most of the remaining JAK2 V617F–ne

most of the remaining JAK2 V617F–negative PV cases.8-11 MPL exon 10 mutations occur in 5% to 10% of patients with JAK2-negative ET or PMF but not in patients with PV.12-15 Although MPL exon 10 mutations partially filled the molecular diagnostic gap in JAK2-negative ET or PMF, the underlying molecular etiology remains to be discovered in 30% to 45% of patients with ET and PMF who do not have mutated JAK2 or MPL. Two groups recently reported CALR mutations in JAK2/ MPL-negative PMF or ET.16,17 CALR encoding calreticulin is an endoplasmic reticulum calcium-binding chaperone with multiple functions in physiologic and pathologic processes.18 The mutational frequencies of CALR were 49% to 74% in JAK2/MPL-negative ET and PMF.16,17,19,20 In this study, JAK2 V617F, JAK2 exon 12, MPL exon 10, and CALR exon 9 mutations were screened in cohorts of Chinese patients with BCR-ABL1–negative MPN. The aim is to evaluate their mutational frequency and the value of combined tests in the diagnosis of BCR-ABL1–negative MPN.
Materials and Methods
Patients and Samples We enrolled 929 patients with BCR-ABL1–negative MPN at Blood Diseases Hospital from January 2011 through December 2013, including 234 cases of PV, 428 ETs, 187 PMFs, and 80 MPN-Us. The diagnosis was established according to the 2008 WHO criteria. Relevant clinical information was obtained by retrospectively reviewing case history ❚Table 1❚, and all bone marrow slides were reviewed by two hematopathologists (E.L. and Q.S.). Genomic DNA was extracted from bone marrow mononuclear cells by using the QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany).
Allele-Specific Polymerase Chain Reaction Allele-specific polymerase chain reaction (PCR) was used to detect the JAK2 V617F mutation. The reaction
contained 25 ng DNA template, 12.5 μL 2× Taq PCR Master Mix (TIANGEN, Beijing, China), 1 μL (10 μmol/L) common reverse primer, 0.5 μL (10 μmol/L) each of forward primers, and water to a final reaction volume of 25 μL. The PCR was performed as follows: 95°C for 3 minutes; 35 cycles each of 95°C for 30 seconds, 58°C for 30 seconds, and 72°C for 45 seconds; and 72°C for 10 minutes. The mutant allele had two bands at 364 base pairs (bp) and 203 bp, while the wild-type allele exhibited only one band at 364 bp. Primers were as follows: forward wild-type–specific primer, 5′-AGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT-3′; forward mutant-specific primer, 5′-ATCTATA GTCATGCTGAAAGTAGGAGAAAG-3′; and common reverse primer, 5′-CTGAATAGTCCTACAGT GTTTTCAGTTTCA-3′.
Sanger Sequencing Sanger sequencing was performed to screen for JAK2 exon 12, MPL exon 10, and CALR exon 9 mutations. The genomic regions of interest were amplified by PCR. The PCR products were purified, and a sequencing reaction was set up using the BigDye Terminator v3.1, Cycle Sequencing Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA). The sequencing reaction was performed as follows: 96°C for 1 minute and 25 cycles each of 96°C for 10 seconds, 50°C for 15 seconds, and 60°C for 2 minutes. Sequencing products were analyzed using the 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). The novel mutations were verified by forward and reverse sequencing. Primers were as follows: CALR exon 9: forward, 5′- ACAACTTCCTCATCACC AACG-3′; CALR exon 9: reverse, 5′-GGCCTCAGTCCAGCCCTG-3′; MPL exon 10: forward, 5′-TAGGGGCTGGCTGGATGAG-3′; MPL exon 10: reverse, 5′-CTTCGG CTCCACCTGGTCC-3′; JAK2 exon 12: forward, 5′-TCATTTTACTCCTCTTTGGAGCA-3′; and JAK2 exon 12: reverse, 5′-TAA CATCTAACACAAGGTTGGCA-3′.
