Insight into the mode of DNA replic

Insight into the mode of DNA replication: the Meselson–Stahl experiment
The mode of replication was determined in 1958 by Matthew Meselson and Franklin W. Stahl. They
designed an experiment to distinguish between semiconservative, conservative, and dispersive replication.
First, they needed a way to tell original DNA from newly synthesized DNA. To this end, they grew
Escherichia coliin medium containing
15
N, a heavy isotope of nitrogen. 15
N contains one more neutron than
the naturally occurring
14
N. Unlike radioisotopes, 15
N is stable and is not radioactive. After growing several
generations of bacteria in the
15
N medium, the DNA of E. colibecame denser because the nitrogenous bases
had incorporated the heavy isotope.
The density of the strands was determined using a technique known as density-gradient centrifugation.
A solution of cesium chloride (CsCl) – a heavy metal salt – containing the DNA samples is spun in an
ultracentrifuge at high speed for several hours. Eventually, an equilibrium between centrifugal force and
diffusion occurs, such that a gradient forms with a high concentration of CsCl at the bottom of the tube
and a low concentration at the top. DNA forms a band in the tube at the point where its density is the same
as that of the CsCl. The bands are detected by observing the tubes with ultraviolet light at a wavelength of
260 nm, in which DNA absorbs strongly.
After many generations, Meselson and Stahl transferred the bacteria with heavy (
15N) DNA to a medium
containing only
14
N. What they found was that DNA replicated in the 14
N medium was intermediate in
density between light (
14
N) and heavy (15
N). In the next generation, only DNA of intermediate and light
density was present. The results shown in Fig. 6.2 are consistent only with semiconservative replication. If
replication had been conservative, there would have been two bands at the first generation of replication
– an original
15
N (heavy) double helix and a new 14
N (light) double helix. Additionally, throughout the
experiment, the original DNA would have continued to show up as a
15
N (heavy) band. If the method of
replication had been dispersive, the result would have been various multiple-banded patterns, depending on
the degree of dispersiveness.
Insight into the mode of DNA replication: visualization of replicating bacterial DNA
The semiconservative method of replication was visually verified by J. Cairns in 1963 using the technique
of autoradiography. This technique makes use of the fact that radioactive emissions expose photographic
film. The visible silver grains on the film can then be counted to provide an estimate of the quantity of
radioactive material present. Cairns grew E. coliin a medium containing the base thymine labeled with
tritium, a radioactive isotope of hydrogen (
3
H). The DNA was then extracted from the bacteria and
autoradiographs were made. By analysis of DNA at different time points during replication (it takes
approximately 42 minutes to replicate the entire genome), Cairns showed that replication of the circular
Figure 6.2 (opposite) The Meselson and Stahl experiment to determine the mode of DNA
replication.Meselson and Stahl shifted 15
N-labeled E. coli cells to a
14
N medium for several generations, and then
subjected the bacterial DNA to CsCl gradient ultracentrifugation. The bands after centrifugation come about from
semiconservative replication of
15
N DNA (blue) replicating in a 14
N medium (green). (Inset) (A) Photographs of the
centrifuge tubes under ultraviolet illumination. The dark bands correspond to heavy
15
N-labeled DNA (right) and light
14
N-labeled DNA (left). A band of intermediate density was also observed between these two and is the predominant
band observed at 1.0 and 1.1 generations. This band corresponds to double-stranded DNA molecules in which one
strand is labeled with
15
N, and the other with 14
N. After 1.9 generations, there were approximately equal quantities of
the
15
N/14
N band and the 14
N band. After three or four generations, there was a progressive depletion of the 15
N/14N
band and a corresponding increase in the
14
N band, as expected for semiconservative replication. (B) Densitometer
tracings of the bands in panel (A), which can be used to quantify the amount of DNA in each band. (Reprinted by
permission of Matthew Meselson from: Meselson, M., Stahl, F. 1958. The replication of DNA in Escherichia coli.
Proceedings of the National Academy of Sciences USA44:671–682.)
Chapter 6 112
genome was bidirectional. The two strands in the double helix separate at an origin of replication, exposing
bases to form a cytologically visible replication “eye” or “bubble” that contains two replication forks. The
two replication forks proceed in opposite directions around the circle (Fig. 6.3). During replication, the
chromosome looks like the Greek letter theta (θ) by electron microscopy. Replication intermediates are thus
termed “theta structures.” Cairns’ findings have subsequently been verified by both autoradiographic and
genetic analysis.
