gnihsilbu P eruta N 7 0 0 2 © natureprotocols / moc . phòng cấp cứu