Statistical Analysis The age was compared by t test. All P values were considered statistically significant when less than .05. Statistical analyses were performed using SPSS Version 15.0 (SPSS, Chicago, IL).

Kết quả (Việt) 1:

Hầu hết số còn lại JAK2 V617F-tiêu cực PV cases.8-11 MPL exon 10 đột biến xảy ra ở 5% đến 10% của bệnh nhân với JAK2 âm ET hoặc PMF nhưng không phải ở những bệnh nhân với PV.12-15 mặc dù MPL exon 10 đột biến một phần đầy khoảng cách chẩn đoán phân tử trong âm JAK2 ET hoặc PMF, các nguyên nhân cơ bản của phân tử còn lại để được phát hiện trong 30% đến 45% bệnh nhân với ET và PMF người không có đột biến JAK2 hoặc MPL. Hai nhóm mới báo cáo CALR đột biến trong JAK2 / MPL âm PMF hoặc ET.16,17 CALR calreticulin mã hóa là một mạng lưới canxi-ràng buộc đi kèm với nhiều chức năng trong processes.18 physiologic và bệnh lý tần số mutational của CALR là 49% đến 74% trong MPL-JAK2 tiêu cực ET và PMF.16,17,19,20 trong nghiên cứu này, JAK2 V617F, JAK2 exon 12, MPL exon 10 và CALR exon 9 đột biến đã được kiểm tra trong cohorts của các bệnh nhân Trung Quốc với ABL1-BCR tiêu cực MPN. Mục đích là đánh giá tần số mutational của họ và giá trị của các xét nghiệm kết hợp trong chẩn đoán của ABL1-BCR tiêu cực MPN.Vật liệu và phương phápBệnh nhân và mẫu chúng tôi ghi danh 929 bệnh nhân với ABL1-BCR tiêu cực MPN tại bệnh viện bệnh máu từ tháng 1 năm 2011 thông qua tháng năm 2013, bao gồm cả các trường hợp 234 PV, 428 ETs, 187 PMFs, và 80 MPN-chúng tôi. Việc chẩn đoán được thành lập theo năm 2008 các tiêu chí WHO. Thông tin lâm sàng liên quan được thu được bằng cách trang xem xét lịch sử vụ án ❚Table 1❚, và tất cả tủy xương trang trình bày đã được xem xét bởi hai hematopathologists (E.L. và Q.S.). Gen DNA được chiết xuất từ tủy xương mononuclear tế bào bằng cách sử dụng các QIAamp DNA máu Mini Kit (Qiagen, Hilden, Đức).Phản ứng chuỗi trùng hợp dành riêng cho Allele phản ứng chuỗi trùng hợp dành riêng cho allele (PCR) được sử dụng để phát hiện sự đột biến của JAK2 V617F. Phản ứng có 25 ng DNA mẫu, 12,5 μL 2 × Taq PCR Master Mix (TIANGEN, Bắc Kinh, Trung Quốc), 1 μL (10 μmol/L) chung đảo ngược mồi, cách 0.5 μL (10 μmol/L) mỗi của lớp lót phía trước, và nước với một khối lượng phản ứng ngoài của 25 μL. Đảng Cộng sản Romania được thực hiện như sau: 95° C trong 3 phút; 35 chu kỳ mỗi 95° C trong 30 giây, 58° C trong 30 giây và 72° C trong 45 giây; và 72° C trong 10 phút. Allele đột biến có hai ban nhạc tại 364 cặp cơ sở (bp) và 203 bp, trong khi loại hoang allele trưng bày các ban nhạc chỉ có một lúc 364 bp. chất