6.3DNA synthesis occurs from 5′ to 3′
Before exploring the complexity of eukaryotic DNA replication, some basic principles common to most
DNA replication pathways will be described. We now know that during semiconservative replication, the
new strand of DNA is synthesized from 5′ to 3′. Nucleotides are added one at a time to the 3′ hydroxyl
end of the DNA chain, forming new phosphodiester bonds. Deoxynucleoside 5′ triphosphates (dNTPs) are
the building blocks. The terminal two phosphates are lost in the reaction, making the reaction essentially
irreversible (Fig. 6.4). The choice of nucleotide to add to the chain is determined by complementary base
pairing with the template strand. Details of the exact mechanism for how this process occurs varies for cells,
organelle genomes, plasmids, and viruses. The mode of replication depends, in part, on whether the genome
is circular or linear. The most common mode of replication is semidiscontinuous DNA replication. Other
mechanisms include continuous DNA replication and rolling circle replication.
6.4DNA polymerases are the enzymes that catalyze DNA
synthesis
Enzymes that polymerize nucleotides into a growing strand of DNA are called DNA polymerases. Over the
past few years, the number of known DNA polymerases in both prokaryotes and eukaryotes has grown
tremendously. Bacteria have five different DNA polymerases (Focus box 6.1), whereas mammalian cells are
now known to contain at least 14 distinct DNA polymerases (Table 6.1). In eukaryotes, three different DNA
polymerases are involved in chromosomal DNA replication: DNA polymerase α, DNA polymerase δ, and
DNA polymerase ε. DNA polymerase γis used strictly for mitochondrial DNA (mtDNA) replication. These
four enzymes are referred to as the replicative polymerases, to distinguish them from the remaining polymerases
that are involved in repair processes. The repair polymerases will be discussed in detail in Chapter 7.
All the known DNA polymerases can only add nucleotides in the 5′→3′ direction. In other words, a
DNA polymerase can catalyze the formation of a phosphodiester bond between the first 5′-phosphate group
of a new dNTP and the 3′-hydroxyl group of the last nucleotide in the newly synthesized strand (Fig. 6.4).
But the DNA polymerases cannot act in the opposite orientation to create a phosphodiester bond with the
5′-phosphate of a nucleotide already in the DNA and the 3′-hydroxyl of a new dNTP.
Another feature of DNA polymerases is that they cannot initiate DNA synthesis de novo(Latin for “from
the beginning”). With the exception of DNA polymerase α(the polymerase involved in primer synthesis),
they all require a “primer.” The primer is usually a short RNA chain which must be synthesized on the
DNA template before DNA polymerase can start elongation of a new DNA chain (primers are discussed in
detail below). DNA polymerases recognize and bind to the free 3′-hydroxyl group at the end of the primer.
Once primed, polymerases can extend pre-existing chains rapidly and with high fidelity. Bacterial and
mammalian DNA polymerases can add ~500 and ~50 nt/second, respectively.
6.5Semidiscontinuous DNA replication
The major form of replication that occurs in nuclear DNA (eukaryotes), some viruses (e.g. the papovavirus
SV40), and bacteria is called semidiscontinuous DNA replication. Fundamental features are conserved from
E. colito humans. The differences are in the details; that is, in the specific enzymes and other proteins that
are involved in the process (Table 6.2).

Kết quả (Việt) 1:

Cái nhìn sâu sắc vào chế độ sao chép DNA: thử nghiệm Meselson-Stahl
chế độ bản sao đã được xác định năm 1958 bởi Matthew Meselson và Franklin W. Stahl. Họ
thiết kế một thử nghiệm để phân biệt giữa semiconservative, bảo thủ và hòa tan trong nhân rộng.
lần đầu tiên, họ cần một cách để cho biết bản gốc DNA từ mới được tổng hợp DNA. Để kết thúc này, họ đã tăng trưởng
Escherichia coliin vừa có
15
N, một đồng vị nặng của nitơ. 15
N có một neutron thêm hơn
tự nhiên
14
N. Không giống như các đồng vị phóng xạ, 15
N là ổn định và không phải là phóng xạ. Sau khi phát triển một số
thế hệ của các vi khuẩn trong các
15
N vừa, DNA E. colibecame dày đặc hơn vì các căn cứ nitrogenous
đã kết hợp đồng vị nặng.
