2. Starch granule degrading enzymes

2. Starch granule degrading enzymes
Starch’s semi-crystalline nature, an ungelatinised starch granule is digested much more slowly by starch hydrolysing enzymes than a gelatinized granule or a starch solution. During hydrolysis a range of different morphologies may be observed, which range from pitting of small holes, shell formation, and surface erosion. The mode of enzymatic degradation is dependent both on the
Enzymatic treatment at sub-gelatinization temperature led to porous starch. Porous starch is attracting very much attention for its absorption and shielding ability in many food applications.
Highlight :
• α-amylase or amyloglucosidase action on corn starch was studied
• Pasting and thermal properties of porous starch depended on the enzyme used
• Porous starch was more susceptible to enzymatic digestion
Using enzyme: fungal α-amylase (AM) or amyloglucosidase (AMG)
α-Amylase can hydrolyze the (1→4) α-glucosidic bonds of starch in an endo-action. Hydrolysis occurs in a random fashion at any (1→4)-linkage within the starch chain to rapidly reduce the molecular size of starch and the viscosity of the starch solution during pasting.
Amyloglucosidase is an exo-acting enzyme that catalyzes the hydrolysis of both α-D-(1→4) and α-D-(1→6)-linkages from the non-reducing ends of the starch chain. Numerous researchers have investigated enzymatic hydrolysis of starches from cereals, roots, tubers, and legumes in terms of enzyme adsorption, action pattern, extent of hydrolysis, degree of crystallinity and hydrolysis products

Fig. Potato starch granules before (left) and after degradation by the amylases from Paenibacillus granivorans (middle) and Microbaterium aureum (right). (A5)
• Method
Method 1: Preliminary assays were carried out for optimizing enzymatic reactions (starch quantity and pH), and pH 4.0 was selected for AMG reaction and pH 6.0 in the case of AM modification. The quantity of enzymes was based on previous experiments, where the amount of enzyme required to hydrolyze 50% of the starch (15%, w/v) at 95ºC for 10 min was selected.
Starch (5.0 g) was suspended in 25 mL of 20mM NaH2PO4 buffer at pH 6.0 or in sodium acetate buffer at pH 4.0, those starch samples were referred as control-6 or control-4, respectively. For obtaining the enzymatic treated starches, enzymes (4 U of AMG /g starch and 5 U of AM /g starch) were added to the starch suspension. Samples were kept in a shaking water bath (50 rpm) at 50 ºC for 24 hours. Then, 50 mL of water were added and suspensions were homogenized. Samples were centrifuged for 15 min at 7,000×g and 4 ºC. Starches were washed again and centrifuged at the same conditions as before. Supernatants were pooled together and boiled in a water bath for 10 min to inactivate the enzymes before any further analyses (hydration properties and iodine binding values). Sediments containing starch were freeze-dried and kept at -25ºC for further thermal, biochemical and microstructural analyses. Four batches were prepared for each treatment (A2)
Method 2: Enzyme modification of starch was achieved using the enzyme α -amylase (Porcelain pancreatic amylase). 40% starch slurry was prepared by adding 40gm of starch to 100ml of distilled water, and enzyme (100µl) was added. The samples were allowed to stand at room temperature for 6 h. The flasks were then kept in the incubator at 50oC for 3h. After incubation, the supernatant was decanted and the starch was filtered and dried in the oven at 500 C. (A31)
3. Starch transferases