nền, mồi như sau: chuyển tiếp loại-tự nhiên cụ thể mồi, 5 '-AGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT-3 '; chuyển tiếp cụ thể đột biến mồi, 5 '-ATCTATA GTCATGCTGAAAGTAGGAGAAAG-3 '; và phổ biến mồi đảo ngược, 5 '-CTGAATAGTCCTACAGT GTTTTCAGTTTCA-3 '.Sanger trình tự Sanger trình tự đã được thực hiện để hộ tống cho JAK2 exon 12, MPL exon 10, và CALR exon 9 đột biến. Các khu vực gen quan tâm đã được khuếch đại bởi PCR. Các sản phẩm Đảng Cộng sản Romania đã là purified, và một phản ứng trình tự đã được thiết lập bằng cách sử dụng BigDye Terminator v3.1, chu trình tự Kit (công nghệ cuộc sống, Carlsbad, CA). Phản ứng trình tự được thực hiện như sau: 96° C cho 1 phút và 25 chu kỳ mỗi 96° C trong 10 giây, 50° C trong 15 giây và 60° C trong 2 phút. Trình tự sản phẩm được phân tích bằng cách sử dụng phân tích di truyền 3130xl (áp dụng Biosystems, Carlsbad, CA). Tiểu thuyết đột biến đã được xác nhận qua chuyển tiếp và đảo ngược trình tự. Chất nền, mồi như sau: CALR exon 9: phía trước, 5 '-ACAACTTCCTCATCACC AACG-3 '; CALR exon 9: đảo ngược, 5 '-GGCCTCAGTCCAGCCCTG-3 '; MPL exon 10: phía trước, 5 '-TAGGGGCTGGCTGGATGAG-3 '; MPL exon 10: ngược lại, 5 '-CTTCGG CTCCACCTGGTCC-3 '; JAK2 exon 12: phía trước, 5 '-TCATTTTACTCCTCTTTGGAGCA-3 '; và JAK2 exon 12: đảo ngược, 5 '-TAA CATCTAACACAAGGTTGGCA-3 '.Thống kê phân tích tuổi được so sánh bằng cách thử nghiệm t. Tất cả các giá trị P được coi là ý nghĩa thống kê quan trọng khi ít hơn.05. Phân tích thống kê đã được thực hiện bằng cách sử dụng SPSS Phiên bản 15.0 (SPSS, Chicago, IL).

Kết quả (Việt) 2:

hầu hết các JAK2 V617F âm PV cases.8-11 MPL exon còn lại 10 đột biến xảy ra ở 5% đến 10% bệnh nhân với JAK2 âm ET hoặc PMF nhưng không phải ở những bệnh nhân với PV.12-15 Mặc dù MPL exon 10 đột biến một phần lấp đầy khoảng cách chẩn đoán phân tử trong JAK2 âm ET hoặc PMF, nguyên nhân phân tử cơ bản vẫn còn được phát hiện trong 30% đến 45% bệnh nhân với ET và PMF người không bị đột biến JAK2 hoặc MPL. Hai nhóm gần đây đã báo cáo đột biến CALR trong JAK2 PMF / MPL âm hoặc ET.16,17 CALR mã hóa calreticulin là một lưới Canxi-ràng buộc đi kèm nội chất với nhiều chức năng trong processes.18 sinh lý và bệnh lý Các tần số đột biến của CALR là 49% đến 74 % trong JAK2 / MPL âm ET và PMF.16,17,19,20 Trong nghiên cứu này, JAK2 V617F, JAK2 exon 12, MPL exon 10, và CALR exon 9 đột biến đã được sàng lọc trong đội quân của bệnh nhân Trung Quốc với BCR-ABL1- MPN tiêu cực. Mục đích là để đánh giá tần số đột biến duy nhất của họ và giá trị của xét nghiệm kết hợp trong chẩn đoán BCR-ABL1 âm MPN.
