GBS Library PreparationGBS Workshop

GBS Library Preparation
GBS Workshop
May 12-15, 2015
Hanoi
Plant Resources Center – AVRDC The World Vegetables Center
Beating Begomovirus
GBS workshop (Hanoi, 12-15 May 2015)
Supporting Materials:
- GBS library preparation protocol
1. DNA extraction
- Extract DNA genomic using Qiagen DNeasy Plant Mini Kit, quantily samples
using Qubit dsDNA HS Assay Kit and quality samples using Nanophotometer
2. Prepare adapter
Resuspend adapter to 100 µM in TE pH 8
3. Annealing adapters
In Thermo cycle, incubate at 95oC in 2 minutes, and cool slow down at a rate not
greater than 3 oC per min (0.05oC/second) to 25 oC and hold in 30 minutes, hold in
4 oC
Dilute adapter to 5 µM and quantify adapter using Qubit dsDNA HS Assay Kit,
resuspend adapter to 180ng/200 µl ( 0,9 ng/µl)
4. Digest – ApeKI
- Prepare map of DNA and barcode adapter in plate 96 wells
- Add 20 µl DNA (100ng) plus 2 µl barcode adapter to each well
- Make a restriction master mix:
Common adapter 2 µl
10X Buffer NEB Buffer 3.1 3 µl
ApeKI 1 µl
Nuclease free water 2 µl
- Transfer 10 µl RE mix to each well (30 µl in total volume) and spin down
- Digest for 3h at 75 oC. Hold at 4 oC
Reaction can be stored at 4 oC overnight
5. Adapter ligation
- Prepare ligation master mix
10x Ligase Buffer 5 µl
T4 DNA ligase (NEB) 1.6 µl
Nuclease free water 13.4 µl
- Transfer 20µl ligation master mix to 20µl digestion
- Incubate at 22oC in 2h, then heat-kill at 65oC for 10 min
- Complete ligation can be stored at -20 oC
6. Pooling and cleanup
Take 5 µl from each sample and pool together
Clean pooled sample using Qiagen PCR cleanup kit
7. PCR amplification
- Prepare the following PCR reaction mix (8 reactions):
DNA (2µl) – this is adapter modified DNA Fragments
2x PCR master mix – NEB (25 µl)
PCR primer 1 and primer 2 (2 µl of 25 µM mixed primers)
Water (21 µl)
The total volume is 50µl
- Amplifying using the following PCR protocol:
a. 5 minutes at 72oC
b. 30 seconds at 98 oC
c. 18 cycles of:
10 seconds at 98 oC
30 seconds at 65 oC
30 seconds at 72 oC
d. 5 minutes at 72 oC
e. Hold at 4 oC
8. Library purification using Generead Size Selection Kit (Qiagen) on one column,
eluting in 30µl of EB
9. Validation GBS library
Quality GBS library using Qubit dsDNA HS Assay Kit and validate using agarose
gel 3%, acrylamide gel 6% and DNA analyzer
Supporting References:
1. Elshire, R.J.; Glaubitz, J.C.; Sun, Q.; Poland, J.A.; Kawamoto, K.; Buckler, E.S.;
Mitchell, S.E.A robust, simple genotyping-by-sequencing (GBS) approach for
high diversity species. PLoS One 2011, 6, 1–9.
2. Genotyping-By-Sequencing for Plant Genetic Diversity Analysis: A Lab Guide for
SNP Genotyping Gregory W. Peterson , Yibo Dong , Carolee Horbach and YongBi Fu, Diversity 2014, 6, 665-680

Kết quả (Việt) 1:

