Plasmid minipreparationswere accord

Plasmid minipreparations
were according to Birnboim and Doly (1979). The libraries were
screened for copy number by probing total DNA onto Southern
blots of the probes. A wheat rDNA unit repeat clone (Gerlach
and Bedbrook 1979) and pea Adh clone (Llewellyn et al. 1987)
were used as intensity controls. The probes were classified into
two categories based on the relative intensity of the detected
signal. Clones were named pMaCIR#. Numbers greater than
1000 corresponded to the EcoRI library probes. Insert size was
determined relative to a Raoul (Appligene) molecular weight
marker using a computer-driven autoradiograph digitizer
(Hoisington and Gonzfilez de Ledn, in preparation).
For Southern and PCR analyses, total DNA was extracted
according to Dellaporta et al. (1983), with modifications by
Cordesse et al. (1990). The DNAs of nine banana clones (SF265,
Banksii, and seven individuals representative of M. acuminata
diversity) cut with one of ten restriction enzymes, were surveyed
for restriction polymorphism using 13 genomic probes (data not
shown). EcoRV and DraI were selected for the mapping work.
Digestions were performed according to supplier's recommendations
(BRL), but with 2.5 units/gg DNA of restriction enzyme.
Restricted DNA (10gg/lane) was separated in 0.8~-TAE
agarose gels at 1.04 V/cm for 9 h. The gels were depurinated in
0.25 N HC1 for 10 min, denatured in 0.4 N NaOH for 30 min, and
then blotted onto Hybond N + membranes (Amersham).
Probes were labeled with a2p-c~dCTP using the random
primer labelling method of Feinberg and Vogelstein (1983).
Incorporation of radioactive nucleotides was checked by
chromatography on PEI-cellulose F. Prehybridization, hybridization
and washes were performed in a hybridization oven
(Applig6ne). One or two membranes were placed in a glass tube
and the following buffer was added: 6 x SSPE, 0.5~SDS,
5 x Denhart, and 25 gg/ml of sheared herring sperm DNA. For
hybridization, this buffer was supplemented with dextran sulphate
to a final concentration of 8~o (w/v). Membranes were
washed at 68 ~ for 30 min in each of the following buffers:
2 x SSPE, 2 x SSPE-0.1~'SDS, 0.1 x SSPE-0.1 SDS. They were
then exposed to X-ray film (Kodak X-OMAT) at -80 ~ for 4
days with one intensifying screen. Blots were stripped in 1~o SDS
at 68 ~ for 30min and could be re-used up to 12 times.

Kết quả (Việt) 1:

Plasmid minipreparationsđã theo Birnboim và Doly (1979). Các thư việnchiếu cho bản sao số của thăm dò tất cả DNA lên miền NamBlots của các đầu dò. Lặp lại một đơn vị lúa mì rDNA clone (Gerlachvà Bedbrook năm 1979) và hạt đậu Adh clone (Llewellyn et al. 1987)được sử dụng như điều khiển cường độ. Các thăm dò đã được phân loại thànhhai loại dựa trên cường độ tương đối của các phát hiệntín hiệu. Nhái đã được đặt tên là pMaCIR #. Con số lớn hơn1000 tương ứng với EcoRI thư viện thăm dò. Chèn thướcxác định tương ứng với một trọng lượng phân tử Raoul (Appligene)đánh dấu bằng cách sử dụng một máy tính điều khiển autoradiograph digitizerHoisington và Gonzfilez de Ledn, để chuẩn bị.Đối với Nam và các phân tích PCR tất cả DNA được chiết xuấttheo để Dellaporta et al. (1983), với các sửa đổi bởiCordesse et al. (1990). DNAs chín chuối nhái (SF265,Banksii, và bảy cá nhân đại diện của M. acuminatasự đa dạng) cắt với một trong số mười enzyme giới hạn, đã được khảo sátđể hạn chế đa hình bằng cách sử dụng 13 gen đầu dò (dữ liệu khôngHiển thị). EcoRV và DraI đã được chọn cho công việc lập bản đồ.Digestions đã được thực hiện theo khuyến cáo của nhà cung cấp(BRL), nhưng với 2.5 đơn vị/gg DNA của hạn chế enzyme.Hạn chế DNA (10gg/lane) được tách ra trong 0,8 ~-TAEgel agarose tại 1,04 V/cm cho 9 h. Các gel là depurinated trong0,25 N HC1 cho 10 phút, denatured trong cách 0.4 N NaOH trong 30 phút, vàsau đó, blotted lên Hybond N + màng (Amersham).Đầu dò được gắn nhãn với a2p-c ~ dCTP bằng cách sử dụng các ngẫu nhiênmồi nhãn mác các phương pháp của Feinberg và Vogelstein (1983).Kết hợp phóng xạ nucleotide đã được kiểm tra bởisắc kí trên PEI-cellulose F. Prehybridization, lai ghépvà rửa được thực hiện trong lò lai ghép(Applig6ne). Một hoặc hai màng được đặt trong một ống kínhvà các vùng đệm được thêm vào: 6 x SSPE, 0,5 ~ SDS,5 x Denhart, và 25 gg/ml sheared cá trích tinh trùng DNA. Cholai ghép, bộ đệm này được bổ sung với dextran sulphatemột tập trung cuối cùng của 8 ~ o (w/v). Màngrửa sạch tại 68 ~ trong 30 phút trong mỗi bộ đệm sau đây:2 x SSPE, 2 x SSPE-0.1 ~'SDS, 0,1 x SSPE-0.1 SDS. Họ đãsau đó tiếp xúc với phim x-quang (Kodak X-OMAT) -80 ~ 4ngày với tăng cường một màn hình. Blots đã bị tước trong 1 ~ o SDStại 68 ~ trong 30 phút và có thể được tái sử dụng lên đến 12 lần.