Vật liệu và phương pháp
Bệnh nhân và mẫu Chúng tôi ghi danh 929 bệnh nhân với BCR-ABL1 âm MPN tại Bệnh máu Bệnh viện từ tháng 1 năm 2011 thông qua Tháng 12 năm 2013, trong đó có 234 trường hợp của PV, 428 ETS, 187 PMFs, và 80 MPN-Us. Việc chẩn đoán bệnh được thành lập theo tiêu chuẩn của WHO năm 2008. Thông tin lâm sàng có liên quan đã thu được bằng cách truy xét lịch sử trường hợp ❚Table 1❚, và tất cả các slide tủy xương đã được xem xét lại bởi hai hematopathologists (EL và QS). Gen DNA được chiết xuất từ các tế bào tủy xương đơn nhân bằng cách sử dụng các Kit QIAamp DNA Blood Mini (Qiagen, Hilden, Đức).
Allele-cụ thể Polymerase Chain Reaction Allele cụ thể phản ứng chuỗi polymerase (PCR) đã được sử dụng để phát hiện các đột biến V617F JAK2. Các phản ứng
chứa 25 ng mẫu DNA, 12,5 ml 2 × Taq PCR Master Mix (TIANGEN, Bắc Kinh, Trung Quốc), 1 ml (10 mmol / L) mồi ngược phổ biến, 0,5 ml (10 mmol / L) mỗi mồi về phía trước, và nước vào một thể tích phản ứng fi nal 25 ml. Phản ứng PCR được thực hiện như sau: 95 ° C trong 3 phút; 35 chu kỳ mỗi 95 ° C trong 30 giây, 58 ° C trong 30 giây, và 72 ° C trong 45 giây; và 72 ° C trong 10 phút. Các alen đột biến có hai băng tần 364 cặp base (bp) và 203 bp, trong khi hoang dại alen trưng bày chỉ có một ban nhạc tại 364 bp. Chất mồi như sau: hoang dại cụ thể mồi xuôi, 5'-AGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT-3 '; mồi đột biến cụ thể về phía trước, 5'-ATCTATA GTCATGCTGAAAGTAGGAGAAAG-3 '; và mồi ngược phổ biến, 5'-CTGAATAGTCCTACAGT GTTTTCAGTTTCA-3 '.
Sanger Sequencing Sanger trình tự đã được thực hiện để màn hình cho JAK2 exon 12, MPL exon 10, và CALR exon 9 đột biến. Các vùng gen quan tâm được khuếch đại bằng PCR. Các sản phẩm PCR là puri fi ed, và một phản ứng giải trình tự đã được thiết lập bằng cách sử dụng v3.1 BigDye Terminator cycle, Cycle Sequencing Kit (Technologies Life, Carlsbad, CA). Phản ứng giải trình tự đã được thực hiện như sau: 96 ° C trong 1 phút và 25 chu kỳ mỗi 96 ° C trong 10 giây, 50 ° C trong 15 giây, và 60 ° C trong 2 phút. Sản phẩm giải trình tự được phân tích bằng cách sử dụng di truyền Analyzer 3130xl (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). Những đột biến cuốn tiểu thuyết đã được xác nhận bởi phía trước và trình tự đảo ngược. Chất mồi như sau: CALR exon 9: phía trước, 5'- ACAACTTCCTCATCACC AACG-3 '; CALR exon 9: đảo ngược, 5'-GGCCTCAGTCCAGCCCTG-3 '; MPL exon 10: về phía trước, 5'-TAGGGGCTGGCTGGATGAG-3 '; MPL exon 10: đảo ngược, 5'-CTTCGG CTCCACCTGGTCC-3 '; JAK2 exon 12: về phía trước, 5'-TCATTTTACTCCTCTTTGGAGCA-3 '; và JAK2 exon 12: đảo ngược, 5'-TAA CATCTAACACAAGGTTGGCA-3 '.
Phân tích thống kê Các tuổi được so sánh bởi t test. Tất cả các giá trị P được xem là ý nghĩa thống kê khi ít hơn 0,05. Phân tích thống kê được thực hiện bằng cách sử dụng SPSS phiên bản 15.0 (SPSS, Chicago, IL).