Conclusions and future perspectives

Conclusions and future perspectives
Recent progress in techniques for the genetic modification of pigs facilitates the generation of tailored models for translational research. For the development of advanced preclinical animal models, target genes and mechanisms for the development of novel therapies are revealed by genome-wide association studies and pathophysiological investigations of human patient cohorts. In addition, forward and reverse genetics approaches in model organisms as well as cellular systems may contribute to the target discovery pipeline. Mouse models can be precisely designed or obtained from the large archive of mutants. Based on the findings in mouse models, large animal models such as genetically modified pigs can be designed for selected human diseases (Fig. 4). Further refinements of transgenic technology in pigs can be expected in the near future. These include inducible transgene expression [60], the Cre/loxP system for conditional transgenic modifications [61] and nonviral episomal expression systems that replicate autonomously in mammalian cells [62]. Zinc finger nuclease (ZFN) technology which facilitates sequence-specific double-strand breaks of DNA, has recently been successfully used in the rat [63], and will, in the very near future, also be used to mutate specific genes in other mammalian species including pigs. This approach does not even require the technically demanding SCNT, but should work via cytoplasmic injection of DNA or RNA coding for the respective ZFN into zygotes. While repair of double-strand breaks by nonhomologous end joining (NHEJ) frequently leads to mutations, ZFN technology is also expected to increase the rate of homologous recombination (HR) if a targeting vector is simultaneously introduced. Recently, attempts have been made to favor HR vs. NHEJ by transient downregulation of integral NHEJ proteins [64]. Furthermore, rAAV has been successfully used for efficient gene targeting in mammalian cells [65]. The refinement of techniques for the generation of tailored transgenic pigs is expected to widen the spectrum of potential applications. In addition to the disease areas covered by this article, future applications of genetically modified pig models may include cancer research [66] and regenerative medicine. Gene targeting will allow recapitulating causative mutations of human tumors in pig models, which can be used to investigate the multi-step process of tumorigenesis and to develop novel strategies for early diagnosis and therapy. In addition, pig models may be particularly important for regenerative medicine, since the “Guidelines for the Clinical Translation of Stem Cells” developed by the International Society for Stem Cell Research (http://www.isscr.org) recommend investigators to develop preclinical cell therapy protocols in small animal models, as well as in large animal models. These studies may involve allotransplantation of porcine stem cells in pig models (e.g., [67]). Importantly, recent studies described the derivation of porcine-induced pluripotent stem cells [68– 70], and protocols for the derivation and differentiation of porcine mesenchymal stem cells are also available [71]. Transgenic pigs expressing marker genes, such as the green fluorescent protein, ubiquitously or in specific tissues or cell types [72] will be important to monitor the safety and efficacy of cell therapies. Alternatively, human stem cells or their derivatives may be tested in pig models, which would requireimmunosuppressionorthedevelopmentofgenetically immunodeficient pigs. The plethora of potential applications of pig models require infrastructures which are able to generate, archive, and distribute pig models in an international framework. Furthermore, platforms and protocols for systematic phenotyping are required to fully exploit the potential of pig models for translational research.

Kết quả (Việt) 1:

Kết luận và quan điểm trong tương laiTại tiến bộ trong kỹ thuật cho sửa đổi di truyền của con lợn tạo điều kiện cho các thế hệ của mô hình phù hợp cho nghiên cứu translational. Cho sự phát triển của nâng cao các mô hình động vật preclinical, mục tiêu gen và các cơ chế cho sự phát triển của phương pháp điều trị tiểu thuyết được tiết lộ bởi toàn bộ gen Hiệp hội nghiên cứu và pathophysiological điều tra của con người bệnh nhân cohorts. Ngoài ra, phương pháp tiếp cận di truyền học chuyển tiếp và đảo ngược trong mô hình sinh vật cũng như hệ thống di động có thể đóng góp vào các đường ống dẫn phát hiện mục tiêu. Chuột mô hình có thể được thiết kế chính xác hoặc thu được từ các kho lưu trữ lớn của người đột biến. Dựa trên những phát hiện trong các mô hình chuột, mô hình động vật lớn chẳng hạn như biến đổi con lợn có thể được thiết kế cho lựa chọn của con người bệnh (hình 4). Các cải tiến hơn nữa của các công nghệ biến đổi gen trong con lợn có thể được dự kiến trong tương lai gần. Chúng bao gồm các biểu hiện inducible transgene [60], Hệ thống Cre/loxP cho sửa đổi biến đổi gen có điều kiện [61] và biểu hiện episomal nonviral hệ thống mà tái tạo autonomously trong tế bào động vật có vú [62]. Kẽm ngón tay nuclease (ZFN) công nghệ mà tạo điều kiện phá vỡ đôi sợi dành riêng cho trình tự DNA, có mới được sử dụng thành công trong các con chuột [63] và, trong tương lai rất gần, cũng sẽ được sử dụng để biến đổi gen cụ thể trong các loài động vật có vú khác bao gồm cả lợn. Cách tiếp cận này không thậm chí yêu cầu đòi hỏi kỹ thuật SCNT, nhưng nên làm việc thông qua các tế bào chất tiêm DNA hoặc RNA mã hóa cho ZFN tương ứng vào zygotes. Trong khi các sửa chữa của phá vỡ đôi sợi nonhomologous cuối tham gia (NHEJ) thường xuyên dẫn đến đột biến, ZFN công nghệ cũng được dự kiến để tăng tỷ lệ tương đồng gen (HR) nếu một vector nhắm mục tiêu cùng một lúc được giới thiệu. Gần đây, những nỗ lực đã được thực hiện để ưu tiên HR vs NHEJ bởi thoáng qua downregulation của tích phân NHEJ protein [64]. Hơn nữa, rAAV đã được sử dụng thành công cho hiệu quả gen nhắm mục tiêu trong các tế bào động vật có vú [65]. Sàng lọc của kỹ thuật cho các thế hệ của phù hợp biến đổi gen lợn dự kiến sẽ mở rộng phổ ứng dụng tiềm năng. Ngoài các khu vực bệnh được bảo hiểm bởi điều này, các ứng dụng trong tương lai của mô hình biến đổi con lợn có thể bao gồm nghiên cứu ung thư [66] và y học tái tạo. Gene nhắm mục tiêu sẽ cho phép recapitulating các đột biến gây bệnh của các khối u của con người trong mô hình con lợn, mà có thể được sử dụng để điều tra quá trình nhiều bước tumorigenesis và phát triển các chiến lược mới lạ cho chẩn đoán sớm và điều trị. Ngoài ra, lợn mô hình có thể đặc biệt quan trọng cho y học tái tạo, kể từ khi các "hướng dẫn cho the lâm sàng dịch của tế bào gốc" phát triển của Hiệp hội quốc tế cho nghiên cứu tế bào gốc (http://www.isscr.org) giới thiệu các nhà điều tra để phát triển preclinical di động giao thức trị liệu trong các mô hình động vật nhỏ, cũng như trong các mô hình động vật lớn. Các nghiên cứu này có thể bao gồm allotransplantation của tế bào gốc porcine ở lợn mô hình (ví dụ như, [67]). Quan trọng, nghiên cứu gần đây mô tả các derivation porcine-induced pluripotent tế bào gốc [68-70], và các giao thức cho lấy đạo hàm và sự khác biệt của tế bào gốc gặp porcine là cũng có sẵn [71]. Biến đổi gen con lợn thể hiện dấu hiệu gen, chẳng hạn như protein huỳnh quang màu xanh lá cây, ubiquitously hoặc trong cụ thể mô hoặc loại tế bào [72] sẽ là quan trọng để giám sát sự an toàn và hiệu quả của liệu pháp tế bào. Ngoài ra, tế bào gốc của con người hoặc dẫn xuất của họ có thể được kiểm tra trong mô hình con lợn, mà sẽ requireimmunosuppressionorthedevelopmentofgenetically immunodeficient lợn. Plethora của các ứng dụng tiềm năng của lợn mô hình yêu cầu cơ sở hạ tầng có thể tạo, lưu trữ, và phân phối các mô hình con lợn trong một khuôn khổ quốc tế. Hơn nữa, nền tảng và các giao thức cho hệ thống phenotyping được yêu cầu để khai thác đầy đủ tiềm năng của lợn mô hình cho nghiên cứu translational.

Kết quả (Việt) 2:

Kết luận và triển vọng tương lai
tiến bộ gần đây trong kỹ thuật cho việc sửa đổi di truyền của lợn tạo điều kiện cho các thế hệ của các mô hình phù hợp cho nghiên cứu tịnh. Đối với sự phát triển của các mô hình tiên tiến tiền lâm sàng động vật, gen mục tiêu và cơ chế cho sự phát triển của liệu pháp mới được tiết lộ bởi các nghiên cứu genome và điều tra sinh lý bệnh của bệnh nhân đoàn hệ của con người. Ngoài ra, về phía trước và di truyền ngược phương pháp tiếp cận trong các sinh vật mô hình cũng như các hệ thống di động có thể đóng góp vào việc phát hiện đường ống tiêu. Mô hình chuột có thể được thiết kế chính xác hoặc thu được từ các kho lưu trữ lớn các đột biến. Dựa trên những phát hiện trong các mô hình chuột, mô hình động vật lớn như con lợn biến đổi gen có thể được thiết kế cho các bệnh nhân được chọn (Hình. 4). Cải tiến hơn nữa của công nghệ chuyển gen ở lợn có thể được dự kiến trong tương lai gần. Chúng bao gồm các biểu hiện gen chuyển cảm ứng [60], hệ thống Cre / loxP cho sửa đổi có điều kiện chuyển gen [61] và hệ thống thể hiện episome nonviral là bản sao tự chủ trong các tế bào động vật có vú [62]. Kẽm ngón tay nuclease (ZFN) công nghệ đó tạo điều kiện vỡ hai sợi trình tự cụ thể của DNA, gần đây đã được sử dụng thành công ở chuột [63], và sẽ, trong tương lai rất gần, cũng có thể được sử dụng để biến đổi gene đặc biệt ở động vật có vú khác loài gồm lợn. Cách tiếp cận này thậm chí không yêu cầu khắt khe về kỹ thuật SCNT, nhưng nên làm việc thông qua tiêm tế bào chất của DNA hoặc RNA mã hóa cho các ZFN tương ứng thành hợp tử. Trong khi sửa chữa vỡ hai sợi vào cuối nonhomologous tham gia (NHEJ) thường dẫn đến đột biến, công nghệ ZFN cũng được dự kiến sẽ tăng tỷ lệ tái tổ hợp tương đồng (HR) nếu một vector được nhắm mục tiêu đồng thời giới thiệu. Gần đây, các nỗ lực đã được thực hiện để ủng hộ HR vs NHEJ bởi ức chế tuyến yên thoáng qua của protein NHEJ thể thiếu [64]. Hơn nữa, rAAV đã được sử dụng thành công cho gen có hiệu quả mục tiêu nhắm vào các tế bào động vật có vú [65]. Những cải tiến về kỹ thuật cho các thế hệ con lợn biến đổi gen phù hợp dự kiến sẽ mở rộng quang phổ của các ứng dụng tiềm năng. Ngoài các khu vực bệnh bao phủ bởi bài viết này, các ứng dụng tương lai của mô hình chăn nuôi lợn biến đổi gen có thể bao gồm nghiên cứu ung thư [66] và y học tái tạo. Hướng gene sẽ cho phép recapitulating đột biến gây bệnh của các khối u của con người trong các mô hình chăn nuôi lợn, có thể được sử dụng để điều tra quá trình gồm nhiều bước của khối u và để phát triển các chiến lược mới để chẩn đoán sớm và điều trị. Ngoài ra, các mô hình chăn nuôi lợn có thể đặc biệt quan trọng đối với y học tái tạo, kể từ khi "Hướng dẫn cho các dịch lâm sàng của tế bào gốc" được phát triển bởi Hiệp hội quốc tế về nghiên cứu tế bào gốc (http://www.isscr.org) đề nghị điều tra để phát triển tiền lâm sàng giao thức liệu pháp tế bào trong các mô hình động vật nhỏ, cũng như trong các mô hình động vật lớn. Những nghiên cứu này có thể liên quan allotransplantation của tế bào gốc lợn trong các mô hình chăn nuôi lợn (ví dụ, [67]). Quan trọng hơn, các nghiên cứu gần đây được mô tả nguồn gốc của tế bào lợn gây ra đa năng gốc [68- 70], và các giao thức cho nguồn gốc và biệt hóa của các tế bào gốc trung mô lợn cũng có sẵn [71]. Lợn biến đổi gen thể hiện các gen đánh dấu, chẳng hạn như các protein huỳnh quang màu xanh lá cây, hoặc ở khắp nơi trong các mô hoặc các loại tế bào cụ thể [72] sẽ rất quan trọng để theo dõi sự an toàn và hiệu quả của liệu pháp tế bào. Ngoài ra, các tế bào gốc của con người hoặc các dẫn xuất của chúng có thể được kiểm tra trong các mô hình chăn nuôi lợn, trong đó sẽ requireimmunosuppressionorthedevelopmentofgenetically lợn suy giảm miễn dịch. Sự thừa thãi của các ứng dụng tiềm năng của các mô hình chăn nuôi lợn đòi hỏi cơ sở hạ tầng mà có thể tạo ra, lưu trữ và phân phối các mô hình chăn nuôi lợn ở một khuôn khổ quốc tế. Hơn nữa, nền tảng và giao thức cho kiểu hình hệ thống được yêu cầu phải khai thác tối đa tiềm năng của các mô hình chăn nuôi lợn cho nghiên cứu tịnh.