Kết quả (Việt) 2:

Minipreparations plasmid
là theo Birnboim và Doly (1979). Các thư viện đã được
chiếu cho số lượng bản sao bằng cách thăm dò DNA tổng số lên miền Nam
blots của đầu dò. Một rDNA mì đơn vị lặp lại clone (Gerlach
và Bedbrook 1979) và hạt đậu ADH clone (Llewellyn et al. 1987)
đã được sử dụng như điều khiển cường độ. Các đầu dò được phân thành
hai loại dựa vào cường độ tương đối của các phát hiện
tín hiệu. Dòng vô tính đã được đặt tên pMaCIR #. Số lớn hơn
1000 tương ứng với các thiết bị thăm dò thư viện EcoRI. Chèn kích thước được
xác định tương đối với một Raoul (Appligene) trọng lượng phân tử
đánh dấu bằng một số hóa autoradiograph máy tính điều khiển
(Hoisington và Gonzfilez de Ledn, để chuẩn bị).
Đối với miền Nam và PCR phân tích, tổng DNA được chiết xuất
theo Dellaporta et al. (1983), với sửa đổi bởi
Cordesse et al. (1990). Các DNA trong chín nhái chuối (SF265,
Banksii, và bảy cá nhân đại diện của M. acuminata
đa dạng) cắt bằng một trong mười enzim giới hạn, đã được khảo sát
để hạn chế tính đa hình sử dụng 13 đầu dò gen (dữ liệu không
hiển thị). EcoRV và Drai đã được lựa chọn cho công việc lập bản đồ.
Phá mẫu được thực hiện theo khuyến cáo của nhà cung cấp
(BRL), nhưng với 2,5 đơn vị / DNA gg của enzyme giới hạn.
Restricted DNA (10gg / làn) được tách ra trong 0,8 ~ -TAE
gel agarose tại 1.04 V / cm cho 9 h. Các gel được depurinated trong
0,25 N HC1 trong 10 phút, biến tính trong 0,4 N NaOH trong 30 phút, và
sau đó xoá nhoà vào Hybond N + màng (Amersham).
Đầu dò được dán nhãn A2P-c ~ dCTP sử dụng ngẫu nhiên
phương pháp ghi nhãn mồi của Feinberg và Vogelstein (1983).
Kết hợp nucleotide phóng xạ được kiểm tra bằng
phương pháp sắc ký trên PEI-cellulose F. Prehybridization, lai tạo
và rửa được thực hiện trong một lò lai
(Applig6ne). Một hoặc hai màng được đặt trong một ống thủy tinh
và các bộ đệm sau đây đã được thêm vào: 6 x SSPE, 0,5 ~ SDS,
5 x Denhart, và 25 gg / ml DNA cá trích tinh trùng xén lông. Đối
lai, đệm này được bổ sung thêm sulphate dextran
đến nồng độ cuối cùng của 8 ~ o (w / v). Màng được
rửa sạch tại 68 ~ 30 phút trong mỗi bộ đệm sau:
2 x SSPE, 2 x SSPE-0,1 ~ 'SDS, 0,1 x SSPE-0.1 SDS. Họ đã được
sau đó tiếp xúc với phim X-ray (Kodak X-OMAT) tại -80 ~ 4
ngày với một màn hình tăng cường. Blots bị tước đoạt trong 1 ~ o SDS
68 ~ 30 phút cho và có thể được tái sử dụng lên đến 12 lần.