Mật độ của các sợi đã được xác định bằng cách sử dụng một kỹ thuật được gọi là mật độ gradient số.
Một giải pháp của cesium clorua (CsCl)-một muối kim loại nặng-có các mẫu DNA spun trong một
ultracentrifuge ở tốc độ cao trong nhiều giờ. Cuối cùng, một trạng thái cân bằng giữa lực ly tâm và
khuếch tán xảy ra, như vậy mà một gradient tạo thành với nồng độ cao của CsCl ở phía dưới của ống
và nồng độ thấp ở phía trên. DNA tạo thành một ban nhạc trong ống tại điểm nơi mật độ của nó là như nhau
như là của CsCl. Các ban nhạc được phát hiện bằng cách quan sát các ống với tia cực tím ánh sáng tại bước sóng của
260 nm, trong đó DNA hấp thụ mạnh mẽ.
sau nhiều thế hệ, Meselson và Stahl chuyển vi khuẩn với nặng (
15N) DNA để một phương tiện
có chứa chỉ
14
N. Những gì họ thấy là rằng DNA nhân rộng trong 14
N vừa là trung gian trong
mật độ giữa ánh sáng (
14
N) và nặng (15
N). Trong thế hệ tiếp theo, chỉ có DNA của trung bình và ánh sáng
mật độ là hiện tại. Các kết quả hiển thị trong hình 6.2 là phù hợp chỉ với semiconservative nhân rộng. Nếu
sao chép được bảo thủ, nào đã có hai ban nhạc lúc thế hệ đầu tiên của sao chép
-một bản gốc
15
N (nặng) xoắn kép và một mới 14
xoắn kép N (ánh sáng). Ngoài ra, trong suốt các
thử nghiệm, DNA ban đầu đã có tiếp tục để xuất hiện như một
15
N (nặng) ban nhạc. Nếu phương pháp
nhân rộng đã được hòa tan trong, kết quả sẽ có là dải nhiều mô hình khác nhau, tùy thuộc vào
mức độ dispersiveness.
cái nhìn sâu sắc vào chế độ sao chép DNA: hình dung của sao chép vi khuẩn DNA
semiconservative phương pháp sao chép trực quan đã được xác minh bởi J. Cairns 1963 việc sử dụng các kỹ thuật
của autoradiography. Kỹ thuật này làm cho việc sử dụng một thực tế rằng phóng xạ phát thải lộ hình ảnh
phim. Các hạt bạc có thể nhìn thấy bộ phim sau đó có thể được tính để cung cấp một ước tính số lượng của
chất phóng xạ hiện nay. Cairns lớn E. coliin một phương tiện có chứa cơ sở thymine nhãn
triti, một đồng vị phóng xạ của hiđrô (
3
H). DNA sau đó được chiết xuất từ các vi khuẩn và
autoradiographs đã được thực hiện. Bằng cách phân tích DNA tại điểm thời gian khác nhau trong bản sao (mất
khoảng 42 phút để nhân rộng toàn bộ bộ gen), Cairns cho thấy rằng bản sao của vòng tròn
hình 6.2 (đối diện) The Meselson và Stahl thử nghiệm để xác định các chế độ của DNA
nhân rộng.Meselson và Stahl chuyển 15
N có nhãn E. coli tế bào để một
14
N phương tiện cho nhiều thế hệ, và sau đó
chịu DNA vi khuẩn CsCl gradient ultracentrifugation. Các ban nhạc sau khi số trở về từ
semiconservative bản sao của
15
N DNA (màu xanh) sao chép trong 14
N vừa (màu xanh lá cây). (Ghép) (A) hình ảnh của các
máy ly tâm ống dưới tia cực tím chiếu sáng. Các ban nhạc tối tương ứng với nặng
15
N có nhãn DNA (bên phải) và ánh sáng
14
N có nhãn DNA (bên trái). Một nhóm người dân với mật độ trung gian cũng quan sát thấy giữa hai và là chủ yếu các
ban nhạc quan sát tại 1.0 and 1.1 thế hệ. Ban nhạc này tương ứng với phân tử DNA đôi-stranded trong đó một
strand được dán nhãn với
15
N, và khác với 14
N. Sau khi thế hệ 1,9, đã có khoảng tương đương với số lượng của
các
15
N/14
N band và 14
N band. Sau khi ba hoặc bốn thế hệ, đã có một sự suy giảm tiến bộ của 15
N/14N
ban nhạc và tương ứng một tăng trong các
14
N band, như mong đợi để nhân rộng semiconservative. (B) densitometer
tracings của ban nhạc trong bảng điều khiển (A), mà có thể được sử dụng để định lượng số DNA trong mỗi ban nhạc. (Reprinted bởi
sự cho phép của Matthew Meselson từ: Meselson, M., Stahl, F. năm 1958. Các bản sao của DNA trong Escherichia coli.