α 1,4-Glucanotransferases catalyse the cleavage of α-1,4 glucosidic bonds and the transfer of the newly formed reducing end group (donor) to a non-reducing saccharide unit (acceptor) with the formation of a new α -1,4 glucosidic bond. Donor and acceptor may originate from the same type of molecule or from different types of molecules. Several action patterns may be distinguished. Firstly, a single low molar mass maltooligosaccharide molecule may act both as donor and acceptor. In this case, cyclic saccharides are formed. Familiar examples are the cyclodextrins (CDs) with 6, 7, or 8 glucose units in the ring, which are formed by cyclodextrin glucosyltransferase. The net result of this type of activity is a decrease in the average molar mass. CDs are prepared by incubating a starch liquefact of DE < 10 with CGT-ase from Bacillus macerans (Riisgaard, 1990) or from thermostable microorganisms like Thermoanaerobacter species (Starnes, 1990). By addition of a complexing solvent, a crystalline inclusion complex is formed that can be separated from the mother liquor and refined by redissolution in water and recrystallisation. In a non-solvent process, the linear malto-oligosaccharides are degraded by amylolysis and cyclodextrin is recovered by partial evaporation and crystallisation. Like amylose, CDs have the ability to form crystalline complexes with a number of inclusion compounds. CDs have been widely explored as drug and flavour carriers (Szejtli, 1998). A novel development of randomly methylated α -CD is its use as an aid in emulsion polymerisation, e.g. in the surfactant-free production of polystyrene and polymethylmethacrylate latex particles in aqueous media (Storsberg et al., 2003). A different situation arises when the donor is transferred either to a different acceptor molecule or to a different side chain on the same molecule, e.g., in amylopectin. An interesting example is the so-called disproportioning enzyme or D-enzyme, also named amylomaltase because it catalyses the transfer of maltose from starch to glucose. A well known source of this enzyme is the potato, but a thermostable amylomaltase has also been isolated from Thermus thermophilus. Limited action of this enzyme on gelatinised starch leads to the progressive disappearance of amylose and the formation of amylopectin with a broader chain-length distribution. During this process the granular remnants dissolve completely and a low viscous molecular solution is obtained with a shift in iodine absorption maximum to lower wavelengths. Interestingly, these solutions form turbid rubber-like gels with a relatively high modulus on cooling at concentrations as low as 3%, which melt again on heating to c. 70oC. Amylomaltase-modified starch is a potential gelatin replacer in applications where gel transparency is not an issue. At higher conversions with this enzyme, cyclisation reactions on both linear and branched molecules occur, leading to relatively high molar mass starch products with a limited tendency to retrograde (Takaha et al., 1996, 1997).
A third situation arises when a different linkage type is formed during the transfer reaction. The action of starch branching enzyme (SBE) involves breaking of an -1,4-linkage and the concomitant formation of an -1,6-linkage. Thermostable branching enzymes have been isolated from a limited number of sources, e.g., Bacillus stearothermophilus.
The main effect is an overall reduction of amylopectin chain length, thereby reducing the propensity of starch to retrograde and increasing the solubility of starch in water. The fact that this action also results in the elimination of amylose and is not accompanied by the formation of maltose as a by-product makes SBE more useful than α-amylase. Involvement of a newly formed reducing end group into an α-1,6 linkage on the same molecule will also lead to the formation of cyclic molecules (Takata et al., 1996, 1997). (A5)

Kết quả (Việt) 1:

2. bột hạt làm giảm đi enzyme Tính chất tinh thể bán của tinh bột, một ungelatinised tinh bột hạt tiêu hóa chậm nhiều hơn của tinh bột hydrolysing enzyme hơn một hạt gelatinized hoặc một giải pháp tinh bột. Trong quá trình thủy phân một loạt các khác nhau morphologies có thể được quan sát thấy, mà phạm vi từ rỗ nhỏ lỗ, vỏ hình thành, và xói mòn bề mặt. Các chế độ của enzym suy thoái là phụ thuộc cả hai trên cácEnzym để điều trị ở nhiệt độ tiểu gelatinization dẫn tới xốp tinh bột. Tinh bột xốp thu hút rất nhiều sự chú ý cho sự hấp thụ của nó và bảo vệ các khả năng trong nhiều ứng dụng thực phẩm. Đặc trưng:• Α-amylase hoặc amyloglucosidase hành động trên tinh bột ngô được nghiên cứu• Dán và nhiệt thuộc tính của tinh bột xốp phụ thuộc vào men tiêu hóa được sử dụng• Xốp tinh bột là dễ bị enzyme tiêu hóa Bằng cách sử dụng enzym: nấm α-amylase (AM) hoặc amyloglucosidase (AMG)Α-Amylase có thể hydrolyze các trái phiếu α-glucosidic (1→4) của tinh bột trong một hành động endo. Thủy phân xảy ra một cách ngẫu nhiên tại bất kỳ (1→4)-các liên kết trong chuỗi tinh bột để nhanh chóng giảm kích thước phân tử của tinh bột và độ nhớt của các giải pháp tinh bột trong dán. Amyloglucosidase là một loại enzyme exo tác catalyzes thủy phân α-D-(1→4) và α - D-(1→6)-các liên kết từ phòng không giảm đầu của chuỗi tinh bột. Nhiều nhà nghiên cứu đã điều tra các enzym thủy phân tinh bột ngũ cốc, rễ, củ và đậu trong điều khoản của enzym hấp phụ, mô hình hành động, mức độ thủy phân, mức độ crystallinity và thủy phân các sản phẩm Hình. Hạt tinh bột khoai tây trước khi (trái) và sau khi suy thoái bởi amylase từ Paenibacillus granivorans (giữa) và Microbaterium aureum (bên phải). (A5)• Phương phápPhương pháp 1: Thử nghiệm sơ bộ được thực hiện để tối ưu hóa các phản ứng enzym (số lượng tinh bột và pH), và độ pH 4.0 được chọn để phản ứng AMG và pH 6.0 trong trường hợp sửa đổi AM. Số lượng của các enzym được dựa trên thử nghiệm trước đó, nơi số lượng các men tiêu hóa cần thiết để hydrolyze 50% của tinh bột (15%, w/v) tại 95ºC cho 10 phút đã được lựa chọn.Tinh bột (5.0 g) đã bị đình chỉ trong 25 mL 20mM NaH2PO4 đệm ở pH 6.0 hoặc trong natri axetat đệm ở pH 4.0, những mẫu tinh bột được gọi là kiểm soát-6 hoặc kiểm soát-4, tương ứng. Cho việc thu thập các tinh bột được điều trị enzym, enzyme (4 U AMG /g tinh bột) và 5 U AM /g tinh bột được thêm vào để đình chỉ tinh bột. Mẫu được giữ trong một bồn tắm nước lắc (50 rpm) tại 50 ºC cho 24 giờ. Sau đó, 50 mL nước được bổ sung và đình chỉ được homogenized. Mẫu đã ly cho 15 phút ở 7, 000 × g và 4 ºC. Tinh bột được rửa sạch một lần nữa và ly lúc các điều kiện tương tự như trước. Supernatants được gộp lại với nhau và luộc trong một nước tắm cho 10 phút để hủy kích hoạt các enzym trước khi bất kỳ phân tích thêm (hydrat hóa tài sản và iốt ràng buộc giá trị). Trầm tích chứa tinh bột đông khô và lưu giữ tại - 25ºC cho phân tích hơn nữa nhiệt, hóa sinh và microstructural. Bốn lô đã được chuẩn bị cho mỗi lần điều trị (A2)Phương pháp 2: Enzyme phân loại tinh bột đã đạt được bằng cách sử dụng enzym α-amylase (sứ tuyến tụy amylase). 40% tinh bột bùn đã được chuẩn bị bằng cách thêm 40gm của tinh bột đến 100ml nước cất, và men tiêu hóa (100µl) đã được bổ sung. Các mẫu đã được cho phép để đứng ở nhiệt độ phòng trong 6giờ. Các bình được sau đó giữ trong các vườn ươm tại 50oC cho 3h. Sau khi ủ bệnh, supernatant decanted và tinh bột được lọc và khô trong lò ở 500 C. (A31)3. tinh bột transferasesα 1,4-Glucanotransferases catalyse the cleavage of α-1,4 glucosidic bonds and the transfer of the newly formed reducing end group (donor) to a non-reducing saccharide unit (acceptor) with the formation of a new α -1,4 glucosidic bond. Donor and acceptor may originate from the same type of molecule or from different types of molecules. Several action patterns may be distinguished. Firstly, a single low molar mass maltooligosaccharide molecule may act both as donor and acceptor. In this case, cyclic saccharides are formed. Familiar examples are the cyclodextrins (CDs) with 6, 7, or 8 glucose units in the ring, which are formed by cyclodextrin glucosyltransferase. The net result of this type of activity is a decrease in the average molar mass. CDs are prepared by incubating a starch liquefact of DE < 10 with CGT-ase from Bacillus macerans (Riisgaard, 1990) or from thermostable microorganisms like Thermoanaerobacter species (Starnes, 1990). By addition of a complexing solvent, a crystalline inclusion complex is formed that can be separated from the mother liquor and refined