GBS thư viện chuẩn bịGBS hội thảoNgày 12-15 tháng năm 2015HanoiThực vật Trung tâm tài nguyên-AVRDC Trung tâm rau thế giớiĐập BegomovirusGBS hội thảo (Hà Nội, 12-15 tháng năm 2015)Hỗ trợ tài liệu:-Giao thức chuẩn bị thư viện GBS1. DNA khai thác-Giải nén DNA gen bằng cách sử dụng Qiagen DNeasy thực vật Mini Kit, Poncho mẫubằng cách sử dụng Qubit dsDNA HS khảo nghiệm Kit và chất lượng mẫu bằng cách sử dụng Nanophotometer2. chuẩn bị bộ điều hợpResuspend adapter để 100 μm tại TE vn 83. ủ bộ điều hợp mạngTrong chu kỳ nhiệt, ấp cho nở tại 95oC trong 2 phút, và chậm hạ nhiệt độ khônglớn hơn 3 oC cho mỗi phút (0.05oC / thứ hai) để 25 oC và giữ trong 30 phút, Giữ trong4 oCPha loãng adapter để 5 μm và định lượng các bộ điều hợp sử dụng Qubit dsDNA HS khảo nghiệm Kit,resuspend adapter để 180ng/200 ml (0,9 ng/ml)4. tiêu hóa-ApeKI-Chuẩn bị các bản đồ của bộ điều hợp DNA và mã vạch trong tấm 96 wells-Thêm 20 ml DNA (100ng) cộng với 2 ml mã vạch adapter để mỗi tốt-Làm cho một kết hợp tổng thể hạn chế:Phổ biến bộ điều hợp 2 ml10 x đệm NEB đệm 3.1 3 mlApeKI 1 mlNuclease nước miễn phí 2 ml-Chuyển 10 ml tái kết hợp để mỗi tốt (30 ml ở tổng khối lượng) và quay xuống-Digest cho 3h 75 đựơc Tổ chức tại 4 oCPhản ứng có thể được lưu trữ tại 4 oC qua đêm5. bộ chuyển đổi ligation-Chuẩn bị kết hợp chủ ligation10 x Ligase đệm 5 mlT4 DNA ligase (NEB) 1.6 mlNuclease miễn phí nước 13.4 ml-Chuyển 20µl ligation kết hợp tổng thể để tiêu hóa 20µl-Ấp cho nở tại 22oC trong 2h, sau đó nhiệt-giết tại 65oC trong 10 phút-Hoàn toàn ligation có thể được lưu trữ tại-20 oC6. tổng hợp và dọn dẹpCó 5 ml từ mỗi mẫu và hồ bơi với nhauSạch những mẫu bằng cách sử dụng Qiagen PCR dọn dẹp bộ7. PCR khuếch đại-Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng PCR sau (8 phản ứng):DNA (2µl)-đây là bộ chuyển đổi lần DNA mảnh2 x PCR chủ mix-NEB (25 ml)Đảng Cộng sản Romania mồi 1 và mồi 2 (2 ml của 25 μm hỗn hợp chất nền, mồi)Nước (21 ml)Tổng khối lượng là 50µl-Khuyếch đại bằng cách sử dụng giao thức Đảng Cộng sản Romania sau đây:a. 5 phút tại 72oCsinh 30 giây tại 98 oCc. 18 chu kỳ của:10 giây 98 oC30 giây tại 65 oC30 giây tại 72 oCmất 5 phút tại 72 oCe. tổ chức tại 4 oC8. thư viện làm sạch bằng cách sử dụng Generead kích thước lựa chọn Kit (Qiagen) trên một cột,eluting trong 30µl của EB9. xác nhận GBS thư việnChất lượng GBS thư viện bằng cách sử dụng Qubit dsDNA HS khảo nghiệm Kit và xác nhận bằng cách sử dụng agarosegel 3%, acrylamide gel 6% và phân tích ADNHỗ trợ tài liệu tham khảo:1. Elshire, đi; Glaubitz, JC; Sun, Q.; Ba Lan, Ja; Sharingan, K.; Buckler, E.S.;Mitchell, cách tiếp cận mạnh mẽ, đơn giản gen-của-trình tự (GBS) S.E.A chocao đa dạng loài. PLoS một 2011, 6, 1-9.2. gen-của-trình tự cho thực vật đa dạng di truyền phân tích: một phòng thí nghiệm hướng dẫn choSNP gen Gregory W. Peterson, Yibo Dong, Carolee Horbach và YongBi Fu, sự đa dạng 2014, 6, 665-680

Kết quả (Việt) 2:

GBS Library Chuẩn bị
GBS Hội thảo
ngày 12-ngày 15 tháng 5, 2015
Hà Nội
Trung tâm Tài nguyên thực vật - Trung tâm Rau AVRDC Thế giới
Đập Begomovirus
hội thảo GBS (Hà Nội, 12-15 tháng 5 năm 2015)
Vật liệu hỗ trợ:
- thư viện GBS chuẩn bị giao thức
1. Chiết DNA
- Giải nén bộ gen DNA sử dụng Qiagen DNeasy Plant Mini Kit, mẫu quantily
sử dụng qubit dsDNA HS Assay Kit và mẫu chất lượng sử dụng Nanophotometer
2. Chuẩn bị tiếp hợp
bộ chuyển đổi Resuspend đến 100 mM trong TE pH 8
3. Ủ adapter
Trong Thermo chu kỳ, ủ ở 95oC trong 2 phút, và làm mát chậm ở mức không
lớn hơn 3 oC per min (0.05oC / giây) đến 25 oC và giữ trong 30 phút, giữ ở
4 oC
Pha loãng adapter để 5 mM và định lượng các bộ chuyển đổi sử dụng qubit dsDNA HS Assay Kit,
resuspend adapter để 180ng / 200 ml (0,9 ng / ml)
4. Digest - ApeKI
- Chuẩn bị bản đồ của DNA và mã vạch adapter ở tấm 96 giếng
- Thêm 20 ml DNA (100ng) cộng với 2 ml bộ chuyển đổi mã vạch vào từng giếng
- Thực hiện một hỗn hợp hạn chế chủ:
bộ chuyển đổi Common 2 ml
10X Buffer NEB Buffer 3.1 3 ml
ApeKI 1 ml
nước tự do nuclease 2 ml
- Chuyển 10 ml RE hỗn hợp vào từng giếng (30 ml trong tổng khối lượng) và quay xuống
- Digest cho 3h ở 75 oC. Giữ ở 4 oC
phản ứng có thể được bảo quản ở 4 oC qua đêm
5. Adapter thắt
- Chuẩn bị thắt tổng hợp
10x ligase Buffer 5 ml
DNA T4 ligase (NEB) 1,6 ml
nuclease miễn phí nước 13,4 ml
- Chuyển 20μl mix thắt master để 20μl tiêu hóa
- Ủ ở 22oC trong 2h, sau đó nhiệt giết ở 65oC trong 10 phút
- Toàn bộ thắt có thể được lưu trữ ở -20 oC
6. Pooling và dọn dẹp
Take 5 ml từ mỗi mẫu và hồ bơi cùng
sạch mẫu gộp sử dụng Qiagen PCR dọn dẹp bộ
7. Khuếch đại PCR
- Chuẩn bị các phản ứng PCR mix sau (8 phản ứng):
DNA (2μl) - đây là bộ chuyển đổi biến đổi DNA Fragments
2x PCR tổng hợp - NEB (25 ml)
mồi PCR 1 và 2 lớp sơn lót (2 ml 25 mM mồi hỗn hợp)
nước (21 ml)
Tổng khối lượng là 50μl
- khuếch đại bằng cách sử dụng giao thức PCR sau đây:
a. 5 phút ở 72oC
b. 30 giây ở 98 oC
c. 18 chu kỳ:
10 giây ở 98 oC
30 giây ở 65 oC
trong 30 giây ở 72 oC
d. 5 phút ở 72 oC
e. Giữ ở 4 oC
8. Thanh lọc Thư viện sử dụng Generead Kích Selection Kit (Qiagen) trên một cột,
tẩy rửa trong 30μl của EB
9. Validation thư viện GBS
Chất lượng GBS thư viện sử dụng qubit dsDNA HS Assay Kit và xác nhận bằng cách sử dụng agarose
gel 3%, gel acrylamide 6% và phân tích DNA
Hỗ trợ Tài liệu tham khảo:
1. Elshire, RJ; Glaubitz, JC; Sun, Q .; Ba Lan, JA; Kawamoto, K .; Buckler, ES;
Mitchell, SEA mạnh mẽ, (GBS) cách tiếp cận đơn giản kiểu gen-by-sequencing cho
đa dạng loài cao. PLoS One 2011, 6, 1-9.
2. Kiểu gen-By-Sequencing cho Plant Genetic Diversity Phân tích: A Guide Lab cho
SNP định kiểu gen Gregory W. Peterson, Yibo Đồng, Carolee Horbach và YongBi Fu, đa dạng 2014, 6, 665-680