Thủ tục tố tụng của Viện Hàn lâm khoa học quốc gia USA44:671-682.)
Chương 6 112
gen là hai chiều. Hai sợi trong xoắn kép riêng biệt tại một nguồn gốc của nhân rộng, để lộ
căn cứ để tạo thành một cytologically có thể nhìn thấy nhân rộng "mắt" hay "bong bóng" có chứa hai bản sao forks. Các
hai nhân rộng forks tiến hành ở hướng đối diện xung quanh vòng tròn (hình 6.3). Trong bản sao, các
nhiễm sắc thể trông giống như chữ cái Hy Lạp theta (i) bằng kính hiển vi điện tử. Sao chép trung gian là do đó
gọi là "cấu trúc theta." Cairns' phát hiện sau đó đã được xác minh bởi cả hai autoradiographic và
di truyền phân tích.
6.3DNA tổng hợp diễn ra từ 5 ' 3 '
trước khi khám phá sự phức tạp của sinh vật nhân chuẩn DNA nhân rộng, một số nguyên tắc cơ bản chung cho hầu hết
DNA nhân rộng con đường sẽ được mô tả. Bây giờ chúng ta biết rằng trong bản sao semiconservative, các
mới sợi DNA được tổng hợp từ 5 ' 3 '. Nucleotide được thêm vào một lúc một thời gian 3 ' hiđrôxyl
cuối chuỗi ADN, tạo mới phosphodiester trái phiếu. Deoxynucleoside 5 ' triphosphates (dNTPs)
các khối xây dựng. Phốt phát hai thiết bị đầu cuối bị mất trong phản ứng, làm cho phản ứng cơ bản
không thể đảo ngược (hình 6.4). Sự lựa chọn của nucleotide để thêm vào chuỗi được xác định bởi cơ sở bổ sung
ghép nối với mẫu strand. Các chi tiết của cơ chế chính xác cho tiến trình này xảy ra như thế nào khác nhau cho các tế bào,
organelle bộ gen, plasmid, và vi rút. Chế độ bản sao phụ thuộc, một phần, về việc có bộ gen
là hình tròn hoặc tuyến tính. Chế độ phổ biến nhất của sao chép là semidiscontinuous DNA nhân rộng. Khác
cơ chế bao gồm liên tục DNA nhân rộng và nhân rộng vòng tròn cán.
6.4DNA polymerase là các enzyme xúc tác DNA
tổng hợp
enzym polymerize nucleotide vào một chuỗi ngày càng tăng của DNA được gọi là DNA polymerase. Trong các
trong quá khứ vài năm, số lượng được biết đến DNA polymerase trong cả hai sơ và sinh vật nhân chuẩn đã phát triển
rất nhiều. Vi khuẩn có năm khác nhau DNA polymerase (tập trung hộp 6.1), trong khi các tế bào động vật có vú là
bây giờ biết là có chứa ít 14 khác biệt DNA polymerase (bảng 6.1). Trong sinh vật nhân chuẩn, ba khác nhau DNA
polymerase có liên quan trong nhiễm sắc thể DNA nhân rộng: DNA polymerase α, DNA polymerase δ, và
DNA polymerase ε. DNA polymerase γis sử dụng nghiêm chỉnh cho mitochondrial DNA (mtDNA) sao chép. Những
bốn enzyme được gọi là replicative polymerase, để phân biệt chúng từ polymerase còn lại
mà có liên quan trong quá trình sửa chữa. Sửa chữa polymerase sẽ được thảo luận chi tiết trong chương 7.
Tất cả các ADN polymerase nổi tiếng chỉ có thể thêm nucleotide theo hướng 5′→3′. Nói cách khác, một
DNA polymerase có thể xúc tác sự hình thành của một trái phiếu phosphodiester giữa 5 '-phosphate nhóm đầu tiên
của một dNTP mới và nhóm chức hiđrôxyl 3 ' cuối nucleotide trong sợi tổng hợp mới (hình 6.4).