by redissolution in water and recrystallisation. In a non-solvent process, the linear malto-oligosaccharides are degraded by amylolysis and cyclodextrin is recovered by partial evaporation and crystallisation. Like amylose, CDs have the ability to form crystalline complexes with a number of inclusion compounds. CDs have been widely explored as drug and flavour carriers (Szejtli, 1998). A novel development of randomly methylated α -CD is its use as an aid in emulsion polymerisation, e.g. in the surfactant-free production of polystyrene and polymethylmethacrylate latex particles in aqueous media (Storsberg et al., 2003). A different situation arises when the donor is transferred either to a different acceptor molecule or to a different side chain on the same molecule, e.g., in amylopectin. An interesting example is the so-called disproportioning enzyme or D-enzyme, also named amylomaltase because it catalyses the transfer of maltose from starch to glucose. A well known source of this enzyme is the potato, but a thermostable amylomaltase has also been isolated from Thermus thermophilus. Limited action of this enzyme on gelatinised starch leads to the progressive disappearance of amylose and the formation of amylopectin with a broader chain-length distribution. During this process the granular remnants dissolve completely and a low viscous molecular solution is obtained with a shift in iodine absorption maximum to lower wavelengths. Interestingly, these solutions form turbid rubber-like gels with a relatively high modulus on cooling at concentrations as low as 3%, which melt again on heating to c. 70oC. Amylomaltase-modified starch is a potential gelatin replacer in applications where gel transparency is not an issue. At higher conversions with this enzyme, cyclisation reactions on both linear and branched molecules occur, leading to relatively high molar mass starch products with a limited tendency to retrograde (Takaha et al., 1996, 1997). Một tình huống thứ ba phát sinh khi một loại khác nhau liên kết được hình thành trong phản ứng chuyển. Các hành động của tinh bột phân nhánh enzyme (SBE) liên quan đến việc phá vỡ của một - 1,4-liên kết và sự hình thành đồng thời của một - 1,6-liên kết. Các enzyme phân nhánh đã bị cô lập từ một số giới hạn của nguồn, ví dụ như, Bacillus stearothermophilus.Tác dụng chính là một giảm tổng thể của amylopectin chuỗi dài, do đó làm giảm xu hướng của tinh bột ngược và tăng độ hòa tan của tinh bột trong nước. Thực tế là hành động này cũng kết quả trong việc loại bỏ amyloza và không được đi kèm với sự hình thành của maltose là một sản phẩm làm cho SBE hữu dụng hơn so với α-amylase. Tham gia một nhóm mới được thành lập giảm kết thúc vào một liên kết α-1,6 trên cùng một phân tử cũng sẽ dẫn đến sự hình thành của các nhóm cyclic phân tử (Takata et al., 1996, 1997). (A5)

Kết quả (Việt) 2:

Enzyme phân hủy 2. Tinh bột hạt
chất bán tinh bột của, một hạt tinh bột ungelatinised được tiêu hóa chậm hơn rất nhiều bởi tinh bột thủy phân enzyme hơn một hạt hồ hóa tinh bột hoặc một giải pháp. Trong suốt quá trình thủy phân một loạt các hình thái khác nhau có thể được quan sát, trong khoảng từ rỗ lỗ nhỏ, tạo thành vỏ, và xói mòn bề mặt. Các chế độ của suy thoái enzyme phụ thuộc cả vào
điều trị enzyme ở nhiệt độ phụ hồ hóa dẫn đến tinh bột xốp. Tinh bột xốp đang thu hút rất nhiều sự chú ý cho sự hấp thụ của nó và khả năng ứng dụng trong nhiều thực phẩm che chắn.
Làm nổi bật:
• α-amylase hay hành động amyloglucosidase trên tinh bột ngô đã được nghiên cứu
• dán và tính chất nhiệt của tinh bột xốp phụ thuộc vào các loại men dùng
• Tinh bột xốp được nhiều hơn dễ bị enzyme tiêu hóa
dùng enzyme: nấm α-amylase (AM) hoặc amyloglucosidase (AMG)
α-Amylase có thể thủy phân các trái phiếu (1 → 4) α-glucosidic của tinh bột trong một endo-action. Thủy phân xảy ra trong một thời trang ngẫu nhiên tại bất kỳ (1 → 4) -linkage trong chuỗi tinh bột để giảm nhanh chóng các kích thước phân tử của tinh bột và độ nhớt của dung dịch tinh bột trong dán.
Amyloglucosidase là một enzyme exo-hành động xúc tác thủy phân của cả hai α-D- (1 → 4) và α-D- (1 → 6) -linkages từ đầu không giảm của chuỗi tinh bột. Nhiều nhà nghiên cứu đã điều tra thủy phân enzyme của tinh bột từ ngũ cốc, rễ, củ và các loại đậu về enzyme hấp phụ, mô hình hoạt động, mức độ thủy phân, mức độ tinh và các sản phẩm thủy phân hình. Hạt tinh bột khoai tây trước (trái) và sau khi suy thoái bởi amylase từ Paenibacillus granivorans (giữa) và Microbaterium aureum (bên phải). (A5) • Phương pháp Phương pháp 1: xét nghiệm sơ bộ đã được thực hiện để tối ưu hóa các phản ứng enzym (số lượng tinh bột và pH), và pH 4.0 được chọn để phản ứng AMG và pH 6.0 trong các trường hợp điều chỉnh AM. Lượng enzyme được dựa trên các thí nghiệm trước đó, nơi số lượng enzyme cần thiết để thủy phân 50% tinh bột (15%, w / v) ở 95ºC trong 10 phút đã được lựa chọn. Tinh bột (5,0 g) đã bị đình chỉ trong 25 mL 20mm NaH2PO4 đệm ở pH 6,0 hoặc sodium acetate đệm ở pH 4.0, những mẫu tinh bột được gọi là kiểm soát hoặc kiểm soát-6-4, tương ứng. Để có được các enzyme điều trị tinh bột, men (4 U của AMG / g tinh bột và 5 U AM / g tinh bột) đã được bổ sung vào hệ thống treo tinh bột. Các mẫu được lưu giữ trong một bồn tắm nước lắc (50 rpm) ở 50 ºC trong 24 giờ. Sau đó, 50 ml nước được thêm vào và hệ thống treo được đồng nhất. Mẫu được ly tâm 15 phút ở 7.000 × g và 4 ºC. Tinh bột đã được rửa sạch một lần nữa và ly tâm ở cùng điều kiện như trước. Supernatants được gộp chung lại với nhau và đun sôi trong một cốc nước trong 10 phút để làm bất hoạt các enzym trước khi phân tích thêm (tính hydrat hóa và các giá trị i-ốt ràng buộc). Trầm tích có chứa tinh bột đã được đông khô và giữ ở -25ºC để phân tích nhiệt, sinh hóa và microstructural thêm. Bốn lô đã được chuẩn bị cho mỗi lần điều trị (A2) Cách 2: Enzyme sửa đổi tinh bột đã đạt được bằng cách sử dụng enzyme α-amylase (Porcelain amylase tụy). 40% tinh bột bùn đã được chuẩn bị bằng cách thêm 40gm của tinh bột 100ml nước cất, và enzyme (100μl) đã được bổ sung. Các mẫu được phép đứng ở nhiệt độ phòng trong 6 h. Các bình này sau đó được lưu giữ trong các lồng ấp ở 50oC cho 3h. Sau khi ủ, nổi trên mặt được chiết và tinh bột đã được lọc và sấy khô trong lò nướng ở 500 C. (A31) 3. Transferases tinh bột α-1,4 Glucanotransferases xúc tác cho sự phân cắt của trái phiếu glucosidic α-1,4 và việc chuyển giao các nhóm giảm cuối mới được thành lập (nhà tài trợ) đối với người không giảm đơn vị saccharide (acceptor) với sự hình thành của một α mới - 1,4 glucosidic trái phiếu. Các nhà tài trợ, người chấp nhận có thể bắt nguồn từ cùng một loại phân tử hoặc từ các loại khác nhau của các phân tử. Một số mô hình hành động có thể được phân biệt. Thứ nhất, một mol phân tử maltooligosaccharide khối lượng thấp nhất có thể hoạt động vừa là nhà tài trợ và người chấp nhận. Trong trường hợp này, sacarit cyclic được hình thành. Ví dụ quen thuộc là cyclodextrins (CDs) với 6, 7, hoặc 8 đơn vị glucose trong vòng, mà được hình thành bởi cyclodextrin glucosyltransferase. Kết quả của loại hoạt động này là sự sụt giảm về khối lượng mol trung bình. CD được chuẩn bị bằng cách ủ một liquefact tinh bột của DE <10 với CGT-ase