Nhưng các ADN polymerase không thể hành động theo định hướng đối diện để tạo ra một trái phiếu phosphodiester với các
5 '-phosphate của một nucleotide đã có trong DNA và 3 '-hydroxyl của một dNTP mới.
một tính năng của DNA polymerase là rằng họ không thể bắt đầu DNA tổng hợp de novo (tiếng Latin cho "từ
đầu"). Ngoại trừ DNA polymerase α (polymerase tham gia vào mồi tổng hợp),
họ tất cả yêu cầu một mồi"." Mồi thường là một chuỗi RNA ngắn mà phải được tổng hợp trên các
DNA mẫu trước khi DNA polymerase có thể bắt đầu kéo dài một chuỗi DNA mới (chất nền, mồi được thảo luận trong
chi tiết dưới đây). DNA polymerase nhận ra và liên kết với các nhóm chức hiđrôxyl 3 ' miễn phí vào cuối của mồi.
khi sơn lót, polymerase có thể mở rộng dây chuyền sẵn nhanh chóng và với độ trung thực cao. Vi khuẩn và
động vật có vú DNA polymerase có thể thêm ~ 500 và ~ 50 nt/thứ hai, tương ứng.
6.5Semidiscontinuous sao chép DNA
các hình thức chính của nhân bản xảy ra trong ADN hạt nhân (sinh vật nhân chuẩn), một số virus (ví dụ như papovavirus
SV40), và vi khuẩn được gọi là semidiscontinuous DNA nhân rộng. Tính năng cơ bản được bảo tồn từ
E. colito con người. Sự khác biệt là trong các chi tiết; Đó là trong các enzym cụ thể và các protein khác mà
đang tham gia vào quá trình (bảng 6.2).

Kết quả (Việt) 2:

Cái nhìn sâu sắc vào chế độ sao chép DNA: thí nghiệm Meselson-Stahl
Các chế độ sao chép đã được xác định vào năm 1958 bởi Matthew Meselson và Franklin W. Stahl. Họ
thiết kế một thí nghiệm để phân biệt giữa nhân rộng semiconservative, bảo thủ, và phân tán.
Đầu tiên, họ cần một cách để nói với DNA gốc từ DNA mới được tổng hợp. Để kết thúc này, họ đã tăng trưởng
trung bình Escherichia coliin chứa
15
N, một đồng vị nặng của nitơ. 15
N chứa một neutron hơn
các tự nhiên
14
N. Không giống như các đồng vị phóng xạ, 15
N là ổn định và không phải là phóng xạ. Sau khi phát triển nhiều
thế hệ của vi khuẩn trong
15
N trung bình, DNA của E. colibecame dày đặc hơn bởi vì các căn cứ đạm
đã kết hợp các đồng vị nặng.
Mật độ của sợi được xác định bằng cách sử dụng một kỹ thuật được gọi là mật độ gradient ly tâm.
Một giải pháp của xêzi clorua (CsCl) - một muối kim loại nặng - có chứa các mẫu DNA được quay trong một
ultracentrifuge ở tốc độ cao trong vài giờ. Cuối cùng, một trạng thái cân bằng giữa lực ly tâm và
khuếch tán xảy ra, như vậy là một hình thức gradient với một nồng độ cao của CsCl ở dưới cùng của ống
và một nồng độ thấp ở đầu trang. DNA tạo thành một ban nhạc trong ống tại điểm mà mật độ của nó cũng giống
như của CsCl. Các ban nhạc được phát hiện bằng cách quan sát các ống với ánh sáng tử ngoại ở bước sóng
260 nm, trong đó DNA hấp thụ mạnh.
Sau nhiều thế hệ, Meselson và Stahl chuyển vi khuẩn với nặng (
15N) DNA sang môi trường
chỉ chứa
14
N. Những gì họ thấy được rằng DNA nhân rộng trong 14
trung bình N là trung gian trong
mật độ giữa ánh sáng (
14
N) và nặng (15
N). Trong thế hệ tiếp theo, chỉ có DNA của trung gian và ánh sáng
mật độ đã có mặt. Kết quả thể hiện trong hình. 6.2 phù hợp với chỉ sao chép semiconservative. Nếu
nhân rộng đã được bảo thủ, thì sẽ có hai ban nhạc ở thế hệ đầu tiên của bản sao
- một bản gốc
15
N (nặng) xoắn kép và 14 mới
N (ánh sáng) xoắn kép. Ngoài ra, trong suốt
thí nghiệm, DNA ban đầu sẽ tiếp tục hiển thị như là một
15
(nặng) ban nhạc N. Nếu phương pháp
nhân bản đã được phân tán, kết quả sẽ là khác nhau mô hình nhiều-dải, tùy thuộc vào
mức độ dispersiveness.
Insight vào phương thức sao chép DNA: trực quan của sao chép DNA của vi khuẩn
Phương pháp semiconservative sao chép đã được xác nhận trực quan của J . Cairns vào năm 1963 bằng cách sử dụng kỹ thuật
của autoradiography. Kỹ thuật này làm cho việc sử dụng thực tế là lượng khí thải phóng xạ tiếp xúc với nhiếp ảnh
phim. Các hạt bạc có thể nhìn thấy trên các bộ phim sau đó có thể được tính để cung cấp một ước tính của số lượng
hiện vật liệu phóng xạ. Cairns lớn E. coliin một phương tiện có chứa các thymine cơ sở dán nhãn với
tritium, một đồng vị phóng xạ của hydro (
3
H). DNA sau đó được chiết xuất từ vi khuẩn và
autoradiographs đã được thực hiện. Bằng việc phân tích ADN ở những thời điểm khác nhau trong quá trình sao chép (phải mất
khoảng 42 phút để nhân rộng toàn bộ bộ gen), Cairns cho thấy bản sao của thông tư
Hình 6.2 (đối diện) Các Meselson và Stahl thử nghiệm để xác định phương thức DNA
replication.Meselson và Stahl chuyển 15
N-dán nhãn các tế bào vi khuẩn E. coli để một
14
trung bình N cho nhiều thế hệ, và sau đó
đã đưa các DNA của vi khuẩn để CsCl dốc siêu ly tâm. Các ban nhạc sau khi ly tâm xảy ra từ
nhân rộng semiconservative của
15
N DNA (màu xanh) sao chép trong một 14
N trung bình (xanh lá cây). (Inset) (A) Hình ảnh của
ống ly tâm dưới ánh sáng cực tím. Các ban nhạc tối tương ứng với nặng
15
N-dán nhãn DNA (phải) và sáng
14
N-dán nhãn DNA (trái). Một ban nhạc của mật độ trung cấp cũng được quan sát giữa hai và là chiếm ưu thế
băng quan sát thấy ở 1.0 và 1.1 thế hệ. Ban nhạc này tương ứng với các phân tử DNA sợi kép trong đó một
sợi được dán nhãn với
15
N, và khác với 14
N. Sau 1,9 thế hệ, đã có số lượng xấp xỉ bằng của
các
15
N/14
N ban nhạc và 14
ban nhạc N. Sau ba bốn thế hệ, đã có một sự suy giảm tiến bộ của 15
N/14N
ban nhạc và một sự gia tăng tương ứng trong
14
ban nhạc N, như mong đợi cho nhân rộng semiconservative. (B) đo mật độ
tracings trong những ban nhạc trong bảng (A), có thể được sử dụng để định lượng DNA trong mỗi băng tần. (In lại bởi
sự cho phép của Matthew Meselson từ:.. Meselson, M., Stahl, F. 1958 sao chép DNA trong Escherichia coli
. Kỷ yếu của Viện hàn lâm Khoa học USA44 :671-682)
Chương 6 112
gen là hai chiều. Hai sợi trong chuỗi xoắn kép tách tại nguồn gốc của nhân rộng, để lộ
cơ sở để tạo thành một bản sao cytologically có thể nhìn thấy "mắt" hay "bong bóng" có chứa hai nhánh nhân rộng. Các
hai nhánh nhân rộng tiến hành theo hướng ngược nhau xung quanh vòng tròn (Hình 6.3). Khi sao chép, các
nhiễm sắc thể trông giống như thư theta Hy Lạp (θ) bằng kính hiển vi điện tử. Do đó trung gian nhân rộng được
gọi là "cấu trúc theta." Cairns 'phát hiện sau đó đã được xác minh bởi cả hai autoradiographic và
phân tích di truyền.