từ macerans Bacillus (Riisgaard, 1990) hoặc từ các vi sinh vật chịu nhiệt như loài Thermoanaerobacter (Starnes, 1990). Bằng cách bổ sung một dung môi phức, một phức hợp bao gồm tinh thể được hình thành có thể được tách ra từ rượu mẹ và tinh chế bằng redissolution trong nước và recrystallisation. Trong một quá trình không dung môi, các tuyến malto-oligosaccharides bị phân hủy bởi amylolysis và cyclodextrin được phục hồi bằng cách bay hơi một phần và kết tinh. Giống như amylose, đĩa CD có khả năng tạo ra các phức tinh với một số hợp chất thu nhận. CD đã được thăm dò rộng rãi như một chất mang thuốc và hương vị (Szejtli, 1998). Một phát triển mới của methyl hóa ngẫu nhiên α -CD là việc sử dụng nó như một trợ giúp trong nhũ tương polyme hóa, ví dụ như trong sản xuất surfactant miễn polystyrene và polymethylmethacrylate latex hạt trong dung dịch nước phương tiện truyền thông (Storsberg et al., 2003). Một tình huống khác nhau nảy sinh khi các nhà tài trợ được chuyển giao hoặc cho một phân tử chất nhận khác hoặc một chuỗi bên khác nhau trên phân tử tương tự, ví dụ như, trong amylopectin. Một ví dụ thú vị là cái gọi là disproportioning enzyme hoặc D-enzyme, cũng tên là amylomaltase vì nó xúc tác quá trình chuyển giao maltose từ tinh bột glucose. Một nguồn tin nổi tiếng của enzyme này là khoai tây, nhưng một amylomaltase thermostable cũng đã được phân lập từ Thermus thermophilus. Hành động hạn chế các enzyme này trên tinh bột gelatinised dẫn đến sự biến mất dần các amylose và sự hình thành của amylopectin với một chuỗi dài phân phối rộng lớn hơn. Trong quá trình này còn sót lại hạt hòa tan hoàn toàn và một giải pháp phân tử nhớt thấp là thu được với một sự thay đổi trong sự hấp thụ tối đa iodine với các bước sóng thấp hơn. Điều thú vị, những giải pháp tạo gel giống cao su đục với một mô đun tương đối cao về làm mát ở nồng độ thấp nhất là 3%, mà tan chảy một lần nữa vào sưởi ấm cho c. 70oC. Tinh bột Amylomaltase biến đổi là một thay thế gelatin tiềm năng trong các ứng dụng minh bạch gel không phải là một vấn đề. Tại chuyển đổi cao hơn với enzyme này, phản ứng cyclisation trên cả hai phân tử thẳng và phân nhánh xảy ra, dẫn đến sản phẩm tinh bột khối lượng phân tử tương đối cao với một xu hướng hạn chế để ngược dòng (Takaha et al., 1996, 1997). Một tình huống thứ ba phát sinh khi một liên kết khác loại được hình thành trong phản ứng chuyển nhượng. Các hành động của tinh bột enzyme phân nhánh (SBE) liên quan đến việc phá vỡ của một -1,4-liên kết và sự hình thành đồng thời với một -1,6-liên kết. Enzyme phân nhánh chịu nhiệt đã được phân lập từ một số hạn chế về nguồn, ví dụ như Bacillus stearothermophilus. Các tác dụng chính là giảm tổng chiều dài chuỗi amylopectin, do đó làm giảm xu hướng của tinh bột để ngược và tăng độ tan của tinh bột trong nước. Thực tế rằng hành động này cũng có kết quả trong việc loại bỏ các amylose và không đi kèm với sự hình thành của maltose như một sản phẩm phụ của làm SBE hữu ích hơn α-amylase. Sự tham gia của một nhóm giảm cuối mới được hình thành vào một α-1,6 liên kết trên các phân tử tương tự cũng sẽ dẫn đến sự hình thành các phân tử theo chu kỳ (Takata et al., 1996, 1997). (A5)