6.3DNA tổng hợp xảy ra từ 5 'đến 3'
Trước khi khám phá sự phức tạp của sự sao chép DNA nhân điển hình, một số nguyên tắc cơ bản chung cho hầu hết
DNA con đường sao chép sẽ được mô tả. Chúng ta biết rằng khi sao chép semiconservative, các
sợi ADN mới được tổng hợp từ 5 'đến 3'. Nucleotide được thêm một lúc để hydroxyl 3 '
cuối của chuỗi DNA, tạo thành cầu nối phosphodiester mới. Triphosphate Deoxynucleoside 5 '(dNTP) là
các khối xây dựng. Thiết bị đầu cuối hai phốt bị mất trong phản ứng, làm cho phản ứng về cơ bản
không thể đảo ngược (Hình 6.4). Sự lựa chọn của nucleotide để thêm vào các chuỗi được xác định bởi bổ sung cơ sở
ghép nối với mạch khuôn. Chi tiết về các cơ chế chính xác cho quá trình này xảy ra như thế nào thay đổi cho các tế bào,
bộ gen bào quan, plasmid, và vi rút. Phương thức nhân rộng phụ thuộc một phần vào việc liệu bộ gen
là tròn hoặc tuyến tính. Chế độ phổ biến nhất của sao chép là sao chép DNA semidiscontinuous. Khác
bao gồm cơ chế sao chép DNA liên tục và nhân rộng vòng tròn lăn.
6.4DNA polymerase là enzyme xúc tác DNA
tổng hợp
Enzyme polymerize nucleotide vào một sợi ngày càng tăng của DNA được gọi là DNA polymerase. Trong
vài năm qua, số lượng các polymerase DNA được biết đến trong cả hai sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn đã phát triển
rất nhiều. Vi khuẩn có năm polymerase DNA khác nhau (hộp Focus 6.1), trong khi các tế bào động vật có vú được
bây giờ biết đến có chứa ít nhất 14 polymerase DNA khác nhau (Bảng 6.1). Trong sinh vật nhân chuẩn, ba DNA khác nhau
polymerase có liên quan đến nhiễm sắc thể sao chép DNA: DNA polymerase α, DNA polymerase δ, và
DNA polymerase ε. Γis DNA polymerase sử dụng đúng cho ty lạp thể DNA (mtDNA) nhân rộng. Những
bốn enzyme được gọi là polymerase nhân lên, để phân biệt với các polymerase còn lại
có liên quan đến quá trình sửa chữa. Các polymerase sửa chữa sẽ được thảo luận chi tiết trong Chương 7.
Tất cả các polymerase DNA chỉ được biết đến có thể thêm nucleotide trong 5 '→ 3' hướng. Nói cách khác, một
DNA polymerase có thể xúc tác cho sự hình thành của một trái phiếu phosphodiester giữa nhóm 5'-phosphate đầu tiên
của một dNTP mới và nhóm 3'-hydroxyl của nucleotide cuối cùng trong mạch mới tổng hợp (Hình 6.4).
Nhưng các polymerase DNA không thể hành động theo hướng ngược lại để tạo ra một trái phiếu phosphodiester với
5'-phosphate của một nucleotide đã có trong DNA và 3'-hydroxyl của một dNTP mới.
Một tính năng của polymerase DNA là họ không có thể bắt đầu tổng hợp DNA de novo (tiếng Latinh có nghĩa "từ
đầu "). Với ngoại lệ của DNA polymerase α (polymerase tham gia tổng hợp mồi),
tất cả họ đều yêu cầu một "mồi". Lớp sơn lót thường là một chuỗi RNA ngắn mà phải được tổng hợp trên các
mẫu DNA trước khi DNA polymerase có thể bắt đầu kéo dài của một DNA mới chuỗi (mồi được thảo luận trong
chi tiết dưới đây). DNA polymerase nhận biết và liên kết với các nhóm 3'-hydroxyl miễn phí vào cuối mồi.
Sau khi sơn lót, có thể mở rộng chuỗi polymerase từ trước nhanh chóng và với độ trung thực cao. Vi khuẩn và
ADN polymerase động vật có vú có thể thêm ~ 500 ~ 50 nt / giây, tương ứng.
sao chép DNA 6.5Semidiscontinuous
Các hình thức chủ yếu sao chép xảy ra trong DNA hạt nhân (sinh vật nhân chuẩn), một số virus (ví dụ như papovavirus
SV40), và vi khuẩn được gọi là semidiscontinuous sao chép DNA. Tính năng cơ bản được bảo tồn từ
E. con người colito. Sự khác biệt là trong các chi tiết; có nghĩa là, trong các enzyme cụ thể và các protein khác
tham gia vào quá trình (Bảng 6.2).